应用多重聚合酶链式反应鉴别布鲁杆菌

目的 探讨应用多重聚合酶链式反应(Muhiple-PCR)进行布鲁杆菌株种型的鉴别.方法 以6株布鲁杆菌标准菌株(牛种、羊种、猪种、犬种、绵羊附睾种、沙林鼠种布鲁杆菌标准菌株)作为阳性对照,以大肠埃希菌O∶157和小肠结肠炎耶尔森菌O∶9作为阴性对照,待测布鲁杆菌株29株.先用布鲁杆菌属特异性聚合酶链式反应(BCSP31-PCR)扩增上述待测布鲁杆菌株,扩增结果为阳性的菌株再用Muhiple-PCR方法进行布鲁杆菌种型鉴别.结果 29株待测布鲁杆菌株BCSP31-PCR方法扩增均为阳性,进一步Multiple-PCR方法扩增均为阳性,其中有20株鉴定为羊种菌,5株鉴定为猪种菌、3株鉴定为牛种菌、1株鉴定为犬种菌.结论 Multiple-PCR方法是一种快速、特异、简便、低风险的布鲁杆菌种型鉴定方法.     

布鲁杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的 建立一种环介导等温扩增(LAMP)快速检测动物布鲁杆菌的方法.方法 使用Primer 4.0,针对布鲁杆菌外膜蛋白(OMP31)基因保守区设计4条特异引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,实现DNA的梯状等温扩增,并在此方法最适扩增条件优化的基础上,对其特异性、灵敏度进行实验,同时与普通PCR灵敏度进行比较,以及进行LAMP可视化实验.结果 本研究建立的检测方法对牛种布鲁杆菌(Brucella abortus,B.abortus)544A和104M、羊种布鲁杆菌(Brucella melitensis,B.melitensis)Rev-1和16M、猪种布鲁杆菌(Brucella suis,B.suis)S2和1330S、犬种布鲁杆菌(Brucellac anis,B.canis)RM6/66、绵羊附睾种布鲁杆菌(Brucela ovis,B.ovis)63/290、沙林鼠种布鲁杆菌(Brucella neotomae,B.neotomae)5K33检测阳性,而耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica,Y.enterocolitica)O∶9、大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)O157∶H7和沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typhimunum)47729检测阴性.LAMP法检出最低DNA浓度为8.5×10-8 mg/L,较普通PCR检测灵敏度高.检测结果既可以通过电泳判定也可以通过可视化判定.结论 本研究所建立的布鲁杆菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁杆菌的快速检测.     

大肠埃希菌O157:H7环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的建立肠出血性大肠埃希菌O157︰H7环介导等温扩增(LAMP)可视化快速检测方法。方法针对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157︰H7编码脂多糖rfbE基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,评价LAMP方法的特异性和灵敏性。结果建立的LAMP法对O157︰H7rfbE基因的最低检出限约为100copy/反应管,检测肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均为阴性。体系的扩增效率较高,可在40min内出结果。结论建立的基于颜色判定的EHEC O157︰H7LAMP检测方法具有特异、灵敏,设备要求简单等特点,适用于EHEC O157︰H7的快速检测。     

大肠埃希菌O157:H7环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的建立肠出血性大肠埃希菌O157︰H7环介导等温扩增(LAMP)可视化快速检测方法。方法针对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157︰H7编码脂多糖rfbE基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,评价LAMP方法的特异性和灵敏性。结果建立的LAMP法对O157︰H7rfbE基因的最低检出限约为100copy/反应管,检测肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均为阴性。体系的扩增效率较高,可在40min内出结果。结论建立的基于颜色判定的EHEC O157︰H7LAMP检测方法具有特异、灵敏,设备要求简单等特点,适用于EHEC O157︰H7的快速检测。     

