The effects of antisense PTEN gene transfection on the growth and invasion of glioma cells

Objective:To study the effects of antisense PTEN gene on the growth and invasion of glioma cells. Methods: A pcDNA3. 1/Hygro(-) recombinant plasmid containing antisense PTEN gene fragment was constructed. Glioma cells of primary culture were transfected with antisense PTEN gene vector and stably transfected clones were selected. Then, the different growth and invasion abilities and the different MMP9 mRNA expressions of three kinds of cells were observed, including the transfected cells, untrans-fected cells and the cells transfected with empty vector. Results:The abilities of growth and invasion of the transfected cells and the expressions of MMP9 mRNA were obviously enhanced. Conclusion: Antisense PTEN gene could have a negative impact on the growth and invasion of primary culture glioma cells.     

人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（hTRT）反义基因治疗对胃癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 采用基因重组技术,构建hTRT正比、反义真核表达载体,采用脂质体法导入SGC－790细胞、反义真核表达载体,并导入SGC－790胃癌细胞株中,获得稳定表达正、反义基因的细胞系7901－S、7901－AS1和7901－AS2。7901－AS1和7901－AS2出现显著生长抑制现象,端粒酶活性明显下降,细胞凋亡增加,异型性减小,G0／G1期细胞增加,S和G2M期细胞减少,增殖指数减小,软琼脂中克隆形成,裸鼠体内成瘤消失。结论 hTRT反义基因治疗可以明显抑制SGC－7901细胞的增殖,部分逆转肿瘤细胞的恶性表型,其机制可能主要是通过诱导细胞分化而非诱导细胞凋亡途径实现的,提示hTRT基因可以作为肿瘤治疗的靶基因。     

CD/5-FC自杀基因治疗系统体外杀伤恶性人脑胶质瘤细胞作用的研究

目的：探讨胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）自杀基因治疗系统对恶性人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法：采用Lipofectamine2000脂质体介导法将CD基因转染U251恶性人脑胶质瘤细胞,G418筛选获得抗性克隆（取名为U251/CD细胞）,使用不同浓度的5-FC作用于U251/CD细胞,MTT法测定活性细胞比率。采用高效液相色谱法（HPLC）检测5-FC培养液内5-FU的浓度。结果：U251细胞获得了质粒的成功转染。基因转染使G418抗性细胞（U251/CD细胞）对5-FC高度敏感。未转染的U251细胞对5-FC不敏感,IC50 约为6 500 μmol/L,而转染基因后 IC50 约为10 μmol/L。并且加入不同浓度的5-FC后,U251/CD细胞培养液内均能检测到5-FU。结论：5-FC对CD基因修饰U251细胞具有杀伤作用;为胶质瘤基因治疗的在体研究提供依据。     

短发夹RNA沉默hTERT基因抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤生长的实验研究

目的研究靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹RNA（shRNA）对裸鼠人脑胶质瘤中hTERT基因表达的抑制作用,以及影响肿瘤增殖并诱导细胞凋亡的作用,为脑胶质瘤的基因治疗探讨新的依据。方法体外培养人脑胶质瘤U251细胞株,建立人脑胶质瘤裸鼠皮下接种模型。将成功造模的36只裸鼠随机分为3组（每组12只）。hTERT shRNA组肿瘤体内原位注射hTERT质粒shRNA（pshRNA）20μg＋脂质体60μl＋PBS;PBS组肿瘤体内原位注射PBS 150μl;空质粒组肿瘤体内原位注射空质粒20μg＋脂质体60μl＋PBS。观察肿瘤生长情况。苏木精-伊红染色观察肿瘤组织的病理改变,Western blot检测hTERT蛋白的表达,钙依赖性磷脂结合蛋白V＋碘化丙啶双染流式细胞仪测凋亡率。结果成功建立稳定的裸鼠U251细胞皮下移植瘤模型。治疗5周后hTERT shRNA组肿瘤体积较PBS组和空质粒组明显缩小,抑瘤率为58.2%;病理学检查hTERT shRNA组肿瘤生长受到抑制,肿瘤细胞散在稀疏,可见大量肿瘤细胞坏死及凋亡;Western blot示hTERT shRNA组hTERT蛋白表达受抑制;流式细胞仪检测hTERT shRNA组肿瘤细胞凋亡率明显高于PBS组和空质粒组（P〈0.01）。结论hTERT shRNA可在裸鼠移植瘤体内有效发挥作用,抑制人端粒酶逆转录酶蛋白在体内表达,从而能有效抑制裸鼠胶质瘤增殖生长,促进肿瘤细胞凋亡。     

