SOD1真核表达载体的构建及表达

目的:构建人铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因真核表达载体,并在HeLa细胞中进行表达。方法:应用RT-PCR从人外周血中扩增SOD1基因开放阅读框(ORF),采用TA克隆技术,将目的片段插入到pUCm-T载体中进行鉴定,重组的质粒命名为pUCm-T-SOD1。随后,将SOD1进一步克隆到真核表达载体pTracer-CMV/Bsd中。用脂质体将经过测序、验证的重组pTracer-CMV/Bsd-SOD1质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,转染HeLa细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选4周,用RT-PCR、Western blot检测SOD1的表达。结果:成功构建了pTracer-CMV/Bsd-SOD1真核表达质粒,转染HeLa细胞,发现转染成功的细胞均发绿色荧光;RT-PCR及Western blot检测结果表明,所转染的SOD1在HeLa细胞中成功表达。结论:成功构建了能够同时表达绿色荧光蛋白和SOD1的真核表达质粒pTracer-CMV/Bsd-SOD1,为进一步研究SOD1在基因治疗中的作用奠定了基础。     

截短型人凋亡诱导因子AIF1-400对HeLa细胞的促凋亡作用

目的:观察人截短型AIF(AIF△1-400)对HeLa细胞的促凋亡作用。方法:在AIF△1-120基因克隆成功的基础上进一步改造,构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域(1～400位氨基酸)编码序列的AIF△1-400基因,将其克隆入pcDNA3真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,通过Western blot检测该基因在转染细胞中的表达通过电镜观察截短型分子对肿瘤细胞的具有促凋亡活性。结果:经酶切鉴定与测序证实,AIF△1-400的真核表达载体构建成功。通过Western blot证实截短型基因在HeLa细胞中表达,电镜观察可见转染细胞骨架的破坏和细胞核固缩等凋亡特征。结论:人截短型AIF(AIF△1-400)基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

截短型人凋亡诱导因子AIF△1-400对HeLa细胞的促凋亡作用

目的：观察人截短型AIF（AIF△l-400）对HeLa细胞的促凋亡作用。方法：在AIF△l-120基因克隆成功的基础上进一步改造，构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域（1～400位氨基酸）编码序列的AIF△l-400基因，将其克隆人pcDNA3真核表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过Western blot检测该基因在转染细胞中的表达通过电镜观察截短型分子对肿瘤细胞的具有促凋亡活性。结果：经酶切鉴定与测序证实，AIFAl-400的真核表达载体构建成功。通过Western blot证实截短型基因在HeLa细胞中表达，电镜观察可见转染细胞骨架的破坏和细胞核固缩等凋亡特征。结论：人截短型AIF（AIF△l-400）基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

真核表达载体PcDNA3.1-BDNF的构建及其在骨髓基质细胞中的表达

目的研究基因真核表达载体PcDNA3.1-BDNF的构建及其在骨髓基质细胞的转染和表达情况。方法以挪威大鼠BDNFcDNA为模板,PCR扩增BDNF全长编码基因,亚克隆至PcDNA3.1表达载体。将构建的重组质粒测序并通过脂质体转染到骨髓基质细胞中,RT-PCR鉴定BDNF基因的表达,Western blot检测BDNF蛋白的表达。结果 BDNF基因成功克隆到表达载体PcDNA3.1中,酶切鉴定片段为800bp,Western blot检测到BDNF在骨髓基质细胞呈阳性表达。结论真核表达载体构建成功,BDNF转染BMSCs后可稳定、高效表达。     

EGFP-Sam68融合蛋白在HeLa细胞的表达和定位

目的克隆有丝分裂Src相关蛋白p68(Sam68)基因cDNA全长,构建Sam68真核绿色荧光蛋白表达载体,并确定其在HeLa中的表达和定位。方法提取HeLa细胞总RNA,RT-PCR扩增Sam68基因片段,经酶切鉴定及测序正确后,克隆到真核绿色荧光蛋白表达载体(pcDNA3.0-EGFP)上,并转染HeLa细胞,Western blot法检测Sam68表达,免疫荧光细胞化学染色观察其细胞定位。结果酶切和测序证实Sam68正确插入pcDNA3.0-EGFP载体中,且载体正确表达了EGFP-Sam68融合蛋白,该蛋白定位在HeLa细胞核内。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-EGFP-Sam68。     

