结核分枝杆菌PPE59蛋白的表达、纯化和生物信息学分析

目的：构建结核分枝杆菌pET28a-PPE59原核表达载体，异丙基-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达和纯化获得PPE59蛋白；同时对PPE59蛋白进行生物信息学分析，预测其可能结构和功能。方法：以H37Rv基因组为模板扩增获得PPE59基因，利用同源重组将其克隆至原核表达载体pET28a,后转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，采用Ni⁺-NTA亲和层析柱对PPE59蛋白进行纯化，获得重组PPE59蛋白并进行鉴定。使用Protparam、NetPhos 3.1 Servera、ABCpred、SYEPEITHI等软件对PPE59蛋白的理化性质、磷酸化位点和T、B细胞表位等进行预测和分析。结果：成功构建pET28a-PPE59重组载体，经诱导表达和纯化，成功获得PPE59蛋白；生物信息学预测发现，PPE59有2个开放阅读框，31个磷酸化位点，并含有多个T细胞和B细胞抗原表位。结论：成功构建pET28a-PPE59表达载体，获得高纯度PPE59蛋白，且被抗His-tag小鼠单抗特异性识别；PPE59具有大量的磷酸化位点及丰富的T、B细胞表位，...     

结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因原核表达载体并进行表达。方法：PCR扩增MTbeast6基因，克隆入pQE30质粒，测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建PQE30—ESAT6和PET32a( )—ESAT6重组体。结果：重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—ESAT6未表达目的蛋白，而PET32α( )—ESAT6表达出19kDA左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的42％，用Westermblotting证实其有良好的抗原性；经过Ni—NTA柱纯化，获得纯度为92％的重组蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET32a( )—ESAT6，并获得重组ESAT6蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定基础。     

结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的：建立结核分枝杆菌PPE68蛋白基因重组质粒的真核表达载体,为以后对PPE重组蛋白的免疫原性分析奠定基础。方法：提取结核分枝杆菌总DNA,PCR法扩增出PPE68编码基因,通过线性T克隆载体pGEM—T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）后,转染至I-IeLa细胞中表达,Westernblot鉴定表达产物。结果：PCR产物、pGEM-T—PPE68及pcDNA3．1（＋）一PPE68分别经双酶切后均获得同一大小基因片段,表达产物经Westernblot鉴定相对分子质量约为40000。结论：成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体,并获得了表达产物。     

结核分枝杆菌1hp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)1hp—esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法：用Gene SOEing法，将1hp基因和esat6基因体外重组，构建融合基因，克隆入pQE30质粒中进行表达。结果：构建的融合基因经测序证实完全正确，重组体转化表达菌DH5α后，经过IPTG诱导，表达出26kDa左右的CFP10-ESAT6融合蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的40％，Western blotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni—NTA柱纯化后，获得了纯度为98%的重组蛋白。结论：成功构建MTb 1hp—esat6融合基因，成功构建原核表达载体pQE30-CFP10-ESAT6，并获得重组CFP10-ESAT6融合蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3432c蛋白的原核表达与生物信息学分析

目的 构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Rv3432c基因的原核表达质粒并进行体外表达,运用生物学信息学软件分析蛋白Rv3432c特征,探讨抗M.tb新型药物靶点。方法 以灭活的结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增Rv3432c基因,并与表达载体pET-28a构建原核表达重组质粒。SDS-PAGE分析表达产物并利用亲和层析的方法进行纯化。采用Protparam、Pfam online tool、SOMPA、Protscale、TMHMM、Signalp 6.0、NetPhos3.1、SUMOsp 2.0、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析蛋白Rv3432c的生物学特性。结果 pET-28a-Rv3432c重组质粒测序结果与目的基因完全一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以可溶性蛋白形式存在,相对分子质量约为55×10³,与预期大小相符。蛋白Rv3432c为亲水性蛋白(GRAVY值为-0.079)。蛋白Rv3432c为无跨膜结构域和信号肽的蛋白。Rv3432c二级结构主要由无规则卷...     

结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6，Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6，Ag85B和MPT64基因(288bp，978bp and 687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coli Dh5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与献报道一致，证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了ESAT6，Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。     

PPE25蛋白在分枝杆菌感染中性粒细胞中的作用

目的 研究PPE25蛋白在耻垢分枝杆菌（M.smegmatis，MS）感染中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）时所起的作用。方法 利用异源表达结核分枝杆菌（M.tuberculosis, Mtb）PPE25蛋白的重组MS（MS-ppe25组）感染人PMN，以空载体MS（MS-vec组）为对照菌，观察2种MS的菌落形成、单菌落大小、生长曲线，以了解PPE25蛋白对MS生长的影响；PMN感染MS后，以菌落形成单位(colony forming unit，CFU)计数了解细菌活力的变化；检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放百分比，以观察重组MS对PMN死亡的影响，流式细胞仪检测活性氧（reactive oxygen species, ROS），硝酸还原酶法检测一氧化氮（nitric oxide，NO）水平，ELISA检测细胞因子白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的变化，分析PPE25蛋白在MS感染PMN中的作用。结果 PPE25蛋白对MS生长、菌落形成及单菌落大小无影响； MS感染PMN 2、6、12 h，MS-ppe25组CFU、LDH释放百分比均高于MS-vec组，两组LDH释放百分比差异有统计学意义（P<0.05）；MS感染PMN细胞后2 h， MS-vec组ROS、NO水平较MS-ppe25组高（P<0.01）； MS-ppe25组PMN细胞表达的TNF-α各时点均高于对照组（P<0.01），IL-1β在MS感染6 h后均高于对照组（P<0.01）。结论 PPE25蛋白能增加MS在PMN内的生存、诱导细胞坏死、抑制ROS和NO的表达，改变细胞因子的分泌，有利于病原体的播散及逃避宿主免疫。     