白介素-24抑制胶质瘤细胞生长的体内外实验研究

目的探讨白介素-24基因转染对胶质瘤生长的影响。方法将载有人白介素-24eDNA的新型重组腺病毒（Ad5F35-IL24）感染人胶质瘤细胞系U251,体外观察Ad5F35-IL24对该细胞系生长的影响;建立人胶质瘤动物模型,瘤内注射Ad5F35-IL24,观察肿瘤生长情况;用流式细胞仪检测其凋亡和Bax／Bel-2的表达情况。结果Ad5F35-IL24感染U251细胞和肿瘤组织后,IL-24蛋白高表达,U251细胞和组织的生长受到明显抑制,其凋亡率明显升高,Bax／Bel-2也明显升高。结论白介素-24具有抑制人胶质瘤细胞系U251生长和诱导凋亡作用。Ad5P35-IL24转导白介素-24基因可能是一种有效的胶质瘤基因治疗途径。     

hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用

目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响。结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光。靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P<0.05)。电镜可见典型的凋亡细胞。细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰。结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用。     

pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用

目的 建立逆转录病毒介导的人Notch1基因RNA干扰体外表达体系并观察对恶性脑胶质瘤细胞的作用.方法 将人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒Psilencer 5.1-H1 Retro中,构建成携带人Notch1基因RNAi逆转录病毒载体pSiRNA-Notch1,经PT6细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染U251和CHG-5恶性脑胶质瘤细胞,用WST-8、RT-PCR和Western blot分别检测对转染细胞活性、人Notch1 mRNA和蛋白表达的影响.结果 重组pSiRNA-Notch1质粒经测序鉴定正确.重组逆转录病毒滴度可达224×10 4cfu/ml,感染U251和CHG-5恶细胞后3 d能明显抑制细胞生长,RT-PCR和Western blot检测人Notch1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.结论 携带人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段的逆转录病毒有明显的抑制恶性脑胶质瘤细胞生长作用,为下一步开展基因治疗恶性脑胶质瘤奠定了基础.     

c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及c-myc基因表达的影响

目的：观察c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及c-myc基因表达的抑制作用．探讨ASODN作为药物进行白血病基因治疗的可行性、方法：应用c-myc反义寡核苷酸封闭HL-60细胞c-myc基因、RTPCR方法检测该基因表达抑制情况．流式细胞仪进行细胞周期分析,倒置显微镜观察细胞形态变化．绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖状态。结果：c-myc基因反义寡核苷酸转染HL-60细胞后,c-myc基因表达明显受抑;S期细胞比值由55.6％降至16．7％;细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及剂量依赖性。结论c-myc基因反义寡核苷酸对HKL-60细胞增殖及c-myc基因的表达具有明显的抑制作用,有望成为抑制白血病细胞增殖的核酸药物。     

基因放射性核素反义治疗肾癌的体内外实验研究

目的探讨Ki67基因放射性核素反义治疗对人肾癌细胞生长及凋亡的影响。方法人工合成Ki67基因反义核酸(ASODNs),氯胺-T法125I标记ASODNs(125I-ASODNs)。①体外实验:125I-ASODNs(10.0μmol/L、2.59MBq/L)转染人肾癌786-0细胞,采用免疫组化、Westernblot检测Ki67表达;免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。以ASODNs(10.0μmol/L)为对照。②动物实验:建立786-0细胞BALB/C-nu裸鼠模型,125I-ASODNs治疗组瘤体注射0.1ml125I-ASODNs(7.4MBq/L、10nmol),ASODNs治疗组瘤体注射0.1mlASODNs(10nmol),连续4天。药物处理后第6天取瘤组织检测肿瘤体积、Ki67表达、细胞凋亡。结果①体外实验:125I-ASODNs治疗组肾癌细胞Ki67表达阳性率[(21.5±1.2)%]降低,Ki67蛋白[(49.9±4.5)%]降低,细胞凋亡率[(28.9±1.3)%]升高,与ASODNs治疗组[(29.9±0.4)%、(82.1±1.9)%、(15.7±0.5)%]比较差异有显著性(P<0.01)。②动物实验:125I-ASODNs治疗组小鼠肿瘤体积(mm3)(76.1±22.9)减小,Ki-67表达率[(20.8±1.0)%]下降,Ki-67蛋白量[(58.6±2.9)%]降低,肿瘤细胞凋亡率[(24.9±2.0)%]升高,与ASODNs治疗组[(185.7±37.7)、(29.2±1)%、(79.7±3.4)%、(17.8±1.9)%]比较差异有显著性(P<0.01)。结论Ki67基因放射性核素反义治疗较单纯反义治疗具有更强的阻抑肾癌细胞Ki67基因表达、抑制增殖、促进凋亡作用。     

Construction of the Antisense Eukaryotic Vector for Proliferating Cell Nuclear Antigen Gene and Its Expression in Bladder Cancer EJ Cell Line

Proliferating cell nuclear antigen ( PCNA) isan important co- factor of DNA polymerase delta,which participates in cellular DNA synthesis and isdirectly correlated with the proliferation status ofeukaryotic cells. Researches have indicated thatPCNA expression increased in tumor tissues andundulated with the changes of cell cycle phases[1] .Over the past ten years,PCNA has become an ef-fective indicator for evaluating the prognosis ofmany tumors. So,it may act as a potential genetherapy …     

Gene therapy with antisense c-myc adenovirus for human gastric carcino- ma cell line in vitro and for implanted carcinoma in nude mice

