结核分枝杆菌MPT64诊断抗原基因的克隆及生物信息学分析

目的获得结核分枝杆菌MPT64诊断抗原基因,进行DNA测序、序列特性生物学特性分析,为研究结核病诊断抗原侯选基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌MPT64抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌MPT64抗原基因,测序表明该片段由699bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为98%,推导编码氨基酸序列同源性为98%。结论经DNA测序证实,扩增出的片段确为MPT64,该片段阅读框完整。     

结核杆菌基因组RD1区毒力蛋白分泌相关基因Rv3871的克隆、表达及生物信息学分析

目的对结核分枝杆菌H37Rv毒株RD1毒力分泌系统Rv3871基因进行克隆和蛋白表达,运用生物信息学分析该基因在结核杆菌毒力蛋白分泌过程中的作用。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,以PCR扩增出完整的Rv3871基因,将其插入原核表达载体pET32a（＋）,对其核苷酸序列进行测定。利用生物信息学软件对结核杆菌Rv3871进行结构功能分析并与多种分枝杆菌进行同源性比对。结果经分子克隆的Rv3871酶切片段与预期大小符合,基因序列与Genbank报道一致,SDS-PAGE检测到相对分子质量为84000的特异性表达蛋白,生物信息学分析发现两个FtsK/SpoEⅢ样结构域,同源性比对则发现在致病性分枝杆菌与卡介苗等非致病菌Rv3971基因对应区域的结构完整程度有较为显著的差别。结论本研究通过对结核分枝杆菌RV3871基因进行分子克隆,特异蛋白表达和基因序列测定,提供了该基因的结构功能特征,并通过生物信息学与同源性对比分析,发现Rv3871基因在致病和非致病分枝杆菌毒力分泌作用中的结构和功能差异,为结核病发病机制阐明及其治疗药靶的筛选提供理论和实验依据。     

结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的表达及纯化

目的克隆结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的编码基因Rv1926c,并在大肠杆菌中表达纯化,获得结核分枝杆菌重组MPT63蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1926c基因编码序列,克隆入原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组MPT63抗原蛋白。结果测序表明重组质粒pET30aRv1926c具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白MPT63在大肠杆菌中以包涵体形式稳定表达。结论结核分枝杆菌MPT63重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。     

结核分枝杆菌重组Bb-MPT64疫苗的构建、鉴定及表达

目的:构建和鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb)-MPT64疫苗.方法:以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到MPT64抗原编码基因序列,定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-MPT64;用电穿孔法将该质粒导入Bh及BL21(DE3),构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-MPT64疫苗.用IPTG诱导重组BL21(DE3)菌表达MPT64/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定.结果:PCR成功扩增出688bp的MPT64目的基因;双酶切证实MPT64目的基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-MPT64疫苗构建成功.免疫印迹分析发现重组质粒pGEX-MPT64的表达产物在相对分子量(50ku)处有明显的蛋白表达条带,且能被活动性结核病人血清特异识别.结论:成功构建了结核分枝杆菌rBb-MPT64疫苗,为发展新型结核病疫苗奠定了基础.     

结核分枝杆菌ESAT-6诊断抗原基因的克隆及同源性分析

目的 获得结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,进行DNA测序、同源性分析,为筛选结核病候选诊断抗原基因奠定基础.方法 以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和生物信息学分析.结果 成功扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由288bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99%,推导编码氨基酸序列同源性为90%.结论 成功克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,测序结果表明该片段阅读框完整.     

结核分枝杆菌CFP10诊断抗原基因的克隆及序列特性分析

目的扩增结核分枝杆菌培养滤液蛋白10基因（CFP10）,并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析,为研究结核病候选诊断抗原基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由303bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为100%。结论成功克隆CFP10基因,经DNA测序证实,该片段阅读框完整,为其原核表达及相关研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌rps12基因的克隆及核酸序列的分析

目的扩增结核分枝杆菌rps12基因,并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌rps12抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌rps12抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由375bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为99%。结论成功克隆rps12基因,经DNA测序证实,该片段阅读框完整,该基因的获得为其原核表达及相关研究奠定了基础。     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗的构建及鉴定

目的构建并鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌（（Bifidobacteria bifidum,Bb）-ESAT-6-MPT64疫苗。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增ESAT-6和MPT64单基因序列,然后采用基因拼接（gene SOEing）法构建融合基因ESAT-6-MPT64,定向克隆至穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64;再电转化入Bb,构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗。结果 PCR成功扩增出1020bp的ESAT-6-MPT64融合基因;双酶切证实ESAT-6-MPT64融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6-MPT64疫苗构建成功。结论成功构建了结核分枝杆菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗,为进一步研究其免疫保护效果奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的：克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10（CFP10）基因,并对其进行序列分析。方法：自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFPIO基因设计引物。通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果：PCR产物电泳显示扩增片段约为300bp,测序获得的片段开放编码框由303bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100％,推导出编码氨基酸序列同源性为100％。结论：成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFPIO基因序列无差异。     

