小鼠精原细胞的分离和纯化

目的　探讨小鼠精原细胞的分离纯化。　方法　用组合酶消化法制备 7～ 8d小鼠的生殖细胞悬液 ;用Percoll不连续密度梯度法分离精原细胞。　结果　所获细胞悬液内活细胞、死细胞及细胞团的百分比分别为90 .0 8%、9.92 %及 8.91% ;平均每个睾丸可获得 4.136× 10 5 个细胞 ;精原细胞主要分布于位于 2 7%～ 35 %间的Percoll梯度中 ,其超微结构与 7～ 8d小鼠睾丸切片内精原细胞的超微结构一致 ,经纯化后其纯度达 6 8.76 %。　结论　用组合酶消化、Percoll不连续密度梯度法分离的 7～ 8d小鼠的精原细胞能满足体外培养的需要     

胰岛移植研究进展

胰腺组织的移植,包括胰腺器官（胰腺）和胰岛细胞（胰岛）移植,已经被公认为是治疗1型糖尿病的一个临床选择。成功的胰腺或胰岛移植相对于传统的外源性胰岛素注射疗法来说,可以达到一个正常或接近正常的血糖控制水平和糖化血红蛋白水平,而且还不会出现胰岛素疗法经常出现的严重的低血糖反应。两种类型胰腺组织的移植,都可以有效的降低严重低血糖的事件发生。而且胰腺移植已经被证实可以长时间使血糖保持一种持续正常稳定的状态。对于接受胰腺移植的糖尿病患者,其优点是血糖可以很好的得到控制;但同时也。面临着出现手术以及移植后并发症的风险。与胰腺移植相比,成人胰岛细胞移植更加安全,手术简捷,并发症极少,并可多次重复进行;其更加吸引人的地方是它创伤性更小。而且。通过移植前的特殊培养．未来有望实现脱离免疫抑制剂的胰岛移植。不足之一是胰岛移植往往不能使血糖控制在一个稳定的水平,这一点对降低糖尿病并发症的发生往往又是必须的。另外,胰岛移植又使接受移植的患者不得不承受免疫抑制治疗带来的一系列不良反应。尽管新近的发展已使胰岛移植后脱离胰岛素治疗的比率有了很大提高．但是如何使移植物保持更长时间的活力和功能以更好的控制血糖,今后还有很多的事情要我们去做。本文将就近些年胰岛移植的一些相关内容做一简要综述,以期能给临床及科研工作者带来一定的启示。     

胰岛移植成功

2000年12月自然杂志报导：一种新的胰岛移植方法使Ⅰ型糖尿病患自身合成胰岛素成为可能。常规治疗Ⅰ型糖尿病控制患血糖是注射胰岛素。随着研究的深入,胰岛细胞移植可以调控患血糖浓度。以往研究证实接受胰岛移植的病人只有8％能产生胰岛素达1年以上,这是因为患不能获得足够有效的β细胞和有移植物排异,现用的免疫抑制方法(包括类固醇类),如糖皮质激素,可引起胰岛素抗性。     

小鼠胸腺树突状细胞的分离和纯化方法的改进

目的　探讨一种简便易行的小鼠胸腺树突状细胞（ＴＤＣ）的分离纯化方法。　方法　密度梯度离心结合小鼠ＣＤ５ 单克隆抗体（ｍ Ａｂ）淘洗法（ｐａｎｎｉｎｇ）。　结果　细胞浓度在１．５×１０７ ／ｍ ｌ时进行Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心可使分离纯度高、细胞丢失少；依次使用两种分离液分离的效果优于同一种分离液的反复使用；小鼠ＣＤ５单抗浓度为２５ｍ ｇ／Ｌ时，淘洗纯化效果较好，ＴＤＣ纯度达７５％ ～９０％ 。　结论　密度梯度离心与ＣＤ５单抗淘洗纯化的方法切实可行。     

