纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

目的：探讨纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞作为软骨组织工程支架的可行性及有效性,并为后续研究可注射性材料做基础。方法：体外分离培养软骨细胞后接种到纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料体外培养4周,然后植入兔膝关节软骨缺损区继续培养4、8、12周后取材,分别行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学观察。并进行Wakitani评分,观察其体内修复关节缺损效果。结果：大体观察4周后,实验组软骨缺损区可有乳白色组织修复,12周可修复完全,并无明显凹凸感。光镜下8周可见大量软骨细胞修复,并在TB染色下见Ⅱ型胶原比4周时明显增多。12周时软骨陷窝结构形成,细胞形态排列及Ⅱ型胶原与正常软骨组织相近。结论：纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损。并为构建可注射性修复材料提供途径。     

利用脂肪干细胞构建软骨修复兔膝关节软骨缺损的初步研究

目的 利用兔同种异体软骨脱细胞基质支架和脂肪干细胞体外构建组织工程软骨,探讨其修复关节软骨损伤的可行性.方法 将新西兰大白兔的脂肪干细胞与软骨脱细胞基质支架复合,于软骨细胞方向诱导培养基中培养两周,构建组织工程软骨.兔24只随机分为A、B、C 3组, A组关节软骨缺损处置入经诱导的脂肪源干细胞复合软骨基质支架, B组缺损处只置入软骨基质支架, C组软骨缺损处不做任何处理.分别于术后第12周处死动物,修复处行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化染色和透射电镜检测.结果 A组软骨缺损处被类软骨组织填充,修复区表面光滑;Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色阳性;电镜下可见软骨陷窝内有细胞结构存在,且有大量均匀颗粒状细胞分泌基质成分存在,细胞周围大量胶原纤维.B组软骨缺损处为纤维组织状物填充,C组软骨缺损处无修复组织填充.结论 脂肪干细胞与软骨脱细胞基质复合并向软骨诱导后可良好地修复关节软骨缺损,具有替代正常软骨的潜力.     

软骨脱细胞基质复合脂肪源性干细胞构建软骨组织的实验研究

[目的] 探讨软骨脱细胞基质支架材料的制备,及其体外复合脂肪源性干细胞构建软骨组织的技术方法.[方法] 成年新西兰大白兔脂肪源性干细胞获得,培养,扩增.成年新西兰大白兔新鲜软骨,低温冻干12 h,后经曲拉通、DNA、RNA酶等处理制备成为软骨脱细胞基质支架材料,终浓度为2×107/L的脂肪干细胞种植于软骨脱细胞基质中于软骨细胞方向诱导培养基中培养2周,构建软骨组织.新鲜制备的软骨脱细胞基质及构建的软骨组织分别行组织学、免疫组织化学及透射电镜检测.[结果] 实验制备的软骨脱细胞基质支架材料内无细胞结构存在,仅残留空白软骨陷窝.具有合适的孔隙率和孔径大小;复合脂肪源性干细胞后细胞向材料内部迁移,粘附,生长良好.部分载体内细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.[结论] 软骨脱细胞基质可作为支架材料应用于软骨组织工程,复合脂肪源性干细胞培养可成功构建软骨组织.     

软骨脱细胞基质生物性的实验研究

目的研究软骨脱细胞基质植入机体后其局部及重要脏器的反应.方法将兔耳软骨行脱细胞处理.将12只SD大鼠分四组,实验组为脱细胞软骨;对照1组为新鲜软骨;对照2组为Vicryl;对照3组为硅胶条.将脱细胞处理及未处理的兔耳软骨、Vicryl和硅胶条分别植入鼠背部皮下,饲养至术后7,15,30天后处死取材,每次每组处死1只.取材的部位包括植入物及其周边组织,实验组同时取心、肺、肝、肾.标本以10%中性甲醛固定24h,常规HE染色.结果脱细胞软骨周围有少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润,可见扩张的毛细血管,为炎性反应Ⅲ级.新鲜软骨周围有大量中性粒细胞浸润,其中可见不规则的钙化组织,为炎性反应Ⅳ级.硅胶和Vicryl均引发异物反应.实验组术后4周内心、肺、肝、肾四种器官无器质性改变.结论脱细胞软骨基质具有良好的组织相容性,是一种潜在软骨的替代材料及软骨组织工程支架材料.     