结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法：从H37Rv基因组中扩增出MPT64基因，经限制性内切酶消化后，定向插入pcDNA3.1( ）中，用脂质体法将pcDNA-MPT64转染COS-7细胞。采用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出的MPT64基因正确插入pcDNA3.1中，DNA序列测定无突变产生。重组质粒在COS-7细胞中表达MPT64。结论：成功地构建了pcDNA-MPT64质粒，其真核表达的蛋白具有良好的抗原性，为进一步研究MPT64在抗结核菌感染中的预防作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT64编码基因的共表达载体pBud85B-MPT.方法:将结核分枝杆菌Ag85B、MPT64基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pBud85B-MPT;将pBud85B-MPT转染COS-7细胞,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:在COS-7细胞中同时检测到Ag85B、MPT64的表达.结论:pBud85B-MPT共表达质粒构建成功,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础.     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的：构建结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达．方法：采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合，定向克隆入pcDNA3．1( )中。采用脂质体转染法将pcDNA／Ag85B—MPT64(pcDNA／AM)转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：Ag85B-MPT64融合基因经双向DNA序列测定，碱基突变率为0．11％(2／1707)，突变为无意义突变；重组质粒转染COS-7细胞后经检测证实，该融合基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达，融合蛋白具有良好的抗原性。     

结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6，Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6，Ag85B和MPT64基因(288bp，978bp and 687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coli Dh5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与献报道一致，证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了ESAT6，Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。     

应用PCR方法扩增IS6110保守片段快速鉴定结核分支杆菌

目的：了解PCR方法快速鉴定结核分支杆菌的可靠性，探索快速诊断结核病的实验方法。方法：应用PCR方法扩增149株结核分支杆菌临床分离株的IS6110保守片段，并与结核分支杆菌H37Rv标准株进行比较。结果：149株临床分离株中，140株可以扩增出与结核分支杆菌H37Rv标准株相同的123bp DNA片段(敏感性达93．9％)，而阴性对照均不能扩增出该片段。结论：应用PCR方法扩增IS6110保守片段来鉴定结核分支杆菌，结果准确可靠，且具有方便和快速等优点，有较大的临床应用价值。     

结核分枝杆菌抗原MPT83和MPT64 二价基因疫苗的研究

目的探讨结核杆菌两种抗原MPT83 和MPT64基因疫苗的免疫原性和免疫保护性.方法用成对引物扩增MPT83 和MPT64两种抗原基因,构建到同一载体pJW4303中,测序正确和体外表达验证后免疫小鼠,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定3次免疫后小鼠的抗体滴度.对3次免疫后的小鼠脾细胞进行培养,抗原刺激,用夹心 ELISA方法测定细胞因子IFN-γ和IL-4的含量.免疫小鼠攻毒,进行细菌培养,检测肺脏和脾脏的载菌量.结果每次免疫后抗原的滴度分别为 1∶ 200、1∶ 800、1∶ 6400,而卡介苗(BCG)组的抗体滴度为1∶ 800,空载体组未检测到抗体滴度.融合的二价基因疫苗免疫小鼠,主要诱发Th1 型细胞因子,IFN-γ占优势,二价组中的含量为7520 pg/ml, IL-4的含量仅为ng级.H37Rv攻毒后,二价组小鼠的肺脏载菌量为(2.21±0.03) ×105,比空载体免疫小鼠低103倍,比BCG免疫小鼠低10倍.结论抗原MPT83和MPT64二价基因疫苗有效提高了机体保护效力,对于结核病的防治具有一定的借鉴价值.     

Molecular cloning and expression of the immunodominant protein Ag85A from Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain]

OBJECTIVE: To provide the target gene and target antigen for the development of new vaccine against tuberculosis. METHODS: According to the gene sequence encoding protein Ag85A from Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain, we designed a pair of oligonucleotide primers, obtained the gene by using polymerase chain reaction, and inserted the gene into the BamH I and EcoR I site of plasmid pBK-CMV to construct recombinant plasmid, and after that, the recombinant plasmid was transferred into E. coli XL1-Blue MRF' and induced with IPTG. The expression product of the gene was analyzed by using SDS-PAGE and western-blotting. RESULTS: The gene encoding the protein Ag85A of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain was successfully amplified by using PCR. A recombinant shuttle plasmid was constructed. The recombinant plasmid stably expressed recombinant Ag85A protein relative molecular mass 32 x 10(3) in E. coli XL1-Blue MRF'. CONCLUSION: A recombinant plasmid which contains the gene encoding the protein Ag85A of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain has been successfully constructed. The recombinant plasmid can stably express recombinant protein relative molecular mass 32 x 10(3) in E. coli XL1-Blue MRF'. These results could serve as a basis for further studies on the usefulness of the gene and its expression product in the development of new vaccine against tuberculosis.