应用免疫磁珠分离法及荧光定量PCR技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7

目的建立免疫磁珠分离法（immunomagnetic separation,IMS）联合荧光定量PCR（real-time PCR）技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfbEO157设计引物和荧光探针,建立real-time PCR检测体系,并检测其特异性及敏感性;用O157免疫磁珠特异性捕获标本菌液中的O157∶H7大肠埃希菌,结合real-time PCR对磁珠捕获菌细胞的DNA进行检测分析。结果 Real-time PCR检测结果显示,O157∶H7大肠埃希菌可产生荧光信号,而其他常见致病菌均未见明显荧光信号;采用IMS-real-time PCR方法检测标本,菌液含菌量为3.3×102CFU/mL时即可被检出,检测全过程需时约4h。结论 IMS-real-time PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、快速易操作等特点,该检测方法能提高O157∶H7大肠埃希菌的检出率和准确性,可用于标本的快速诊断、疾病监测和暴发疫情的病原学调查。     

衢州市带毒力因子肠出血性大肠埃希菌O157：H7的检测

目的了解衢州市家禽、家畜肠出血性大肠埃希菌O157:H7带菌情况和菌型分布特征,以制定相应的防治对策。方法6月份肠道传染病高发季节,采集动物粪便标本,对O157:H7菌株进行分离培养,并用PCR方法检测其毒力基因。结果共采集动物粪便标本300份,检出O157:H7菌16株,总带菌率为5.33%,其中牛、羊、猪带菌率较高,分别为20.83%、12.70%和3.61%。经PCR检测,检出的所有菌株均携带SLT2毒力因子,而SLT1与hly阴性。结论衢州市分离到带有毒力基因的肠出血性大肠埃希菌O157:H7,对人群健康构成了威胁,应加强O157:H7的综合监测。     

伤寒沙门菌菌毛操纵子stg基因的克隆及与上皮细胞的粘附作用研究

目的克隆伤寒沙门菌菌毛操纵子stg基因,在大肠埃希菌中表达;了解伤寒沙门菌stg与人上皮细胞的相互作用。方法根据大肠埃希菌保守基因序列设计引物,克隆stg成熟肽编码序列,连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中并观察与上皮细胞的粘附特性。结果成功克隆stg基因全长核苷酸序列,构建了pET32a/stg原核表达重组质粒。pET32a/stg重组质粒转化大肠埃希菌能较多出现在上皮细胞表面。结论成功克隆并表达了伤寒沙门菌菌毛操纵子stg基因,stg基因能促进沙门菌对上皮细胞的粘附,为进一步了解伤寒沙门菌菌毛操纵子stg的特性与功能奠定了基础。     

应用多重PCR方法检测大肠埃希菌O157：H8的初步研究

目的 研究一种快速、特异的检测大肠埃希菌（以下称大肠杆菌）O157：H7的复合PCR方法。方法 选用针对大肠杆菌O157：H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ）和溶血素（Hly)基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157：H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果 除质粒缺失株（933）外,其余11株O157：H7大肠杆菌均在361bp处有溶血素基因产物出现;而12株O157：H8大肠杆菌扩增后的两条志贺样毒素基因产物存在差异,其中6株在210bp、484bp处出现两条相应产物,3株仅有210bp一条SLT－Ⅰ基因产物,另3株仅有484bp的SLT－Ⅱ基因产物。其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌的扩增结果均为阴性。结论 本复合PCR方法具有较高的特异性,可迅速、有效地将O157：H7大肠杆菌与其它常见致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌相鉴别,通过进一步研究有望应用于临床大肠杆菌O157：H7感染的辅助诊断。     

我国分离的大肠埃希菌O157∶H7的毒力基因检测分析

目的了解我国部分省区分离的大肠埃希菌O157∶H7菌株特异基因和毒力基因携带特点及在不同动物宿主来源的菌株分布情况。方法采用PCR对分离菌株的O157、H7抗原特异基因rfbEO157、fliCH7以及stx1、stx2、eaeA和hlyA四种毒力基因进行检测。结果在1992-2006年收集的O157及H7抗原阳性的345株大肠埃希菌株中,rfbEO157、fliCH7特异基因均为阳性,eaeA和hlyA的阳性率分别为99.4%和99.1%,stx2的阳性率为91.9%,stx1阳性率仅为13.3%,stx1+stx2的阳性率为13.0%,来源于病人和动物菌株的stx2阳性率均高于stx1。检测菌株中毒力基因型以eaeA+hlyA+stx2为主。携带毒力基因的O157∶H7菌株在羊、牛等动物宿主中广泛存在。结论 stx2是病人及羊、牛等动物来源的产志贺毒素大肠埃希菌O157∶H7携带的主要毒素基因型。     