一种新型的表达PPE68蛋白的重组耻垢分枝杆菌载体疫苗的构建及鉴定

目的:构建一种新型的、含结核分枝杆菌(M.S)抗原PPE68的耻垢分枝杆菌载体疫苗.方法:以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组为模板,PCR方法获得Rv3873基因,然后通过克隆构建获得真核表达质粒pVAX-1-Rv3873,最后通过电转化的方法将pVAX1-Rv3873真核表达质粒转化至耻垢分枝杆菌的感受态细胞中获...     

结核分枝杆菌突变gyrase A基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌Ser95Thr突变DNA促旋酶A(DNA gyrase A)基因原核表达载体并鉴定,为进一步研究奠定基础。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用重叠延伸剪切技术,分别通过3次PCR扩增Ser95Thr突变gyrase A基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pET-32 a(+),获得重组表达质粒pET-mgyr。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ser95Thr突变gyrase A基因,经过酶切、PCR和测序鉴定,表明突变gyrase A基因正确地插入原核表达载体pET-32 a(+)。结论成功构建了原核表达载体pET-mgyr,为Ser95Thr突变gyrase A基因的功能研究奠定了基础。     

结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B基因的克隆及表达

目的对分支杆菌的一种分泌蛋白Ag85B的基因进行克隆、表达,为结核病进行诊断打下基础。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,以PCR法对基因ag85b进行扩增,产物与载体质粒pET24b构建表达Ag85B的重组质粒,将此重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内,抽提质粒,酶切检验,再转化入表达宿主大肠杆菌JM109(DE3)菌株内,对转化菌株以IPTG进行诱导后,破菌,离心,上清进行SDS-     

结核分支杆菌KatG基因表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆与结核分支杆菌耐异烟肼密切相关的KatG基因,实现其在大肠杆菌中的表达并对其酶活性进行初步检测。方法构建含KatG基因的表达质粒pET24b-KatG,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得稳定的高表达菌株后对表达产物进行过氧化氢酶活性的初步检测。结果限制性内切酶分析结果显示所构建的pET24b-KatG表达质粒已成功克隆了KatG基因。含pET24b-KatG表达质粒的大肠杆菌在导丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,对表达产物进行SDS-     

结核分枝杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及序列测定

目的 :构建以结核分枝杆菌热休克蛋白 6 5kU基因为基础的核酸疫苗。方法 :采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中 ,扩增出HSP6 5的编码基因 ,经限制性核酸内切酶消化后 ,插入真核表达载体pcDNA3.1( )的相应酶切位点 ,并将此重组质粒进行序列测定。结果 :重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP6 5。结论 :以HSP6 5编码基因为基础的真核表达载体构建成功 ,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础     

结核杆菌HSP70真核表达载体的构建

目的：构建结核杆菌HSP70重组真核表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37RV基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因DNA序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒GPEM－G vector, 经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒PCDNA3．1（＋）,构建成PCDNA3．1－HSP70重组质粒。结果：经酶切鉴定,证实重组质粒构建正确。结论：结核杆菌HSP70真核表达载体构建成功。     

结核分支杆菌icl基因克隆策略及表达研究

目的 研究克隆并表达结核分支杆菌H37Rv结构基因icl的最佳策略，并获得纯化蛋白。方法 以M．tb H37Rv基因组为模板，扩增该菌株的异柠檬酸酶基因icl，并重组入pUC18质粒进行克隆，克隆基因进而重组入原核表达质粒pET28-a( )中，在不同的条件下进行诱导表达。重组蛋白以Ni-NTA agaroae亲和层析柱纯化。结果 在25℃，0．25mM IPTG诱导表达8h可获得最佳表达量的可溶性重组蛋白，经HPLC和质谱检测分子质量为目标蛋白。结论 本研究中所采用的icl基因克隆表达策略能够获得正确的高表达的可溶性异柠檬酸酶重组蛋白。     

胰岛素前体基因克隆及其原核表达载体的构建

目的：构建胰岛素前体基因的原核表达载体。方法：以重叠PCR方法扩增获得胰岛素前体基因片段,并将片段克隆入zero pCR4 Blunt-TOPO载体内,获得胰岛素前体中间载体;随后将胰岛素前体克隆到Pet23表达载体中。结果：双酶切鉴定结果显示,成功构建了胰岛素前体基因的原核表达载体。结论：本实验成功构建了胰岛素前体基因的原核表达载体,为后续实现大规模的实验室表达和胰岛素的工业化生产奠定了坚实的基础。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因原核表达重组质粒的构建

目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的原核表达重组质粒pET-amastin.方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET-amastin.结果:扩增出大小约550 bp的无鞭毛体蛋白基因,重组质...