胶质细胞源性神经营养因子在成年大鼠背根节分布的免疫组织化学研究

目的　观察胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)在成年大鼠背根节中的分布。　方法　用 GDNF多克隆抗体免疫组织化学 ABC法及图像分析方法。　结果　 GDNF免疫反应主要存在于背根节的小神经细胞中 ,背根节的大神经细胞呈弱阳性反应 ,与背根节相连的感觉神经纤维呈免疫反应性。　结论　 GDNF在背根节感觉神经元和神经纤维中有一定量的分布。     

成年大鼠嗅球和鼻腔嗅粘膜成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的　在嗅球成鞘细胞 (OECs)移植到脊髓可有助于损伤神经纤维再生的基础上 ,分别对嗅球和嗅粘膜的OECs进行培养 ,探索自体嗅粘膜作为OECs供体的可能性。　方法　根据OECs、成纤维细胞和星形胶质细胞贴壁时间的不同 ,采用差时贴壁方法分离出OECs,培养 14div后进行NGFRp75和GDNF的免疫细胞化学染色。　结果　按形态学和免疫组织化学特性 ,培养的嗅球和嗅粘膜OECs可分为 3类 :双极细胞、三级细胞和扁圆细胞 ,其中以双极细胞最多。嗅粘膜的双极成鞘细胞的突起更加细长。　结论　差时贴壁细胞分离法是一种简单、经济、实用的成鞘细胞分离方法。鼻腔嗅粘膜OECs的形态学和免疫细胞化学特性与嗅球OECs基本相同 ,本实验为临床开展自体嗅粘膜OECs修复脊髓损伤的研究提供参考     

大鼠嗅球和鼻腔嗅粘膜成鞘细胞的形态学研究

目的：观察大鼠嗅神经成鞘细胞在嗅球和嗅粘膜的分布及其形态学结构特征，研究其与中枢神经再生的关系。方法：Luxol固蓝染色、Mallory染色和NGFRp75免疫组织化学染色结合透射电镜观察。结果：在嗅球纤维层的成鞘细胞随神经纤维呈纵向排列，在嗅小球层的成鞘细胞则围绕着嗅小球环行排列。在嗅粘膜的成鞘细胞位于柱状上皮深方，沿基底膜分布。成鞘细胞的胞体为细长梭形，有较长的突起，细胞核呈圆形或椭圆形。在嗅小球周围或嗅粘膜内的成鞘细胞呈NGFRp75免疫反应阳性。在电镜下，嗅球成鞘细胞的纵断面上可见其胞体呈长梭形，细胞核为不规则形，核仁清晰。在胞体的周围有大量的平行神经纤维纵向排列，在放大的横断面上，可见在1个成鞘细胞的细胞核周围有数根神经纤维被胞质包裹在一起。结论：嗅成鞘细胞是一种特殊的胶质细胞，分布于嗅球的纤维层、嗅小球层和嗅粘膜内。嗅神经成鞘细胞的胞体细长，有较长突起，其轴系膜紧密包裹成束的无髓神经纤维。     

成年大鼠嗅球成鞘细胞的原代培养

本实验取材于成年 Wistar大鼠嗅球的最外两层 ,进行原代培养嗅球成鞘细胞 ,用胶质纤维酸性蛋白抗体免疫组化方法确认。结果显示 :( 1)培养至第 10 d,原代培养物多见两种形态的细胞 :一种为单极、双极或多极细胞 ,带有细长的突起 ;另一种为所谓“煎蛋样”细胞 ,扁平状 ,胞质少极化 ,边缘不规则 ;( 2 )胶质纤维酸性蛋白反应显示这两种细胞均呈阳性 ,Nissl法复染后 ,可计数其纯度为 70 %～ 85 %。     

成年大鼠嗅黏膜嗅成鞘细胞的纯化

嗅成鞘细胞(OECs)是一种独特的中枢神经胶质细胞,分布于嗅球和鼻腔嗅黏膜,可分泌多种生物活性物质,现已证明来自嗅球的OECs与来自鼻腔嗅黏膜的OECs形态学特征与免疫组织化学性质是一致的,且都具有促进中枢神经系统轴突再生的作用。目前用于移植的OECs多数取材于嗅球,由于嗅黏膜OECs在自体取材上有着方便、快捷和安全性的特点,     

嗅成鞘细胞在新生大鼠嗅球的分布

中枢神经系统(CNS)内的胶质微环境是导致再生失败的重要因素。嗅觉神经元(olfactory sensory neurons,OSNs)具有终生再生的能力,因此嗅觉系统成为研究神经发生和轴突生长迁移的良好模型。嗅成鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是决定OSNs轴突能够终生再生的关键因素。周长满等对成年大鼠嗅成鞘细胞的分布进行了研究。     