多重PCR方法检测EHEC和EPEC毒力基因

目的 建立简易实用的检测EHEC和EPEC多种毒力基因的方法。方法 应用多重PCR同时检测大肠埃希菌菌株的stx1、stx2、EPEC和EHEC共同的eaeA(eaeA-gen）等靶基因;用常规PCR检测EHEC O157特异的eaeA(eaeA-O157）基因,以区分EHEC和EPEC的eaeA基因。结果 对分别分离自美国和我国江苏的EHEC O157菌株以MPCR检测,stx1、stx2和eaeA-gen基因均阳性,同时常规PCR扩增eaeA-O157也阳性。在8株分离自杭州的志贺毒素阴性的大肠埃希菌O157菌株中,stx1、stx2和eaeA-O157基因均阴性,仅2株扩增出EPEC eaeA基因。在28株EPEC血清型、12株ETEC血清型、12株EIEC血清型大肠埃希菌菌株中,stx1和stx2基因均阴性;3株EPEC血清型菌株eaeA-gen基因阳性。结论 MPCR技术可同时检测菌株的stx1、stx2和eaeA基因,可为EHEC和EPEC感染的诊断及流行病学调查,提供一种简便、实用、经济的技术手段。     

牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗双重实时荧光定量PCR方-法的建立

目的 建立一种区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒感染株的双重荧光定量PCR方-法。方法 分别以布鲁氏菌4型分泌系统中VirB8基因、VirB12基因序列设计2对引物及探针,优化实时荧光PCR反应体系及条件。以牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株、大肠杆菌、沙门氏菌基因组DNA进行 Realtime-PCR扩增,评价该方-法特异性。分别构建布鲁氏菌VirB12基因和VirB8基因片段阳性质粒,10倍系列稀释后进行Realtime-PCR扩增,测定该方-法的敏感性。结果 本方-法具有良好的特异性,牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA同时出现VirB8基因与VirB12基因阳性扩增,牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株仅出现VirB8基因阳性扩增,大肠杆菌、沙门氏菌均未扩增出目的条带,对VirB8基因及VirB12基因片段阳性质粒的检测限分别为约10² copies/μL和10³ copies/μL。该方-法仅用于鉴别区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒株。结论 本研究建立的布鲁氏菌双重Realtime-PCR方-法,具有良好的特异性和敏感性,为今后鉴别牛种布鲁氏菌A19-△VirB12分子标记疫苗免疫牛与自然感染牛提供技术支撑。     

多重荧光定量PCR方法鉴定布鲁氏菌属及牛羊种布鲁氏菌研究

摘要：目的 利用多重实时荧光PCR技术,建立快速鉴定布鲁氏菌的方法。方法 根据布鲁氏菌特异性基因Bcsp31,AlkB/IS711和BMEI1162/IS711的部分片段作为靶基因,分别设计探针引物,将扩增产物连接到PUCm18-T载体上,制备标准品及标准曲线,确定此方法的灵敏度。利用布鲁氏菌的其他生物型菌株和同源性较近的致病菌（汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌、大肠杆菌O:157、大肠杆菌O:16、小肠结肠耶尔森菌O:9、沙门氏菌N群血清型、嗜麦芽假单胞菌）验证所建立方法的特异性。通过布鲁氏菌标准菌株建立方法,优化体系后扩增97株地方株进行验证。结果 应用多重Taqman荧光PCR技术检测布鲁氏菌结果显示,布鲁氏菌属、牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌有各自的荧光信号,而与其同源性较高的致病菌均未见荧光信号;由标准曲线可知该方法的单重和多重荧光PCR最低检测下限均约为102copy/μL（13-24fg /μL）,是常规PCR灵敏度的100倍。结论建立的方法有灵敏度高、快速易操作等优点,可用于布鲁氏菌快速鉴定,并同时确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。     