Sufficient infonnation has been accumulated to suggest that achvation and alnplilication of oncogenes and inachvation and fUnchonal failme of tUInor suPPressor genesare responsible for the inihation and deVelopment of human malignant disease lhrough a mulhstep PIDCess['].Gastric careinoma, one Of the most common inalig~t tUmors, can be successop ~ with sopry inthe early stage, but adVanced cases are usually refectoryto chemotherapy or ladiotherapy. COnSeopenily, genetherapy becomes an at…     

调强适形放射治疗联合替莫唑胺化疗治疗恶性脑胶质瘤的近期疗效及安全性评价

目的：探讨调强适形放射治疗（IMRT）联合替莫唑胺（TMZ）化疗治疗恶性脑胶质瘤的近期疗效和安全性,为临床治疗方案的选择提供依据。方法：选择经手术病理确诊的恶性脑胶质瘤术后患者46例,随机分为联合治疗组（IMRT+TMZ）22例和单纯放疗组（IMRT）24例,随访12～31个月,中位随访时间为19个月,观察2组患者中位无进展生存期、1年生存率及不良反应发生率。结果：全部患者均按计划进行治疗,联合治疗组和单纯放疗组的中位无进展生存期为10个月和7.6个月（P<0.05）,1年生存率为86.36%（19/22）和58.33%（14/24）,2组患者1年生存率比较差异有统计学意义（P<0.05）;2组患者的不良反应均为Ⅰ～Ⅱ度的骨髓抑制和消化道反应,患者可较好耐受,2组患者不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论：IMRT联合TMZ化疗治疗恶性脑胶质瘤的近期疗效明显优于单纯IMRT,且不良反应轻微,是安全有效的综合治疗方案。     

转Nurr1基因联合全反式维甲酸及银杏提取物诱导的神经干细胞治疗帕金森病大鼠模型

目的探讨核受体相关因子(Nurr1)基因修饰联合全反式维甲酸(ATRA)及银杏提取物(Egb)诱导的神经干细胞(NSCs)移植治疗帕金森病动物模型的疗效及作用机制。方法将建模成功的帕金森病SD大鼠模型分为4组,将溴尿嘧啶(Brdu)标记的单纯胚胎NSCs(NSCs组)、RA/Egb诱导分化的NSCs(RA/Egb组)、单纯转Nurr1基因的NSCs(Nurr1组)和转Nurr1基因联合RA/Egb诱导分化的NSCs(Nurr1 RA/Egb组)分别注入模型鼠右侧纹状体。观察其病理性旋转行为的改善,采用免疫组化染色方法检测酪氨酸羟化酶(TH)、Nurr1、神经丝巢蛋白(nestin)表达及Brdu标记情况,观察移植的NSCs在体内的存活、迁移与分化,并进行TH阳性细胞计数研究脑内多巴胺含量的变化。结果各组动物脑内移植后动物旋转行为较前均有改善,尤以Nurr1 RA/Egb组改善最明显,RA/Egb组次之。免疫组化可见各组移植区均有TH阳性细胞表达,其中Nurr1 RA/Egb组TH染色细胞数更密集,形态更成熟,病理学改善最明显。在Nurr1组和Nurr1 RA/Egb组移植区可见有Nurr1散在表达,在NSCs组和RA/Egb组移植区未见Nurr1明显表达。nestin检测未见有明显阳性表达。结论转Nurr1基因联合全反式维甲酸及银杏提取物诱导的神经干细胞脑内移植后可以存活、迁移、分化并表达TH和Nurr1,部分地改善PD模型旋转行为,增加脑内TH表达。     

A study of the expression of p53 in posttransfection cells with rAdp53 gene and inhibitory activity in vitro

Objective To investigate the inhibitory effect and IC50 (50% inhibiting concentration) of the recombinant adenoviral p53 gene (rAdp53) in colorectal cancer cells in vitro and to guide clinical practice. Methods We evaluated the efficiency (IC50)of the rAdp53 and six kinds of anti-cancer drugs(5-fluorouracil, tegafur, mitomycin c, cisplatin, oxaliplatin, paclitaxel) in human colorectal cancer cell line-174 through the cell culture and MTT chemosensitivity assay to make sure the anti-cancer capability of rAdp53.Expression of p53 protein in transfection cells of colorectal cancer line-174 with rAdp53 was evaluated by immunohistochemical staining. Results The rAdp53 is a dose- and time-dependent anti-cancer drug, its IC5o is 5.73×1011 VP/ml, but its effect was not obvious when compared with other anti-cancer drugs. In control group, the immunohistochemistry stain was negative. However,rAd-p53 of five different concentrations were all positive in infected colorectal cancer cells with rAd-p53 and the earliest positive result would present 24 hours after infection. Conclusion The rAdp53 has good anti-cancer efficacy is colorectal cancer cell line174 in vitro. But its anti-cancer efficacy was less than those of the classical chemical medicine mitomycin c, 5-fluorouracil and cisplatin etc., when it was used alone.