Notch-1对嗅成鞘细胞脑源性神经营养因子表达的影响

目的:观察Notch-1对嗅成鞘细胞(OECs)脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响,为增强OECs对中枢神经系统损伤的修复能力提供实验基础.方法:将有活性的Notch质粒(NotchICV),无活性的Notch质粒(NotchVK)以及空白质粒转入OECs中,将实验对象分成活性质粒组、非活性质粒组和空白组,通过免疫荧光双标、RT-PCR及免疫印迹技术检测各组OECs中BDNF的表达变化.结果:活性质粒组OECs中BDNF及其mRNA的表达较非活性质粒组和空白组均增高,而非活性质粒组和空白组比较无差异.结论:Notch-1转染OECs后,其BDNF的表达上调,提示Notch-1能增强OECs中BDNF的合成.     

人GDNF在原代培养的大鼠成纤维细胞中的表达

目的：研究人脑胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在治疗神经系统疾病中的作用,克隆其前体蛋白cDNA序列,并用于真核细胞表达,方法：提取我国自建的脑胶质瘤BT325细胞总RNA,用逆转录PCR法扩增GDNF全长cDNA并构建其真核表达载体pCI-neo-GDNF,然后转染原代培养的成纤维细胞,免疫组织化学及原位杂交检测GDNF在细胞中的表达。结果：从国人脑胶质瘤细胞中扩增到558bp的GDNF全长cDNA,并在GDNF转基因原代成纤维细胞中检测到重组GDNF的转录和表达。结论：克隆到的GDNF全长cDNA片段,可用于真核细胞表达,其转基因细胞脑内移植后应能治疗包括帕金森病的内的神经系统变性疾病。     

GDNF在坐骨神经损伤后大鼠L4—6背根节神经元的表达及变化

目的 观察坐骨神经夹伤后不同时间点,胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＦ）在成年大鼠Ｌ４～６背根节（ＤＲＧ）中的分布,探讨ＧＤＮＦ对感觉神经元损伤的反应。方法 成年大鼠右侧坐骨神经夹伤后,分别取伤后１、５、７、１０、１４、２８和５６ｄＬ４～６背根节,行抗ＧＤＮＦ多克隆抗体免疫组织化学ＡＢＣ法染色,之后对染色结果进行图像分析。结果 ＧＤＮＦ免疫反应存在于坐骨神经夹伤后１、５、７、１０、１４、２８和５６ｄ成年大鼠Ｌ４～６背根节神经元中,图像分析结果表明,伤后１、３、５和７ｄ的损伤侧背根节神经元的平均光密度大于对照侧背根节神经元。结论 大鼠坐骨神经夹伤后,ＧＤＮＦ在背根节Ｌ４～６感觉神经元中有一定量的变化,且伤后１周内ＧＤＮＦ在伤侧背根节神经元中的表达增强。     

胶质细胞源性神经营养因子在成年大鼠背根节分布的免疫组 …

目的 观察胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＥ）在成年大鼠背要节中的分布。方法 用ＧＤＮＦ多克隆抗体免疫组织化学ＡＢＣ尖及图像分析方法。结果 ＧＤＮＦ免疫反应主要存在于背根节的上神经细胞中，背根节的大神经细胞呈弱阳性反应，与背根节相连的感觉神经纤维呈免疫反应性。结论 ＧＤＮＦ在背根节感觉神经元和神经纤维中有一定量的分布。     

碱性成纤维细胞生长因子对成年大鼠嗅黏膜成鞘细胞增殖的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对于纯化后的嗅黏膜成鞘细胞(OECs)增殖的促进作用,探讨嗅黏膜OECs的增殖特性。方法 应用差速贴壁和酶消化法对原代培养的嗅黏膜OECs进行纯化,用BrdU掺入法观察bFGF对嗅黏膜OECs增殖率的影响。结果 在没有特定刺激因子作用时,嗅黏膜OECs本身有一定的增殖率,而加入10μg／L的bFGF对嗅黏膜OECs有一定的促增殖作用。结论 在体外培养条件下,bFGF能提高嗅黏膜OECs的增殖率。     