牛羊猪种布鲁氏菌快速鉴别PCR方法的建立及评价

目的 建立一种可在一个反应体系中同时鉴别布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的快速PCR鉴别方法。方法 将布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的扩增引物进行优化组合,建立全新的BAMS-PCR方法;随后对该方法的特异性和灵敏度进行评价,并对现场分离的219株布鲁氏菌进行鉴别,评价其在布鲁氏菌鉴别中的应用价值。最后,用该方法对临床标本中布鲁氏菌的DNA进行扩增,评价其在临床诊断中的实用性。结果 BAMS-PCR方法可在同一反应中同时鉴别布鲁氏菌及牛种(1,2,4型),羊种(1,2和3型)和猪种(1型)布鲁氏菌,并有较好的特异性和敏感性。布鲁氏菌属,牛种,猪种和羊种布鲁氏菌引物的检测灵敏度分别为10 pg/μL,100 pg/μL, 10 pg/μL和100 pg/μL。BAMS-PCR对219株临床分离菌株的鉴定结果和常规生物分型方法的鉴定符合率为100%。经BAMS-PCR检测,97份临床血清样本仅6份为阳性,全血和组织(羊脾)样本全部为阴性。结论 BAMS-PCR是一种简便、快速、高效、准确的布鲁氏菌鉴别方法,可作为临床分离菌株的首选鉴别方法。     

PCR检测布氏菌DNA的试验研究

目的 探讨编码牛种布氏菌同一蛋白基因序列不同扩增片断（分别为330bp、230bp和223bp）的3对引物检测布氏菌DNA PCR试验的特异性和敏感性。方法 用煮沸法和酚提取法分别从5个种布氏菌和耶尔森氏菌0：3、O：9、大肠菌O：157中提取DNA进行PCR试验。结果 通过此种方法可检测到小到1PG的布氏菌DNA。对布氏菌5个种的典型株进行DNA分析，并获得独有的相应片断。而2种与布氏菌SPP存在血清学交叉反应的革兰氏阴性细菌未检测到特异DNA片段。结论 3对引物均有良好的特异性和敏感性，但P5、P6稳定性稍差。     

基于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法的建立

目的 本文建立一种基于样品检测的特异性好、灵敏性高的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。方法 以哺乳动物beta-actin基因和外源重组质粒为内参,针对布鲁氏菌属特异性基因IS711,建立用于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及稳定性,绘制标准曲线。将该方法用于哺乳动物样品检测,并与细菌分离培养检测结果比较。结果 荧光定量PCR方法对布鲁氏菌检测有良好的特异性,3对引物对阴性对照菌均无非特异性扩增;该方法用于样品检测的最低检测限为17拷贝;内外源内参同时存在条件下,布鲁氏菌荧光定量PCR的标准曲线相关系数为R²=0.997(Y=-3.12X+40.9)。将该方法直接用于181份动物样本的检测,并与分离培养结果相比,荧光定量PCR检测阳性率为11.4%,细菌分离培养检测阳性率为9.9%,且细菌分离培养阳性样品与荧光定量PCR阳性样品中编号基本一致。结论 本文建立的荧光定量PCR检测方法灵敏性高、特异性及稳定性好,可直接应用于样品的检测,检测结果受内参基因质控。     

AMOS-PCR对布鲁氏菌种型鉴定的应用

目的评价AMOS-PCR方法鉴定布鲁氏菌种型的特异性和实用性。方法用已建立的AMOS-PCR方法在国内检测标准菌株和对国内分离的布鲁氏菌地方株种型进行检测。结果羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌1,2,4、猪种布鲁氏菌1型和绵羊附睾布鲁氏菌有特异条带。结论AMOS-PCR是一种快速、简便、特异的鉴定布鲁氏菌的方法之一。     