小鼠睾丸支持细胞的体外分离和纯化

目的寻求简便经济的方法分离纯化小鼠睾丸支持细胞,提高其获取量。方法用0.1%的胶原酶和0.25%的胰蛋白酶次第消化准备7-8天小鼠生殖细胞悬液,置于37℃,5%CO2孵箱内培养,4小时后换液,24小时后向培养板内加入20 mmol Tris-HCl低渗处理3分钟,去除精原细胞,即得到高纯度的支持细胞。结果在小鼠睾丸支持细胞的分离培养中,支持细胞占培养细胞90%以上。结论应用本实验方法分离小鼠睾丸支持细胞获得成功并简化了国内现行的分离方法。     

Wistar大鼠胰岛细胞体外分离、纯化及鉴定

目的 探索Wistar大鼠胰岛分离纯化的最佳条件.方法 采用肝胰管内灌注胶原酶消化分离胰岛及Ficoll 400密度梯度离心纯化.纯化后的胰岛经组织学染色、电镜及放射免疫法鉴定其特异性和活力.结果 组织学染色显示纯化后胰岛的活力和纯度分别在95%和85%以上.电镜显示纯化后的胰岛形态完整,包膜清晰,分泌颗粒丰富.放射免疫结果表明,低糖组和高糖组分泌胰岛素的浓度有显著差异,证明胰岛功能良好.结论 肝胰管内灌注胶原酶消化法是一种好的消化方法.影响胰岛收获量的因素很多,例如胰腺的充分扩张,胶原酶的浓度和活性以及消化的时间等.     

糖尿病小鼠理想的胰岛移植部位

背景：胰岛移植到糖尿病小鼠不同部位影响胰岛移植成功率。 目的：比较糖尿病小鼠小网膜、肾被膜和腋窝3个部位胰岛移植效果,探索一个更理想的移植部位。 方法：应用淋巴细胞分离液分离纯化BALB/c小鼠胰岛;将胰岛移植到造模成功的糖尿病C57BL/6小鼠,按照不同的移植部位小网膜、肾被膜和腋窝进行对比观察。 结果与结论：分离纯化后获得高纯度胰岛,每只供体可获得胰岛(102±4)个,并具有良好生物活性;胰岛移植到糖尿病小鼠小网膜、肾被膜和腋窝3个部位后,均能降低血糖至正常范围,移植到小网膜与肾被膜的血糖值差异无显著性意义(P > 0.05),但均低于腋窝血糖值(P < 0.05)。移植后第7天,苏木精-伊红染色见小网膜部位移植胰岛形态基本完整,肾被膜部位移植胰岛形态不规则,腋窝部位移植物胰岛完全被破坏,伴炎症细胞浸润,小网膜和肾被膜降血糖效果优于腋窝。说明小网膜血供充足容量大,能够接纳较大体积的移植物,可能作为胰岛移植的理想部位。     

大鼠胰岛分离纯化及其小鼠肾被膜下移植排斥反应的研究

目的:探讨胰岛分离技术和异种胰岛移植排斥反应机制。方法:在控制不同条件的情况下,使用胰管内胶原酶灌注和不连续密度梯度纯化法获取大鼠胰岛,行小鼠肾被膜下移植,分别于术后当日和第3,5,7天取出移植物,分析排斥反应情况。结果:纯化后平均获取500+67个胰岛/胰腺,纯度约在70％～80％。统计学分析高糖和茶碱对胰岛刺激引起的胰岛索分泌,提示纯化后的胰岛功能良好。在未使用免疫抑制剂的情况下,植入的胰岛多在1周内完全排斥掉。术后5天,胰岛的形态已被破坏,淋巴细胞大量增多;术后第7天见不到完整的胰岛轮廓,仅见大量的淋巴细胞浸润。结论:严格控制各种实验条件,完善分离纯化技术,是优化胰岛获取的关键。大鼠胰岛小鼠肾被膜下移植中树突状巨噬细胞参与了排斥反应过程。     

