低频超声联合微泡经颅开放血脑屏障初步研究

目的探讨低频超声联合微泡经颅靶向开放血脑屏障及在临床应用价值。方法①经静脉注射微泡后,用频率为43kHz、强度为2W/cm2,持续超声波辐射大鼠头部5min;②采用荧光显微镜伊文氏蓝(EB)、电镜镧示踪法以及透射电镜观察脑组织的超微结构变化。结果经颅超声波与微泡联合能短暂地促进伊文氏蓝和镧离子通过多种形式跨越血脑屏障。结论低频超声联合微泡能可逆的、靶向的、局部的开放血脑屏障,并为进一步研究药物进入脑实质内提供新的策略。     

聚焦超声联合微泡开放血脑屏障的研究进展

血脑屏障可以阻止有害物质进入脑内,同时阻碍了药物治疗颅内疾病。如何安全、可逆地开放血脑屏障成为研究重点。聚焦超声联合微泡技术开放血脑屏障可能是基于超声的空化效应和声辐射力作用,其开放程度可在MRI的监控下准确评估,且微泡作为载体可运载辅助药物治疗颅内疾病,已在大量动物实验中获得初步成效。该技术具有靶向、无辐射和无毒性、不损害大脑组织及可重复性等优点,具有很大的发展前景。     

低频聚焦超声联合微泡开放大鼠血脑屏障的时间参数对比研究

目的 探索低频聚焦超声联合微泡开放大鼠血脑屏障的辐照时长参数.方法 健康SD大鼠60只,随机分为对照组(A组)、超声组(B组)和超声微泡组,超声微泡组按辐照时间不同分为0.5min组(C1组)、1.0 min组(C2组)、1.5 min组(C3组)、3.0 min组(C4组);实验鼠经尾静脉注射自制微泡和伊文思蓝染料后,用频率为1 MHz,声强为4 W/cm2的低频聚焦超声以不同辐照时间辐照大鼠头部,采用组织学方法 观察大鼠血脑屏障的开放情况.结果 超声微泡组辐照时间0.5 min(C1组)未见脑组织蓝染,辐照时间1.0 min组(C2组)、1.5 min组(C3组)、3.0min (C4组)组均可见蓝染;HE染色检测3.0 min组(C4组)见血细胞.结论 低频聚焦超声联合微泡在频率为1 MHz、声强4 W/cm2、辐照时间1.0～1.5 min参数下可以局部开放血脑屏障.     

诊断超声联合微泡开放体外血脑屏障的机理研究

目的 建立体外血脑屏障(blood brain barrier,BBB) 模型,探讨诊断超声联合造影剂(微泡)可逆性开放血脑屏障的机理.方法 BALB/c小鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMVEC) 建立BBB体外实验模型.选择青壮年标本颞骨片,大小1.5 cm×2.0 cm,置于细胞小室上,模拟经颅骨超声声窗条件,根据分组在模型中加入自制的脂膜氟烷超声造影剂(微泡),采用经头颅超声诊断仪辐照,辐照10 min.分为4组,每组4个样本:(1)对照组;(2)超声组;(3)微泡组;(4)超声联合微泡组.经上述处理后,光镜和电镜观察BBB细胞膜及超微结构改变,在不同的时间点检测跨内皮细胞电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) 的通透性,探讨可逆开放BBB的机理.结果 光镜和扫描电镜显示实验后4组样本细胞表面无明显形态学改变和损伤,透射电镜证实超声联合微泡组辐照后细胞间紧密连接向桥粒连接过渡,超声组紧密连接减少,但没有明显连接分离现象; HRP通透率检测显示超声联合微泡组辐照后细胞通透率呈波浪形增加,18 h后完全恢复,超声组辐照后BBB通透率增加,于30 min内恢复,通透率最高时跨细胞电阻抗(TEER)降低至(179±8) Ω/cm2,随着HRP通透率的减低,TEER逐渐恢复;电镜、HRP通透率在微泡组和对照组没有明显改变.结论 微泡联合诊断超声波能通过短暂开放紧密连接,降低细胞间电阻,提高通透率,达到可逆性开放血脑屏障.     

