siRNA沉默Rac2蛋白表达下调树突状细胞的交叉递呈

目的 通过RNA干扰研究Rac2蛋白对树突状细胞(DC)交叉递呈的影响.方法 首先构建针对Rac2基因siRNA的慢病毒载体pFIVsiRNARac2-1,pFIVsiRNARac2-2,pFIVsiRNARac2-3;DNA-磷酸钙共沉淀的方法转染293FT细胞包装慢病毒,嘌呤霉素(puromycin)筛选病毒感染的阳性DC2.4(树突状细胞系),Western-blot检测其干扰效率;然后用B3Z细胞(H2-Kb限制性,SIINFEKL特异性T细胞杂交瘤)检测筛选后的DC2.4细胞交叉递呈的能力.结果 酶切和测序结果证实表达siRNA的慢病毒载体构建成功,抗原递呈实验发现下调了Rac2蛋白表达的DC2.4细胞交叉递呈能力下降.结论 初步证实了Rac2蛋白参与树突状细胞对外来抗原的交叉递呈,为进一步了解树突状细胞交叉递呈的分子机制奠定了基础.     

IL-8对肺癌NCI-H157细胞增殖和迁移的影响

目的 研究IL-8对肺癌细胞增殖和迁移的影响,初步探讨IL-8调控肺癌细胞的分子机制.方法 体外培养肺癌NCI-H157细胞,用不同浓度的IL-8刺激肺癌细胞,分别用MTT法检测IL-8对肺癌细胞的增殖作用;划痕损伤实验和Transwdl小室两种方法检测肺癌细胞的迁移能力;Western blot检测Rac1和Cdc 42蛋白的表达变化.结果 IL-8促进NCI-H157细胞增殖,但随浓度增加,细胞增殖活性差异无统计学意义;细胞划痕损伤和Transwell实验均表明IL-8可诱导NCI-H157细胞迁移,且具有浓度依赖性;Western blot结果显示,随着IL-8浓度增加,Rac1和Cdc 42的表达水平逐渐升高,以Cdc42变化最为显著.结论 IL-8可促进肺癌细胞增殖和迁移,可能与Rac1和Cdc42表达有关.     

骨髓来源的原代树突状细胞对细菌颗粒抗原交叉呈递的动力学研究

目的研究小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞对细菌颗粒抗原交叉递呈的动力学特点。方法取小鼠骨髓细胞,采用GM-CSF诱导培养。用倒置显微镜观察培养过程中细胞形态,用流式细胞仪进行细胞纯度和表型测定。采用第7天未成熟的DC细胞进行细菌抗原的交叉递呈能力检测和动力学分析。结果小鼠骨髓细胞经GM-CSF诱导培养,第7天获得大量具有典型形态和免疫表型的树突状细胞,并且在细菌脂多糖刺激后,其表型也发生特征性变化表现在共刺激分子CD80由刺激前的27.7%上调到71.6%,CD86从刺激前的36.0%上调到80.3%,DEC205从刺激前的6.5%上调到26.2%。同时该细胞吞噬低剂量的细菌抗原即可有效活化T细胞,其动力学曲线为:1～3h,该细胞抗原递呈能力呈对数增加,3～8hDC抗原递呈能力进入一个平台期,10～12h,抗原递呈能力又迅速增强。结论采用GM-CSF可以从小鼠骨髓中获得大量纯度高并且具有典型免疫表型的DC,该DC细胞能有效的递呈外源性细菌抗原,并具有特殊的抗原递呈动力学曲线。     

树突状细胞交叉递呈外源抗原的机制研究进展

树突状细胞(DC)是目前已知功能最强的专职抗原递呈细胞。外源抗原在进入DC的内体后,常规情况下会进入经典的MHCⅡ递呈途径。而经一些受体介导内吞的抗原会从内体释放进入胞质,经免疫蛋白酶体降解成肽段进入MHCⅠ类分子递呈途径,或在内体中被降解成抗原肽后与MHCⅠ类分子结合,直接转运到DC表面,这一递呈途径被称为交叉递呈。外源抗原交叉递呈对有效激活细胞毒性T细胞从而引发抗肿瘤、抗病毒免疫反应有着重要意义。本文对参与交叉递呈的DC表面内吞受体、交叉递呈途径及机制方面的研究进展进行简要总结。     

树突状细胞介导的肿瘤免疫治疗研究

树突状细胞是抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞。树突状细胞可通过交叉致敏途径呈递外源性抗原如肿瘤抗原,诱导CD8+的CTL应答。应用不同形式的肿瘤抗原负载DC,将致敏DC作为疫苗回输体内可诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫应答。     

树突状细胞介导的肿瘤免疫治疗研究

树突状细胞是抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞。树突状细胞可通过交叉致敏途径呈递外源性抗原如肿瘤抗原，诱导CD8 的CTL应答。应用不同形式的肿瘤抗原负载DC，将致敏DC作为疫苗回输体内可诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫应答。     