软骨脱细胞基质生物性的实验研究

目的　研究软骨脱细胞基质植入机体后其局部及重要脏器的反应。方法　将兔耳软骨行脱细胞处理。将 1 2只SD大鼠分四组 ,实验组为脱细胞软骨 ;对照 1组为新鲜软骨 ;对照 2组为Vicryl;对照 3组为硅胶条。将脱细胞处理及未处理的兔耳软骨、Vicryl和硅胶条分别植入鼠背部皮下 ,饲养至术后 7,1 5 ,30天后处死取材 ,每次每组处死 1只。取材的部位包括植入物及其周边组织 ,实验组同时取心、肺、肝、肾。标本以 1 0 %中性甲醛固定 2 4h ,常规HE染色。结果　脱细胞软骨周围有少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润 ,可见扩张的毛细血管 ,为炎性反应Ⅲ级。新鲜软骨周围有大量中性粒细胞浸润 ,其中可见不规则的钙化组织 ,为炎性反应Ⅳ级。硅胶和Vicryl均引发异物反应。实验组术后 4周内心、肺、肝、肾四种器官无器质性改变。结论　脱细胞软骨基质具有良好的组织相容性 ,是一种潜在软骨的替代材料及软骨组织工程支架材料     

利用脂肪干细胞构建组织工程软骨修复兔膝关节软骨缺损

目的探讨以脂肪于细胞（ADSCs）复合脱细胞软骨基质支架构建组织工程软骨修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法以人关节软骨脱细胞基质为支架，复合经诱导的兔ADSCs，体外分别经静态培养和生物反应器培养，构建组织工程软骨。对膝全厚关节缺损进行修复，并与单支架组、空白对照组比较，其中空白对照组12个关节，脱细胞软骨支架组16个关节，静态培养细胞支架组24个关节，生物反应器培养细胞支架组8个关节。分别于术后3、6个月对修复关节进行大体、组织学及免疫组化观察。结果实际完成观察的关节数为44个，其中空白对照组9个，脱细胞软骨支架组11个，静态培养细胞支架组18个，生物反应器培养细胞支架组6个。空白对照组全为纤维组织或纤维软骨样修复；单支架组5个关节为未成熟透明软骨，无成熟透明软骨形成；静态培养细胞支架组83．3％为透明软骨，其中3个关节为成熟透明软骨，12个关节为未成熟透明软骨；生物反应器培养细胞支架组100％为透明软骨，其中2个为成熟透明软骨，4个为未成熟透明软骨。Wakitani评分各组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论ADSCs复合脱细胞软骨基质支架能良好地修复兔膝关节全厚软骨缺损，应用生物反应器技术有助于构建组织工程软骨，促进软骨缺损的修复。     

软骨微粒脱细胞基质和纤维蛋白凝胶支架皮下构建组织工程软骨

目的观察皮下植入异体软骨细胞复合异种软骨微粒脱细胞基质(Cartilage microparticle acellular matrix,CMACM)和纤维蛋白胶(Fibrin glue,FG)为支架形成组织工程软骨的可能性。方法制备猪耳廓CMACM,体外培养成年兔的耳软骨细胞,将不同的混合物植人5只成年兔背部皮下。A组:异体软骨细胞复合CMACM和FG;B组:自体软骨细胞复合CMACM和FG;C组:CMACM和FG。将每只兔子背部皮肤均分为6个区,分别植入不同混合物各两个点,以备两次取材。观察并记录皮下植入体的形态变化,分别于植入后8周和12周取材,行组织学检测。结果A组和C组未能形成软骨样组织。B组8周可以形成软骨样组织,周围炎症细胞数量较多;12周时形成的软骨组织成分单一,周围没有炎症反应,类似于正常软骨,且新生的软骨组织中均长有许多小血管,新生软骨的厚度不超过1 mm。结论将同种异体软骨细胞复合CMACM和FG植入皮下,不能形成软骨样组织:而以自体软骨细胞为种子细胞则可以得到软骨样组织,但新生软骨的体积和厚度有限,并且新生的软骨组织中长有许多小血管,可能更有利于新生软骨组织的长期存活。     