MRI引导聚焦超声联合微泡开放血脑屏障的时效关系

目的研究在MRI引导下聚焦超声联合微泡靶向开放血脑屏障（BBB）的时效关系。 方法采用1.5 T的MRI超声治疗系统联合微泡辐照靶点,2 h后增强T1相扫描,测定靶点信号强度值与病理组织学和MR图像结果比较。 结果当声裂10 s和14 s时,靶点信号强度值出现最高值（P〈0.05）,而脑组织损伤不明显;16 s组或更长时间,信号强度值不再增加或出现下降,组织学检查发现有不同程度坏死、红细胞渗出等病理改变。 结论MRI引导聚焦超声联合微泡可靶向开放局部血脑屏障;T1相信号强度值监测BBB的通透性。     

微泡介导下诊断超声波开放人血脑屏障的可行性研究:体外微泡破坏实验

目的探讨诊断超声经人颅骨破坏微泡的可行性及条件,为下一步开展诊断超声联合微泡开放人血脑屏障的在体实验研究奠定基础。方法建立体外微泡破坏实验装置,分别考察GE Vivid 7、Sequoia 512和Philips iE 33超声仪器对儿童、青年和老年颅骨的颞骨窗、枕骨窗和顶骨窗5.0 cm处微泡的破坏情况。选择Sequoia 512超声仪器以最低频率(1.75 MHz)、机械指数(1.9)经青年颞骨辐照微泡后,考察不同辐照深度微泡的破坏情况。结果3种超声诊断仪经所有颅骨的颞骨窗、枕骨窗辐照后后都能明显地破坏微泡,但经顶骨不能击破微泡。Sequoia 512超声仪器经青年颞骨后在辐照深度7.5 cm处仍能明显地破坏微泡。结论诊断超声波经人颅骨颞骨窗、枕骨窗仍能破坏微泡,具有联合微泡开放人血脑屏障的潜在可能性。     

低频超声破坏微泡造影剂开放血脑屏障的实验研究

目的探讨不同强度的低频超声经颅诱导微泡造影剂破坏对大鼠血脑屏障的影响。 方法股静脉注入微泡造影剂后，采用频率43kHz，声强分别为1．2．1．5．1．8．2．3w／cm。的连续超声波经大鼠颅骨照射3min，荧光显微镜观察伊文思兰的渗出。 结果注射微泡造影剂后，声强1．2w／cm^2时超声波即可以开放血脑屏障，随声强的增加脑组织损伤加重。 结论低频超声诱导微泡造影剂破坏可以靶向开放血脑屏障。     

超声联合微泡开放血脑屏障及其安全性的研究

血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）是指脑毛细血管阻止某些物质（多是有害的）进入脑循环血的结构，这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态起着重要作用。但由于血脑屏障的存在，其在阻止有害物质进入脑组织的同时，也阻碍了有效治疗药物进入中枢神经系统，     

诊断超声联合微泡促顺铂跨血脑屏障转运的实验研究

目的 探讨诊断超声联合超声造影剂(微泡)促顺铂跨体外血脑屏障(BBB)模型的可行性.方法 利用BALB/c小鼠脑微血管内皮细胞(BMVEC)建立BBB体外实验模型,根据是否加入微泡和超声辐照,分为四组:对照组、超声组、微泡组和超声联合微泡组.每组添加浓度为5 ng/μl的生物素胶体金50 μl和顺铂,顺铂达到9 μg/cm2,供池定容在460 μl,分别于超声辐照后再培养48 h,并在培养不同时间点从受池中取样,通过高效液相色谱法(HPLC)检测顺铂的通透率;透射电镜观察细胞膜与细胞内超微结构的变化以及胶体金的分布;实验前后细胞小室行扫描电镜能谱分析.结果 2 MHz、0.6 W/cm2、10 min的诊断超声辐照联合脂膜微泡(1 μl/ml)能够促顺铂跨体外BBB模型的转运,透射电镜观察到内皮细胞胞饮小体增多,细胞内可见胶体金分布;单纯超声辐照组细胞间隙可见少量胶体金分布,对照组和微泡组细胞内外均不能见到胶体金;扫描电镜能谱分析,各组碳和锌元素总量均无改变,而超声组和超声联合微泡组两种元素的能谱分布发生转变.经HPLC检测,顺铂通透量超声组与超声联合微泡组显著高于对照组与微泡组,组间比较差异有统计学意义.结论 微泡联合诊断超声波能通过短暂开放紧密连接,促进药物顺铂跨BBB的转运.     