成人睾丸支持细胞分离方法的建立及在胰岛移植中的应用

目的:建立成人睾丸支持细胞简便高效分离方法,并应用于胰岛移植。方法:A组采用胰蛋白酶、DNA酶、胶原酶、透明质酸酶一步消化法;B组采用胰蛋白酶和DNA酶第一步消化,胶原酶和透明质酸酶第二步消化;C组采用胰蛋白酶和DNA酶第一步消化,透明质酸酶第二步消化,胶原酶第三步消化。采用形态学观察和免疫组化鉴定支持细胞;MTT法和流式细胞术(FCM)测定3组支持细胞的活性和纯度;Western blot检测3组支持细胞Fas-L的表达;比较3组支持细胞与胰岛共移植至糖尿病鼠的效果。结果:经鉴定,分离的细胞具有支持细胞的特征;方法A和B分离的支持细胞数量较多,方法B和C分离的支持细胞杂质较少;MTT法检测结果显示,B组支持细胞活性显著高于A组和C组(P0.05);Western blot结果显示,B组支持细胞Fas-L的表达水平显著高于A组和C组(P0.05);FCM检测3种方法分离的S支持细胞纯度分别为(85.2±1.8)%、(92.3±2.5)%、(93.1±2.6)%,B组和C组的支持细胞纯度显著高于A组(P0.05);将3组支持细胞与胰岛共移植至糖尿病鼠模型肾包膜下,B组胰岛移植物存活时间显著高于单独胰岛移植组和A、C两组(P0.05)。结论:采用两步消化法能够获得纯度和活性较高的支持细胞,其与胰岛共移植能够显著延长移植物存活。     

α1-抗胰蛋白酶在胰岛移植和Ⅰ型糖尿病中的作用

世界范围内,糖尿病患病率呈急剧上升趋势,而Ⅰ型糖尿病的患病率每年就增加约2%～5%.Ⅰ型糖尿病是由于T细胞介导的自身免疫破坏β细胞而引起,胰岛β细胞功能持续恶化是一种不可逆的过程.因此,科学家们将目光投向了替代和恢复胰岛β细胞功能治疗上.虽然胰岛细胞移植可以纠正Ⅰ型糖尿病患者的代谢紊乱,在短时间内达到停用胰岛素的目的,但在胰岛移植治疗的各个环节上仍面临供体缺乏、免疫排斥等问题.     

微囊化大鼠胰岛细胞移植治疗糖尿病小鼠的实验研究

观察微囊化和未囊化大鼠胰岛细胞移植治疗糖尿病小鼠的疗效。选用SD大鼠经胆总管原位灌注胶原酶液,分离消化胰腺组织,用淋巴细胞分离液(Histopaque-1077)纯化胰岛细胞,将微囊化和未囊化大鼠胰岛细胞移植于糖尿病小鼠腹腔。分离的胰岛细胞对刺激反应良好,微囊化和未囊化胰岛细胞移植后均可纠正糖尿病小鼠的高血糖状态,但未囊化胰岛细胞移植组只能维持血糖正常2~3d,而微囊化胰岛细胞移植组可持续降低血糖30d以上。微囊化胰岛细胞移植治疗糖尿病小鼠具有良好的效果,微囊具有较好的免疫隔离作用。     

糖尿病小鼠胰岛β细胞结构的光镜和电镜研究

目的观察2型糖尿病模型db/db小鼠胰岛β细胞的超微结构、胰岛素表达及数量变化,探讨β细胞的病理改变与2型糖尿病病因的关系。方法分别选取3、5、8月龄尾静脉空腹血糖高于10.1mmol/L,且肥胖的db/db自发性糖尿病小鼠,每组8只,作为糖尿病组;选取相应年龄段尾静脉空腹血糖低于6.0mmol/L,体重正常的db/+m表型正常小鼠,每组8只,作为对照组。于相应年龄段取胰尾,用于透射电镜观察、免疫组织化学观察和图像分析。结果电镜下随病情进展,db/db小鼠胰岛β细胞内的分泌颗粒数量明显减少,有的细胞甚至缺如,致密芯电子密度降低,β细胞可见凋亡的早期改变以及细胞核和细胞器的病理改变,细胞间髓样小体增多。免疫组织化学显示同月龄糖尿病组小鼠胰岛β细胞阳性率和胰岛素蛋白平均光密度值(OD值)低于相应对照组(p<0.05),且随着病程的进展,db/db小鼠胰岛β细胞阳性率和胰岛素表达呈现递减趋势(p<0.05)。结论2型糖尿病β细胞的超微结构遭到破坏,引起β细胞合成分泌胰岛素障碍和数量减少,与2型糖尿病病情的轻重有关,反映了2型糖尿病病程不同阶段的病机特点。     