原代培养大鼠嗅球成鞘细胞Nogo(N-18)的共聚焦激光扫描显微镜观察

目的 观察原代培养的成年大鼠嗅球成鞘细胞(OECs)Nogo(N-18)蛋白的表达，探讨Nogo与成鞘细胞促进神经再生作用的关系。方法 原代培养嗅球OECs，采用免疫组织化学和双标免疫荧光细胞化学技术，结合激光共聚焦扫描显微镜观察。结果 原代培养的嗅球OECs的Nogo(N-18)免疫细胞化学反应呈阳性，Nogo(N-18)蛋白主要分布于胞浆，而在胞膜及突起分布较少。结论 嗅球(OECs)含有Nogo—A蛋白，提示Nogo-18蛋白在嗅神经系统可能没有决定抑制轴突再生的作用。     

逆转录病毒介导的人CNTF在嗅神经鞘细胞中的表达及其对神经细胞存活和突起生长的影响

目的　研究含有睫状神经营养因子 (CNTF)表达调控系统修饰的嗅神经鞘细胞 (OECs)对神经细胞存活和突起生长的影响。　方法　通过基因克隆 ,用KpnⅠ +XbaⅠ将pcDNA3 S(NGF信号肽 ) hCNTF质粒中含有NGF信号肽的CNTF切下 ,插入逆转录病毒表达载体pRev TRE中。酶切鉴定后 ,将其与本系统的调控质粒pRev Tet On转入Ecopack 2 93细胞进行病毒包装 ,制备重组缺陷型hCNTF和Tet On逆转录病毒感染原代培养的大鼠OECs,用不同浓度的强力霉素诱导 ,以Western blot法对hCNTF的表达培养上清进行检测。将转染hCNTF的OECs与新生 2d大鼠DRG联合培养 ,用其上清培养视网膜节细胞 (RGCs)。经 β tubulin免疫组织化学染色后 ,分别测量DRG神经突起的长度并统计阳性RGCs数目。　结果　 1 经HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定 ,pRev TRE S hCNTF重组体分别被切下 6 30bp和 4 0 0bp片段 ,插入子的方向和完整性经确认与预期相符。 2 以不同浓度强力霉素诱导hCNTF修饰的OECs ,其培养上清均有分子量约 2 4kD的hCNTF蛋白质的显著特异表达 ,此表达与强力霉素的浓度呈正相关。未诱导组和对照组未见明显蛋白带。 3 同单纯OECs(2 3 15± 4 7)、空载 (2 4 5 5± 5 8)、空白 (16 8± 6 5 )等对照组相比 ,经hCNTF转染的OECs上清组的存活RGC数显著     

成年大鼠嗅粘膜细胞原代培养及形态学研究

为了探讨大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞(OECs)的分离与纯化培养方法并对其形态学进行研究,我们自鼻腔嗅粘膜取材后采用差速贴壁、机械刮除和阿糖胞苷(Arac)抑制相结合的纯化培养方法培养嗅粘膜细胞,并分不同阶段进行镜下观察及p75NGFR和GFAP免疫组化染色鉴定。结果显示,自嗅粘膜组织可以培养出四种细胞:梭形细胞、双极细胞、窝形细胞和大细胞。其中大部分梭形和双极细胞呈p75NGFR或GFAP免疫反应阳性,属于OECs。结果提示本文介绍的培养方法可以培养出嗅粘膜OECs;差速贴壁、机械刮除和Arac抑制相结合方法可纯化OECs。     

成年大鼠嗅神经鞘细胞纯化培养的研究

嗅神经鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs)是目前用于神经再生研究较为理想的移植细胞,为了建立一种可以有效获得高纯度、高均一性的OECs培养方法,本实验采用2. 5月的大鼠嗅球为实验材料进行OECs培养,同时结合OECs的生物学特点在培养8d后,通过用硝酸纤维素膜吸附p75抗体,再对培养的OECs进行免疫亲和吸附和对成纤维细胞进行补体杀伤来纯化OECs, 在纯化后分别对培养2、4、6、8d的OECs进行p75免疫组化染色和纯度鉴定。实验结果发现,本研究采用的OECs纯化培养方法所获得OECs纯度在4个不同培养时间点都达到98%以上,说明此方法是一种高效率的纯化培养OECs的方法。     

胶质细胞源性神经营养因子在成年大鼠三叉神经节及三叉神经核团中的分布

目的 观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在成年大鼠三叉神经节及三叉神经核团内的分布,探讨其对三叉神经感觉神经元及运动神经元的作用。方法 抗GDNF多克隆抗体免疫组织化学ABC法。结果 成年大鼠三叉神经运动核、三叉神经感觉核簇及三叉神经节中出现GDNF免疫反应阳性。结论 成年大鼠三叉神经运动核、三叉神经感觉核簇及三叉神经节中存在GDNF神经元。