软骨脱细胞基质生物性的实验研究

目的：研究软骨脱细胞基质植入机体后其局部及重要脏器的反应。方法：将兔耳软骨行脱细胞处理。将12只SD大鼠分四组，实验组为脱细胞软骨；对照1组为新鲜软骨；对照2组为Vicryl；对照3组为硅胶条。将脱细胞处理及未处理的兔耳软骨、Vicryl和硅胶条分别植入鼠背部皮下，饲养至术后7，15，30天后处死取材，每次每组处死1只。取材的部位包括植入物及其周边组织，实验组同时取心、肺、肝、肾。标本以10％中性甲醛固定24h，常规HE染色。结果：脱细胞软骨周围有少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润，可见扩张的毛细血管，为炎性反应Ⅲ级。新鲜软骨周围有大量中性粒细胞浸润，其中可见不规则的钙化组织，为炎性反应Ⅳ级。硅胶和Vicryl均引发异物反应。实验组术后4周内心、肺、肝、肾四种器官无器质性改变。结论：脱细胞软骨基质具有良好的组织相容性，是一种潜在软骨的替代材料及软骨组织工程支架材料。     

异种关节软骨脱细胞基质支架的免疫反应研究

[目的]观察异种脱细胞软骨基质支架的免疫排斥反应,探讨其用于组织工程软骨支架的可行性。[方法]分别获取猪和新西兰大白兔的关节软骨,制作成:①猪脱细胞软骨支架;②猪未脱细胞软骨支架;③兔脱细胞软骨支架。将9只新西兰大白兔随机分成三组,分别在兔背部深筋膜与肌膜之间埋入:①异种(猪)脱细胞软骨支架;②异种(猪)未脱细胞软骨支架;③同种(兔)异体的脱细胞软骨支架,术后分组饲养。于术后1、2、4周分别取支架埋藏部位组织,进行普通病理观察及CD4+、CD8+T淋巴细胞免疫组织化学检测,并在术前和术后1周,2周,4周抽取外周血,分离检测血清中对支架产生的抗体的浓度(ELISA法)。[结果]所有新西兰大白兔无不良反应,细胞免疫显示异种(猪)和同种(兔)的脱细胞软骨支架及周围埋藏部位组织无明显淋巴细胞浸润,而异种未脱细胞组支架在埋入第4周时有明显淋巴细胞浸润,体液免疫显示术前后抗体浓度无明显差异(P0.05)。[结论]猪来源的脱细胞软骨支架用于异种移植时无免疫反应,从免疫学方面为异种脱细胞软骨支架的临床应用提供了可行性。     

软骨脱细胞基质的研制及其力学性质分析

目的 猪CACM的制作及其力学特征的检测。方法 切取猪软骨，采取TritonX－100、Teis-HCl液等4步法制取脱细胞的猪耳CACM。采用光镜、透射电镜、扫描电镜等对结构进行检测，同时对CACM进行力学检测。结果 肉眼观察，CACM与软骨除颜色略白外无差别。组织学HE染色，细胞隐窝已无细胞结构，阿尔新兰色呈淡染，阴性；透射电镜下CACM罗骨陷窝内已无细胞结构；细胞膜、核器均已溶解；扫描电镜下CACM基质纤维成分与正常软骨基质的胶原纤维在形态上无差异；力学试验，最大拉伸强度，最大拉伸比，猪耳软骨与其脱细胞基质比较及其弹性模量无统计学意义。结论 经TritonX-100为主的脱细胞处理方法可以脱去软骨的细胞成分，不改变软骨细胞基质的主要成分，不改变其原有力学性质。     

Repairing articular cartilage defects with tissueengineering cartilage in rabbits