肺癌细胞中p120-catenin的基因缺失促进肺癌细胞的侵袭和转移能力

目的探讨肺癌细胞中p120-catenin(p120ctn)在非小细胞肺癌侵袭、转移中的作用及其可能的机制。方法应用siRNA方法干扰肺癌细胞系BE1,SPC,LTE中p120ctn的表达后,应用Westernblot及RT-PCR方法检测E-cadherin、β-catenin蛋白及mRNA表达情况的变化;应用流式细胞术及Transwell实验检测肺癌细胞增殖、侵袭和转移能力变化;应用Pull-down方法检测小GTP酶活性的变化;应用体内侵袭实验检测肿瘤形成情况。结果 p120ctn表达下调明显地减弱E-cadherin和β-catenin的蛋白表达,同时,还可以下调β-catenin的mRNA表达。p120ctn表达下调还能使Cdc42和Rac1活性增高,RhoA的活性降低,并且促进肺癌细胞的增殖、侵袭和转移。将稳定转染了p120siRNA和转染空质粒的细胞克隆分别移植至裸鼠皮下,发现整合了p120siRNA的荷瘤鼠的肿瘤生长迅速,侵袭和转移能力增强。结论 p120-catenin的缺失可促进肺癌细胞的侵袭和转移能力,其机制可能通过下调E-cadherin和β-catenin的表达从而降低细胞间粘附,以及激活Cdc42/Rac1、失活RhoA来实现。     

PLGA 纳米微粒对树突状细胞表型和功能的影响

目的:探讨用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制备的纳米微粒对树突细胞的表型及功能的影响。方法:用复乳溶剂蒸发法制备纳米微粒(NP)及包含有黑色素瘤抗原肽gp100-154-162的纳米颗粒(NP-gp100-154-162),用扫描电镜、Nano Plus粒度测定仪检测NP表征。用外周血单核细胞诱导树突细胞(DC),用纳米微粒负载树突细胞,共聚焦显微镜和流式细胞仪检测DC细胞对NP的摄取情况及DC摄取NP后的表型变化。用混合淋巴细胞反应(MLR)检测负载NP的DC及单纯DC刺激同种异体淋巴细胞增殖反应;免疫斑点法(ELISPOT)检测负载NP-gp100-154-162的DC刺激效应细胞分泌IFN-γ的能力,观察纳米微粒对DC递呈抗原的影响。结果:PLGA-NP为圆形,粒径约为180～230 nm,该纳米微粒能被DC有效摄取;负载PLGA-NP后DC表面标志HLA-DR、CD80、CD86、CD83等明显增加;混合淋巴细胞反应结果显示负载纳米微粒的DC(DC/NP)能刺激T细胞增殖,刺激指数(SI)显著高于单纯DC组和单纯纳米微粒组。ELISPOT检测显示:DC细胞负载NPgp100-154-162在第4天时刺激效应细胞产生分泌IFN-γ的斑点数显著高于其在第2天时产生的斑点数,二者均显著高于DC负gp100-154-162产生的斑点数,表明纳米微粒能促进DC成熟,增强DC递呈抗原的能力。结论:PLGA纳米微粒能促进DC成熟和活化,增强并延长DC对抗原的递呈作用,提高树突状细胞免疫应答能力。     

Rab4蛋白参与DC细胞内源性抗原递呈

目的 建立稳定表达卵白蛋白的DC细胞株DC-OVA,研究Rab蛋白对DC内源抗原递呈的影响.方法 首先构建含OVA蛋白基因慢病毒表达质粒pLentimycOVA;以DNA-磷酸钙共沉淀法转染293FT细胞制备慢病毒,用病毒感染DC2.4细胞及杀稻瘟毒素(Blasticidin)筛选方法建立稳定表达OVA的细胞株,Western blot鉴定DC-OVA细胞中OVA蛋白表达;然后用识别MHC Ⅰ类分子-OVA肽复合物的T细胞杂交瘤B3Z细胞以及针对该复合物的单抗25D1.16检测DC-OVA细胞表面MHC-OVA肽复合物的形成情况,建立内源性抗原呈递的检测方法;最后采用脂质体法转染化学合成的Rab4、Rab5A、Rab7、Rab11的siRNA于DC-OVA中,B3Z检测DC内源抗原递呈的变化.结果 酶切和测序分析证实转移质粒克隆成功,Western blot可在DC-OVA细胞中检测到OVA蛋白,B3Z细胞和25D1.16单抗可检测到DC-OVA细胞表面存在MHCⅠ类分子-OVA表位多肽复合物,表明内源性抗原呈递系统成功建立.在此基础上,发现下调DC细胞中Rab4蛋白的表达,DC-OVA细胞刺激B3Z生成IL-2(白细胞介素2)的量明显下降.结论 成功构建了OVA蛋白的慢病毒表达载体,获得了表达内源OVA蛋白的DC细胞株,建立了内源性抗原呈递系统,初步证实下调Rab4蛋白可抑制DC细胞的内源性抗原递呈,为病毒感染和肿瘤等疾病的治疗奠定了基础.     

Rab4蛋白的细胞内定位及其活性改变对DC内源抗原递呈的影响

目的观察Rab4突变体在树突状细胞(DC)内的定位,研究其对DC内源抗原递呈的影响。方法构建Rab4突变体的慢病毒表达质粒,以DNA-磷酸钙共沉淀法制备慢病毒,病毒感染DC-OVA细胞并使用流式细胞术检测感染效率,激光共聚焦显微镜观察DC-OVA细胞中Rab4突变体的表达与定位,最后用识别MHC I类分子-OVA肽复合物的T细胞杂交瘤B3Z细胞检测DC-OVA细胞内源抗原递呈的变化。结果慢病毒可高效感染DC-OVA细胞,感染后Rab4突变体可在DC-OVA中稳定表达,主要分布在细胞膜周围的囊泡结构中。抗原递呈检测结果显示Rab4对DC内源性抗原递呈具有正相关性影响。结论成功观察到不同Rab4突变体在DC内的表达与分布,初步证实Rab4蛋白可通过其活性的改变参与调节DC的内源性抗原递呈。