早孕因子分离纯化方法的优化

目的对正常早孕妇女血清中早孕因子(EPF)的分离纯化过程进行优化,以提高EPF的回收率。方法依次采用DEAEFast Flow离子交换色谱和Heparin Fast Flow亲和色谱,从妊娠12周内的正常早孕妇女混合血清中提纯EPF,采用活性玫瑰花结抑制试验(Ea-RIT)检测各阶段产物的EPF活性,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳鉴定纯化物并测定其相对分子质量,用Western blot鉴定其特异性。结果经Ea-RIT检测后,DEAE Fast Flow离子交换色谱所现2峰中DE-Ⅰ峰为EPF活性峰,HeparinFast Flow亲和色谱所现2峰中H-Ⅱ峰为EPF活性峰。H-Ⅱ峰收集液经SDS-PAGE电泳,结果显示为1条相对分子质量为38 100的蛋白带,Western blot分析表明抗体与抗原匹配性良好。经检测其蛋白含量为0.615 mg,回收率为0.034%,与传统分离纯化四步法的回收率相比明显提高。结论本优化方法对于提纯孕血清中的EPF是可行的,大大提高了纯化效率。     

适量饮用贵州某食用白酒对Ⅰ型糖尿病小鼠胰岛β细胞的影响

目的:探讨摄入贵州某食用白酒对Ⅰ型糖尿病小鼠胰岛β细胞可能的影响及相关机制。方法:正常雄性C57BL/6J小鼠通过灌胃饮酒及注射链脲佐菌素建立单纯饮酒、糖尿病、糖尿病饮酒模型,测空腹血糖,通过免疫组织化学、real-time PCR、图像分析及形态计量法观察胰岛β细胞分泌胰岛素及胰岛素mRNA表达的改变。结果:糖尿病组及糖尿病饮酒组小鼠空腹血糖升高,达到小鼠糖尿病成模标准。单纯饮酒组小鼠血糖、β细胞平均光密度、面数密度、胰岛素mRNA相对表达量无明显变化。糖尿病组及糖尿病饮酒组β细胞平均光密度值短暂升高,面数密度与胰岛素mRNA相对表达量逐渐降低。结论:在本实验设定的时程和剂量内,单纯饮用该白酒对胰岛β细胞无明显影响。适量饮用该白酒并未加重Ⅰ型糖尿病小鼠胰岛β细胞的损伤。     

小鼠胰岛内分泌细胞的构成及其与Ⅱ型糖尿病的关系

目的观察和分析II型糖尿病动物模型db/db小鼠病程进展中胰岛内分泌细胞的构成变化及与II型糖尿病病因的关系。方法分别选取3、5、8、10和12月龄的尾静脉空腹血糖高于10.0mmol/L且肥胖的db/db自发性糖尿病小鼠,每组5只,作为糖尿病组;选取相应年龄段的尾静脉空腹血糖低于6.0mmol/L体重正常的db/+m表型正常小鼠,每组5只,作为对照组。于相应年龄段取胰尾,用于免疫组织化学观察和比较。结果各月龄糖尿病组胰岛B细胞(胰岛素阳性细胞)阳性率低于对照组(p<0.05),而A细胞(胰高血糖素阳性细胞)和D细胞(生长抑素阳性细胞)阳性率分别高于对照组(p<0.05)。糖尿病组胰岛B细胞阳性率随自发性db/db糖尿病小鼠病程进展呈降低趋势(p<0.05),而A细胞和D细胞阳性率则呈增高趋势(p<0.05);对照组3种细胞阳性率无变化(P>0.05)。结论II型糖尿病动物模型db/db小鼠胰岛内分泌细胞的构成变化与糖尿病病情的轻重有关,胰岛内分泌细胞之间的比例失衡可能与II型糖尿病的发病有关。     