人TSARG4真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

目的: 构建人TSARG4基因真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染TSARG4的HeLa细胞系.方法: 应用 RT-PCR从人睾丸中扩增TSARG4的开放阅读框(ORF),并将 PCR产物插入到pUCm-T载体中测序验证.随后,将TSARG4进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中.用脂质体将经过测序、验证的pcDNA3.1(+)/TSARG4质粒转染HeLa细胞,通过G418筛选建立TSARG4稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交技术检测TSARG4在稳定转染的HeLa细胞系中的表达.结果: 成功构建了pcDNA3.1(+)/TSARG4表达质粒,建立了稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交检测结果表明,TSARG4基因在该细胞系中成功表达.结论: TSARG4真核表达载体成功构建和稳定转染HeLa细胞系的建立为进一步体外研究TSARG4的功能奠定了基础.     

大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建大鼠CD36真核表达载体,并在293T细胞中表达.方法:应用RT-PCR技术,从大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞提取的总RNA中,获得CD36基因编码序列片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,通过荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达.结果:酶切和测序证明重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36构建成功,荧光显微镜及Western blot确认目的基因序列在293T细胞中过表达.结论:成功构建大鼠CD36基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36,并在293T细胞中过表达.     

利用RNAi抑制FHL2基因的表达

目的:构建FHL2基因的siRNA真核表达载体,观察其对FHL2蛋白表达的影响.方法:利用RNAi干扰技术,设计并合成了两条针对FHL2基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo上.将重组质粒和带FLAG标签的FHL2共转染293T人胚肾细胞,通过Western blot实验检验RNAi干扰效应.结果:经过酶切和测序证明,成功构建了FHL2 siRNA真核表达载体.通过Western blot证明,构建的siRNA能有效抑制FHL2基因的表达.结论:成功地构建了FHL2基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效地抑制FHL2基因的表达.     

人截短型凋亡诱导因子的表达对HeLa细胞的促凋亡作用

目的：观察人截短型AIF基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用。方法：用RT-PCR法分段克隆全长人AIF基因，经改造截去其N-端线粒体定位信号及部分Spacer区域（1-120位氨基酸）的编码序列，从而获得人截短型AIF（AIF△1-120）基因。将其克隆入pIRES2-EGFP绿色荧光蛋白（EGFP）共表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过荧光显微镜观察。免疫组织化学检测，间接免疫荧光检测，电镜观察等方法。检测目的基因在转染细胞中的表达，以及对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果：成功地构建了人截短型AIF（AIF△1-120)基因的真核表达载体。转染HeLa细胞后，可检测到人截短型AIF分子的表达，随着转染后时间的延长，可观察到表达人截短型AIF分子的HeLa细胞呈现典型的凋亡特征。结论：人截短型AIF基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

pcDNA3.1-Smac真核表达载体的构建及表达

目的:构建人的smac基因真核表达载体pcDNA3.1-Smac,并在肺腺癌A549细胞中表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人睾丸组织中扩增到smac基因,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Smac.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至肺腺癌A549细胞中.采用RT-PCR、Western blot法检测外源基因smac的表达,MTT法检测细胞生长抑制率.结果:PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人smac基因克隆及真核表达载体peDNA3.1-Smac构建成功.在mRNA水平和蛋白水平,转染后的细胞中外源基因smac表达均明显增加.转染smac质粒72 h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组显著增加.结论:成功构建重组真核表达载体peDNA3.1-Smac,并在肺癌A549细胞中进行了表达;验证了转染后对肺癌细胞生长有抑制作用.     

miR-145在转染的HeLa细胞中的表达及其对CDK6的靶向抑制

目的构建miR-145高效表达载体,研究其对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法人工合成miR-145基因序列,构建真核重组质粒pcDNATM6.2-GW-miR-145,并转染HeLa细胞,将HeLa细胞分为转染miR-145组、空载体组和未经处理的HeLa细胞组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法分别检测miR-145及其下游靶基因细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)在各组中的表达,采用MTT法检测miR-145对HeLa细胞增殖活性的影响。结果经测序和qRT-PCR分析鉴定证明重组质粒pcDNATM6.2-GW-miR-145构建成功,qRT-PCR和Western blot结果显示转染miR-145组的HeLa细胞中CDK6的表达水平明显降低,MTT试验结果显示转染miR-145的HeLa细胞其增殖活性明显受到抑制(P0.05)。结论成功构建miR-145真核表达载体pcDNATM6.2-GW-miR-145,miR-145能够抑制宫颈癌HeLa细胞中CDK6的表达。     