Objective: To investigate the effect of cancellous bone matrix gelatin ( BMG ) engineered with allogeneic chondrocytes in repairing articular cartilage defects in rabbits. Methods: Chondrocytes were seeded onto three-dimensional cancellous BMG and cultured in vitro for 12 days to prepare BMG-chondrocyte complexes. Under anesthesia with 2.5% pentobarbital sodium (1ml/kg body weight), articular cartilage defects were made on the right knee joints of 38 healthy New Zealand white rabbits (regardless of sex, aged 4-5 months and weighing 2. 5-3 kg) and the defects were then treated with 2. 5% trypsin. Then BMG-chondrocyte complex ( Group A, n = 18 ), BMG (Group B, n = 10), and nothing (Group C, n = 10) were implanted into the cartilage defects, respectively. The repairing effects were assessed by macroscopic, histologic, transmission electron microscopic ( TEM ) observation, immunohistochemical examination and in situ hybridization detection, respectively, at 2, 4, 8, 12 and 24 weeks after operation. Results: Cancellous BMG was degraded within 8 weeks after operation. In Group A, lymphocyte infiltration was observed around the graft. At 24 weeks after operation, the cartilage defects were repaired by cartilage tissues and the articular cartilage and subchondral bone were soundly healed. Proteoglycan and type II collagen were detected in the matrix of the repaired tissues by Safranin-O staining and immunohistochemical staining, respectively. In situ hybridization proved gene expression of type II collagen in the cytoplasm of chondrocytes in the repaired tissues. TEM observation showed that chondrocytes and cartilage matrix in repaired tissues were almost same as those in the normal articular cartilage. In Group B, the defects were repaired by cartilage-fibrous tissues. In Group C, the defects were repaired only by fibrous tissues. Conclusions: Cancellous BMG can be regarded as the natural cell scaffolds for cartilage tissue engineering. Articular cartilage defects can be repaired by cancellous BMG engineered with allogeneic chondrocytes. The nature of repaired tissues is closest to the normal cartilage. Local administration of trypsin can promote the adherence of repaired tissues to host tissues. Transplantation of allogeneic chondrocytes has immunogenicity, but the immune reaction is weak.     

同种异体骨软骨移植修复关节软骨缺损的研究进展

同种异体骨软骨移植修复膝关节软骨和骨软骨缺损适用于大面积骨软骨缺损的修复,且不受缺损形状和面积的限制,在临床上已取得令人鼓舞的结果。现对国内外同种异体骨软骨移植修复关节软骨缺损的研究进展作一综述。     

Articular cartilage restoration with costal cartilage previously fused with bone

A novel procedure was developed for restoration of an articular cartilage defect using an autologous costal cartilage prepared with iliac bone, and the durability in vivo of this biologic construct was examined. First, an osteochondral complex was prepared (successful preparation, 67 of 80). Cancellous bone blocks isolated from the ilium of male Japanese White rabbits aged 5 months were implanted onto the surface of the costal cartilage before being tied by a pair of 3-0 silk thread sutures that were looped around the costal cartilage from behind. Second, 3 months later, the bone-attached costal cartilage was harvested and implanted into a full-thickness cartilage defect induced in a trochlear groove of the femur. All of the grafts were fixed to the recipient, maintaining its cartilage structure until 6 months (n = 28) and 12 months (n = 12) after implantation. However, when the costal cartilage without any bony portion was implanted into a similarly induced defect, 42% (10 of 24) were detached from the recipient before 12 months after implantation. The nontreated defect did not heal spontaneously to a satisfactory level (n = 12). These findings suggest that an osteochondral fragment, prepared by grafting cancellous bone onto costal cartilage, can be used for articular cartilage restoration.     

脱细胞软骨支架材料修复兔关节软骨缺损

目的 观察异种异体脱细胞软骨支架材料(ACM)复合同种异体兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)修复兔股骨内髁关节软骨缺损的效果.方法 (1)密度梯度离心和差速贴壁法获得原代兔BMSCs,选择第3代BMSCs作为种子细胞;(2)利用冷冻干燥、胰酶消化和化学去垢剂等方法制备脱细胞软骨支架材料;(3)3个月龄新西兰兔股骨内髁制备直径4 mm,深3 mm砌关节软骨缺损模型,24只新西兰兔以2个时间段随机分为3组,Ⅰ ACM-BMSCs组:第3代BMSCs 1×106个/ml与ACM于37℃5%CO2饱和湿度复合48 h;Ⅱ ACM组;Ⅲ空白对照组.(4)移植6、12周后大体及组织学观察,免疫组织化学染色观察修复组织Ⅱ型胶原,Wakitani评分评估修复效果.结果 (1)大体观察及组织学观察:6和12周Ⅰ组再生组织与正常关节软骨面平齐,修复部位表面较平整,界限模糊,接近正常软骨.Ⅱ组修复组织表面不平整并有明显下陷,修复组织全层可见成纤维样细胞,深层可见极少数透明软骨样细胞.Ⅲ组未见明显修复,肉芽组织形成伴成纤维样细胞增生;(2)Wakitani组织学评分可见在不同的时间段I组和Ⅱ组均低于Ⅲ组,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅰ组和Ⅱ组间组织学评分差异无统计学意义(P>0.05).(3)免疫组织化学:ACM-BMSCs组修复组织的细胞为软骨样细胞,可见柱状排列,周围软骨基质Ⅱ型胶原染色阳性.结论 以ACM为支架材料,同种异体BMSCs为种子细胞制备的组织工程化软骨对兔股骨内髁关节软骨缺损有修复作用,形成的新生软骨为透明软骨样组织.     