小鼠胰岛内分泌细胞的构成及其与‖型糖尿病的关系

目的 观察和分析Ⅱ型糖尿病动物模型db/db小鼠病程进展中胰岛内分泌细胞的构成变化及与Ⅱ型糖尿病病因的关系.方法 分别选取3、5、8、10和12月龄的尾静脉空腹血糖高于10.0mmol/L且肥胖的db/db自发性糖尿病小鼠.每组5只,作为糖尿病组;选取相应年龄段的尾静脉空腹血糖低于6.0mmol/L体重正常的db/+m表型正常小鼠,每组5只,作为对照组.于相应年龄段取胰尾,用于免疫组织化学观察和比较.结果 各月龄糖尿病组胰岛B细胞(胰岛素阳性细胞)阳性率低于对照组(p＜0.05),而A细胞(胰高血糖素阳性细胞)和D细胞(生长抑素附性细胞)阳性率分别高于对照组(p＜0.05).糖尿病组胰岛B细胞阳性率随自发性db/db糖尿病小鼠病程进展旱降低趋势(p＜0.05),而A细胞和D细胞阳性率则旱增高趋势(p＜0.05);对照组3种细胞阳性率无变化(P＞0.05).结论 Ⅱ型糖尿病动物模型db/db小鼠胰岛内分泌细胞的构成变化与糖尿病病情的轻重有关,胰岛内分泌细胞之间的比例失衡可能与Ⅱ型糖尿病的发病有关.     

肺泡Ⅱ型细胞的分离与纯化

分离与纯化肺泡Ⅱ型细胞,可广泛用于肺的病理生理,生物化学和分子主物学的深入研究.本文介绍了经肺循环灌洗和支气管灌洗后,再用弹性蛋白酶消化,lgG纯化肺泡Ⅱ型细胞的方法,采用这种方法,可从一只体重100～120g的健康Wistar大鼠获得肺泡Ⅱ型细胞2O×10~6个,存活率为90～95%.     

外周血中性粒细胞的分离方法

外周血中性粒细胞的分离方法刘文超，刘智广，张晓楠，田俊士，胡家露，张学庸（第四军医大学西京医院消化内科，第四军医大学西京医院临床输血科，第四军医大学西京医院校中心实验室，西安７１００３２）中性粒细胞是短命细胞，其合成能力有限，缺少修复能力。同时，一旦...     

β胰岛细胞表面GAD的表达决定NOD小鼠自身免疫型糖尿病的发病

型糖尿病 ,是一种由 T细胞介导的 β胰岛细胞损伤引起的自身免疫型疾病。许多学者认为 GAD是自身抗原最可能的候选者 ,但一直缺少确切的证据。本文作者将 GAD的反义基因转移到人类 型糖尿病的动物模型 NOD小鼠染色体 DNA上 ,建立 β胰岛细胞缺失表达 GAD的 NOD小鼠品系。利用这种转基因小鼠 ,作者研究了 β胰岛细胞上 GAD的表达与 NOD小鼠糖尿病发病的确切关系。作者将两种不同变异型的小鼠 GAD c DNA的反义基因转移到 NOD小鼠的胚系细胞上 ,然后将这些干细胞植入雌性 NOD鼠 ,经传代得到六个表达 GAD反义基因的转基因NOD…     

锌转运体家族成员在小鼠胰岛内的分布与表达

目的研究锌转运体(zinc transporter,Zn T)家族成员在小鼠胰岛内的分布与表达,为进一步探讨Zn T参与胰岛锌离子稳态的调节和糖尿病的发病机理奠定基础。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real time-PCR)和免疫组织化学方法检测Zn T1-Zn T10 m RNA和蛋白在8-10周龄CD1小鼠胰腺中的表达水平及分布。结果Real time PCR结果显示,除Zn T10以外,Zn T1-Zn T 9 m RNA在CD1小鼠胰腺中均有表达,Zn T8 m RNA在胰腺中表达水平最高,Zn T3 m RNA在胰腺中表达最低,其余Zn Tm RNAs表达水平相近。免疫组织化学结果表明,Zn T1-5、Zn T7和Zn T8均在胰岛细胞的细胞质呈不同程度的免疫染色。结论多个Zn T家族成员在胰岛细胞中有表达,为探讨Zn T在糖尿病发病中的作用提供了理论基础。