小鼠Prohibitin真核表达质粒的构建及在293T细胞中的表达

目的构建小鼠Prohibitin基因真核表达质粒,在293T细胞中进行表达鉴定,为研究小鼠Prohibitin基因功能奠定基础。方法以小鼠Prohibitin基因cDNA序列为模板,设计特定引物,应用PCR的方法扩增其编码序列全长,并将其克隆到真核表达载体pEFP-C2中,将获得的重组表达质粒转染293T细胞,应用RTPCR、Western blot方法检测其表达。结果成功构建了pEGFP-Prohibitin真核表达质粒,将其成功转染293T细胞,pEGFP-Prohibitin转染组Prohibitin蛋白和mRNA在293T细胞的表达量比转染空载转染组明显增加。结论成功构建了真核表达质粒pEGFP-Prohibitin,并在真核细胞表达良好,为研究小鼠Prohibitin的基因功能奠定了基础。     

RNA干扰沉默HIF-1α基因对宫颈癌HeLa细胞定植和侵袭的影响

目的探讨HIF-1α基因短发夹干扰RNA(shRNA)低氧条件下对宫颈癌HeLa细胞定植和侵袭能力的作用。方法针对HIF-1α基因设计并合成2条寡聚DNA片段,退火后将其克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒中,构建shRNA真核表达质粒,脂质体转染人宫颈癌细胞株HeLa细胞。低氧培养后,应用Western blot和定量PCR法检测HIF-1α蛋白及mRNA表达水平;用软琼脂克隆形成实验和体外侵袭实验检测HeLa细胞的定植和侵袭能力。结果成功构建的HIF-1αshRNA真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞,低氧条件下HeLa细胞的HIF-1α蛋白及mRNA表达下降;同时细胞在软琼脂中克隆形成数和穿透Matrigel膜的细胞数减少。结论HIF-1α的shRNA真核表达载体在低氧条件下可抑制宫颈癌细胞的定植和侵袭能力。     

赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础.方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32.脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot检测目的基因的表达.结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达.结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据.     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

GFP-hERα重组质粒的构建及蛋白表达和细胞内定位的研究

目的 构建hERα真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 以pcDNA3.1-flaghERα仅重组质粒(Dr.Muyan M馈赠)为模板,PCR扩增hER α全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体.将构建的重组质粒测序并转染到乳腺癌细胞MCF-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利...     

PAK2真核表达载体的构建及在胃癌细胞内的表达与定位

目的 构建PAK2真核表达载体及证实在胃癌细胞内的表达与定位.方法 提取HeLa细胞的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增PAK2全长编码基因,克隆至pcDNA3.1A表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,Western blot检测蛋白表达,免疫荧光检测PAK2在胃癌细胞内的定位.结果...     

STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用.方法:根据siRNA设计原则, 结合pSilencer2.1-U6-neo质粒特点, 针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段, 退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒, 脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞.RT-PCR和Western blot检测SiHa细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平;MTT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡.结果:成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体, 转染人宫颈癌SiHa细胞.细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降;同时SiHa细胞增殖能力下降, 细胞凋亡增加.结论:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达, 抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力, 诱导细胞凋亡.     

FBXO6基因真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的 构建F盒蛋白6(FBXO6)基因真核表达载体.方法 采用PCR方法合成含有EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切位点的FBXO6 cDNA全长.分别构建载体pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6,采用菌落PCR、双酶切鉴定以及测序证实cDNA片段大小和序列正确.将载体pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6分别转染HEK293T细胞,Western blot法检测FBXO6蛋白的表达.结果 pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6包含大小、序列正确的FBXO6片段;FBXO6蛋白在转染pEGFP-C1-FBXO6的293T细胞中高表达;在转染pEGFP-C1-anti-FBXO6的HEK293T细胞中表达降低.结论 成功构建FBXO6基因正义真核表达载体pEGFP-C1-FBXO6和反义真核表达载体pEGFP-C1-anti-FBXO6.     

hLMO4基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建hLMO4真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法提取人乳腺癌MCF-7细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hLMO4全长编码基因,亚克隆至pCDNA3.1-myc-hisA表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞BGC823中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位。结果hLMO4全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-hisA中,酶切鉴定片段为500bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为23KD。pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位以细胞核为主,在细胞浆内少量表达。结论成功的构建了hLMO4全长基因真核表达载体,pEGFP-LMO4蛋白定位于乳腺癌细胞质和核内。