诊断超声激励微泡对增强临床乳腺癌血流灌注的研究

目的 观察并探讨诊断超声激励超声造影剂微泡对浸润性乳腺癌病灶血流灌注的增强效应。方法 5例经病理证实的浸润性乳腺癌患者,在每次新辅助化疗结束后1h内对病灶进行诊断超声激励造影剂微泡治疗。治疗前后实施常规超声造影动态观察其血流灌注情况,应用时间-强度曲线分析软件分析并获取峰值强度(Peak Intensity, PI)、曲线下面积(Area Under Curve, AUC)及曲线上升斜率(Ascending Slope, AS)。结果 诊断超声激励微泡治疗后乳腺癌病灶的PI、AS及AUC均有所提高,治疗前后PI及AS比较差异均有统计学意义(Z=-2.13,-2.09;P=0.03,0.03),但治疗前后AUC比较差异无统计学意义(t=-1.15;P=0.28)。结论 诊断超声激励造影剂微泡能够增加新辅助化疗乳腺癌病灶的血流灌注量,加快血流灌注速度。     

Effects of transcranial ultrasound and intravenous microbubbles on blood brain barrier permeability in a large animal model

We sought to determine whether transtemporal-applied 1-MHz ultrasound-induced microbubble destruction may be a safe method of transiently altering blood brain barrier (BBB) permeability for drug delivery in a large animal model. Endothelial cells are an integral component of the BBB but also prevent passage of potentially therapeutic drugs. Ultrasound-mediated destruction (UMD) of microbubbles has been shown to disrupt this barrier in small animals when ultrasound is delivered through bone windows. However, the effects of temporal bone attenuation and scattering in a large animal may limit the clinical application of such a technique. Twenty-four pigs were studied. One-MHz pulsed-wave ultrasound at 2.0 W/cm(2) (20% duty cycle) across the temporal bone was applied for 30 min after intravenous injections of either albumin-coated perfluorocarbon microbubble (PESDA, 8 pigs), lipid-encapsulated perfluorocarbon microbubbles (LEMB, 8 pigs) or ultrasound alone (8 pigs). BBB leak was quantified at 30 and 120 min after insonation using Evans blue. Serial magnetic resonance imaging (MRI) was performed in nine of the pigs (3 for each group) to quantify Gadolinium leak within the parenchyma. Peak negative pressures decreased ten-fold when ultrasound was transmitted across the pig temporal bone. Despite this, spectrophotometric analysis showed that both IV LEMB and PESDA combined with transtemporal ultrasound resulted in a significant increase in Evans blue extravasation across BBB of the treated side at 30 min after insonation (p < 0.001; compared with ultrasound alone) but not at 120 min. There was significant retention of Gadolinium within the insonified parenchyma at 60 and 90 min after insonation, but not at 120 min. Oxygen saturation and arterial pressures were not changed after any microbubble injection. Intravenous microbubbles, combined with transtemporal ultrasound, can transiently increase BBB permeability in a large animal. This induced opening of BBB is reversible and may be a safe noninvasive method of achieving drug or gene delivery across the BBB.     

超声联合微气泡开放大鼠血脑屏障的实验研究

目的 探讨超声联合微气泡开放大鼠血脑屏障的安全性及有效性.方法 经大鼠尾静脉注射微气泡声诺维,同时采用GE Vivid 7超声辐射大鼠头颅,辐射深度经磁共振(MRI)扫描辅助定位于基底节区;以MRI增强扫描和荧光显微镜观察伊文思蓝的方法来检测血脑屏障开放程度,苏木素伊红(HE)染色观察细胞形态检测实验的安全性.结果 超声联合微气泡辐射大鼠头颅后,在MRI增强扫描T1W1上观察到辐射区域信号增强,荧光显微镜下观察到辐射区域伊文思蓝的红色荧光;HE染色细胞形态正常,结构完整.结论 超声联合微气泡可靶向、无创地开放大鼠血脑屏障,为中枢神经系统疾病的药物和干细胞治疗提供了新途径.     

In vivo gene transfer into the ocular ciliary muscle mediated by ultrasound and microbubbles

This study aimed to assess application of ultrasound (US) combined with microbubbles (MB) to transfect the ciliary muscle of rat eyes. Reporter DNA plasmids encoding for Gaussia luciferase, β-galactosidase or the green fluorescent protein (GFP), alone or mixed with 50% Artison MB, were injected into the ciliary muscle, with or without US exposure (US set at 1 MHz, 2 W/cm², 50% duty cycle for 2 min). Luciferase activity was measured in ocular fluids at 7 and 30 days after sonoporation. At 1 week, the US+MB treatment showed a significant increase in luminescence compared with control eyes, injected with plasmid only, with or without MB (×2.6), and, reporter proteins were localized in the ciliary muscle by histochemical analysis. At 1 month, a significant decrease in luciferase activity was observed in all groups. A rise in lens and ciliary muscle temperature was measured during the procedure but did not result in any observable or microscopic damages at 1 and 8 days. The feasibility to transfer gene into the ciliary muscle by US and MB suggests that sonoporation may allow intraocular production of proteins for the treatment of inflammatory, angiogenic and/or degenerative retinal diseases.     