组织工程软骨对兔膝关节胫骨平台浅层全关节软骨缺损的修复作用

目的探讨组织工程软骨对兔膝关节胫骨平台外侧髁浅层全关节软骨缺损的修复作用，并检测其修复组织的软骨类型。方法取2周龄乳兔软骨细胞体外培养传代至第3代后，与人胎盘Ⅰ型胶原蛋白海绵复合后植入成年兔的胫骨平台外侧髁完全软骨缺损区，并设立空白对照组，分别于术后4、12、24周取材。观察修复效果。运用天狼星红染色检测Ⅰ型胶原，Ⅱ型胶原单克隆抗体检测Ⅱ型胶原的表达。结果实验组术后4周缺损表面未见明显的新生软骨形成，组织学切片上少数几个呈上皮样生长的软骨细胞，苏木素-伊红（HE）染色胞浆呈深蓝色，周围软骨基质染色成浅蓝色；12周，缺损表面有少量的新生软骨形成，组织学切片上可见软骨细胞呈边缘不规则的，小蜂窝状结构，软骨细胞周围有软骨陷窝形成；24周，缺损表面的新生软骨较4、12周的新生软骨明显，表面光滑，且与周围组织结合紧密，但仍存在部分缺损尚未修复，组织学切片上可见软骨细胞呈边缘不规则的，多层细胞的蜂窝状结构，软骨细胞周围有软骨陷窝形成，并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质。而对照组则均未见明显的修复；随着术后时间的延长，Ⅰ型胶原的表达呈逐渐减弱的趋势，而Ⅱ型胶原的表达呈逐渐增强的趋势。结论该方法制成的组织工程软骨对兔胫骨平台外侧髁全层软骨缺损有修复作用，运用该方法不能完全修复兔胫骨平台外侧髁软骨完全缺损；形成的新生软骨为透明软骨样组织。     

耳软骨整体再造鼻侧软骨的可行性分析

目的：以耳软骨为供区,探索整体再造鼻侧软骨的方法。方法：20具（40侧）尸体标本,取下耳软骨40枚,鼻侧软骨40枚。CT扫描后重建三维图像,测量鼻侧软骨各解剖分区的相关数据。设计耳软骨3个供区可整体移植再造同侧鼻侧软骨,测量相关的形态数据。结果：耳软骨3个供区的相关形态数据大于同侧鼻侧软骨的相应数据。结论：耳甲腔、耳屏及两者之间连接的峡部（CVIT区域）,三角窝、耳轮及两者的连接部（TFH区域）,耳甲艇、耳轮及两者之间的连接部分（CBH区域）可整体取下,修整后整体再造同侧鼻侧软骨。     

软骨代谢标志物对骨关节炎软骨改变的反映

目的研究血清中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原水平与骨关节炎严重程度间的关系,及对手术后软骨代谢改变的反映。方法研究对象包括65例膝骨关节炎患者及22名正常人。45例患者分别行不同方式手术治疗,术后半年复查。正常人及患者术前和复查时抽取静脉血,摄下肢负重位X线片。应用酶联免疫吸附方法检测血清样本中蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的水平。结果骨关节炎患者血清中蛋白聚糖及Ⅱ型胶原水平均显著高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。血清中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原水平在轻型骨关节炎组升高,在关节明显狭窄组水平最高,而在严重狭窄组明显降低。术后半年,全膝关节置换术组血清中蛋白聚糖水平较术前明显下降(P<0.05);截骨术组血清中Ⅱ型胶原水平较术前明显下降(P<0.05)。结论血清中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的水平与骨关节炎软骨的破坏程度、软骨细胞的合成反应及软骨的总量有关。蛋白聚糖和Ⅱ型胶原水平是反映软骨代谢改变的较敏感的指标。