Simultaneous detection and differentiates of Brucella abortus and Brucella melitensis by combinatorial PCR

ObjectiveTo evaluate simultaneous detection and differentiates of Brucella abortus (B. abortus) and Brucella melitensis (B. melitensis) through the combinatorial PCR method.MethodsThis study was designed using three primers that could simultaneously identify and differentiate two major species of pathogenic Brucella in humans and animals. Identification and differentiation of each species using the size of the PCR product were determined. To determine the specificity of the method, bacteria close to the genus Brucella were used. Finally, to confirm PCR products, In addition to the products sequence, RFLP was performed on PCR products using restriction enzymes.ResultsThe method of optimized combinatorial PCR in this study could simultaneously detect and differentiate B. abortus and B. melitensis with high specificity and sensitivity in clinical samples. Differentiation of species is based on the resulting bands; therefore, the band 494 bp for B. abortus and 733 bp for B. melitensis were obtained. RFLP and sequencing results confirmed PCR results.ConclusionsThe results of this study shows that without routine diagnostic methods such as culture and serology tests, using the molecular method of combinatorial PCR, important species of Brucella can be simultaneously identified and differentiated in clinical samples.     

Simultaneous detection of the genus Brucella by combinatorial PCR

We have developed a combinatorial polymerase chain reaction (PCR) procedure to identify four major species of the genus Brucella simultaneously. Four pairs of primers targeting the genes encoding a cell surface protein (BCSP31) and outer membrane proteins (omp2b, omp2a and omp31) were prepared. PCR using these primers gave rise to specific patterns of amplification for each Brucella spp. examined in this study. B. abortus could be identified when fragments of BCSP31 and omp2b/2a were amplified by B. abortus-specific primers. B. melitensis could be identified by the amplification of fragments of BCSP31, omp2b/2a and omp31 using pair of primers B4/B5, JRF/JPR-ab and omp31. Identification of B. canis could be achieved when the amplicons of omp2b/2a were detected by B. canis-specific primers, as could the identification of BCSP31 and omp31. If specific amplifications occurred using all pairs of primers, the strain was identified as B. suis. Combinatorial PCR reported here thus appeared to be an ideal method of identifying Brucella spp., the causative pathogen of human brucellosis.     

Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification.

Suitable reaction conditions and oligonucleotide primers were sought for the detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by the polymerase chain reaction. Primers were chosen from within the coding sequence of a gene encoding a 31 kDa B. abortus antigen. The test was shown to be sensitive, and specificity was demonstrated using DNA derived from a panel of Gram-negative pathogens. There was no detectable difference between B. melitensis and B. abortus in the sensitivity of the reaction or in the size of the amplification product. The technique should be applicable in the diagnosis of brucellosis.     

内蒙古乌兰察布布氏菌分离株种型鉴定及流行病学特征分析

目的 鉴定临床分离布氏菌种型,并分析患者的流行病学特征。方法 以牛种、羊种、猪种标准参考菌株为试验对照,采用经典方法和VITEK2.0进行初步鉴定,用AMOS-PCR进行确证,并分析患者的流行病学特征。结果 经典鉴定115株均为羊种菌,羊3型93株,羊1型22株;115株菌ProA、TyrA、URE和GlyA全部阳性;91株ELLM阳性、14株APPA阳性,提示均为布氏菌,其中羊种菌91株,猪种菌14株。与经典实验的鉴定符合率比较鉴定布氏菌属100%,鉴定布氏菌种为79%(91/115);AMOS-PCR均获得了约731 bp的特异性扩增条带,证实全部为羊种菌。初诊患者84例,构成比为73%;临床表现以疼痛、发热、乏力、多汗居多;88例患者就诊前无用药史,2例有布病治疗史。结论 VITEK2.0是一种高效的布氏菌鉴定方法,但不能替代经典方法;羊种3型菌为该地区的主要流行菌种,再感染可能是慢性患者或有布病治疗史患者分离到布氏菌的主要因素,初诊、未用抗生素且症状典型是分离布氏菌的重要指标。