诊断超声联合微泡对兔VX2肿瘤的血流增强效应

目的探讨不同机械指数(MI)的诊断超声联合微泡对兔VX_2肿瘤的血流增强效应。方法选取健康雄性新西兰白兔40只,采用单侧大腿内侧瘤组织块接种法接种VX_2肿瘤,造模成功后将其随机分为实验1组(MI=0.3)、实验2组(MI=0.7)、实验3组(MI=1.4)及对照组,每组各10只。抽取0.2 ml"脂氟显"用5.0 ml生理盐水稀释后经耳缘静脉通道匀速推入,同时分别经不同机械指数辐照肿瘤,对照组予以超声假照,时间均为5 min。储存治疗前后动态造影图像,并用造影分析软件分析,记录峰值强度(PI)和曲线下面积(AUC)。结果实验1组、实验3组治疗前后PI比较差异均有统计学意义(P=0.028、0.018),实验2组、对照组治疗前后PI比较差异无统计学意义(P=0.994、0.978);实验3组治疗前后AUC值比较差异有统计学意义(P=0.009),实验1、2组及对照组治疗前后AUC值比较差异均无统计学意义(P=0.099、0.497、0.898)。结论低能量诊断超声(MI=0.3)联合微泡可丰富兔VX_2肿瘤血供,高能量诊断超声(MI=1.4)可减少血流灌注。     

低频诊断超声联合脂氟显微泡开放小鼠血脑屏障的可逆性研究

目的探讨低频诊断超声联合脂氟显微泡开放小鼠血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的可逆性及伊文思蓝(Evans blue,EB)透过率。方法健康C57BL/6小鼠48只,随机分为对照组6只和观察组42只。观察组再随机分为0、0.5、1、2、3、8、10 h亚组各6只,低频诊断超声辐照同时经尾静脉注射脂氟显微泡1 mL/kg,并分别于超声辐照0、0.5、1、2、3、8、10 h经尾静脉注射质量分数2%EB溶液50 mg/kg;对照组不进行低频诊断超声辐照,经尾静脉注射1 mL/kg生理盐水后注射质量分数2%EB溶液50 mg/kg。注射1 h后处死小鼠取脑组织,观察脑组织蓝染深度及面积,采用紫外分光光度法定量分析脑组织EB含量。结果对照组及观察组8、10 h亚组未见脑实质蓝染,观察组0、0.5、1、2、3 h亚组辐照区脑实质均有不同程度蓝染,且1 h时蓝染深度最深、面积最大;观察组0、0.5、1、2、3 h亚组脑组织EB含量[(45.43±2.89)、(50.94±1.25)、(79.79±1.12)、(51.55±1.20)、(31.60±1.77)μg/g]均高于对照组[(8.32±0.12)μg/g](P<0.05),8、10 h亚组脑组织EB含量[(8.34±0.09)、(8.31±0.07)μg/g]与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);观察组0、0.5、1 h亚组脑组织EB含量依次升高(P<0.05),1、2、3 h亚组脑组织EB含量依次降低(P<0.05)。结论低频诊断超声联合脂氟显微泡开放小鼠BBB呈动态可逆的过程,BBB在超声辐照后1 h开放程度最大,于超声辐射8 h恢复正常。     

MRI引导与监测聚焦超声靶向开放血脑屏障兔脑给药

目的 探讨MRI引导与监测聚焦超声靶向开放血脑屏障(BBB)兔脑给药的效果.方法 25只新西兰大白兔随机均分为5组(0 h,2 h,4 h,8 h,24 h组),MRI引导聚焦超声辐照各组兔左脑,取靶点组织作为辐照组,取右脑相应解剖组织为对照组,分别于辐照后不同时间点静注欧乃影和甲氨喋呤(MTX),行T1加权相增强扫描,通过比较辐照组与对照组MRI信号强度增强率观察靶点BBB开放情况,并以靶点伊文氏蓝(EB)染色结果检验其准确性;以高效液相色谱法测定、比较辐照组与对照组MTX的浓度,计算靶点脑组织信号强度增强率与MTX浓度之间的线性相关系数.结果 兔脑靶点BBB开放处T1WI表现为点状或斑片状异常高信号影,与辐照前MRI定位时预设靶点位置吻合良好,并与EB蓝染结果一致,同时靶点脑组织信号强度增强率与MTX浓度之间的相关系数为0.96(P<0.01),两者有良好的相关性.结论 MRI能够引导与监测聚焦超声靶向开放BBB脑内给药,有望成为临床个体化治疗中枢神经系统疾病的理想监测手段.