利用不同DNA源进行基因多态性研究的可行性分析

探讨不同ＤＮＡ源作基因多态性分析的优缺点,及以血凝块裂解液直接进行ＰＣＲ扩增的可行性 和可靠性。方法：从口腔粘膜细胞、组织切片提取ＤＮＡ,并将临床生化分析遗弃的血凝块制备成裂解液和纯化 ＤＮＡ,取各自样本分别进行ＰＣＲ扩增,并进一步对血凝块纯化ＤＮＡ和血凝块裂解液所作的ＰＣＲ扩增作对照研究。 结果：本研究使用的不同ＤＮＡ源所作的ＰＣＲ扩增均获得满意结果,以血凝块裂解液进行的ＧＳＴＭ１,ＧＳＴＴ１和 ＣＹＰ２Ｅ１基因多态性分析均获得成功,其结果与纯化ＤＮＡ进行分析观察到的结果完全一致。结论：同组织细胞纯 化的ＤＮＡ一样,血凝块是理想的ＤＮＡ源,用血凝块裂解液直接进行基因多态性分析,方法简明,结果可靠。     

百日咳杆菌毒素S1亚单位与谷胱甘肽S—转移酶融合基因在大肠杆菌 …

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌中的表达。并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１，首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。     

PCR检测结核分枝杆菌DNA中不同细菌裂解方法结果观察

目的：寻找适合于临床ＰＣＲ检测结核杆菌ＤＮＡ简单、快速、有效、经济的细菌裂解方法。方法：采用１１种细菌裂解剂对相同数量的结核分枝杆菌进行裂解，裂解上清液直接用于ＰＣＲ扩增，结果：１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，１％ＮＰ４０，１％Ｔｅｗｅｅｎ２０、和１％ＯＰ四种裂解剂的裂解液可直接扩增出结核分枝杆菌ＤＮＡ；ＳＤＳ，ＮａＯＨ，十二烷基肌酸钠等裂解剂的裂解液直接用于ＰＣＲ扩增均为阴性。结论：１％的Ｔｒｉｔｏｎｘ－１００，ＮＰ４０、Ｔｅｗｅｅｎ２０和乳化剂ＯＰ裂解细菌效果好，又不抑制ＰＣＲ反应，适合于作为临床ＰＣＲ检测结核杆菌的裂解剂。     

PCR检测结核分枝杆菌DNA中不同细菌裂解方法结果 …

寻找适合于临床ＰＣＲ检测结核杆菌ＤＮＡ简单，快速，有效，经济的细菌裂解方法。方法采用１１种细菌裂解剂对相同数量的结核分枝杆菌进行裂解，裂解上清液直接用于ＰＣＲ扩增，结果１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，１％ＮＰ４０，１％Ｔｅｗｅｅｎ２０、和１％ＯＰ四种裂解剂的裂解液可直接扩增出结核分枝杆菌ＤＮＡ；ＳＤＳ，ＮａＯＨ     

改进的PCR模板制备及DNA回收方法

直接用煮沸的细菌裂解液中的ＤＮＡ作ＰＣＲ模板，扩增效果与用酚／氯仿抽提纯化的质粒ＤＮＡ作模板的结果一致，缩短了实验时间。利用简单材料回收酶切片段，省去了有机溶剂反复抽提和沉淀的步骤，回收率达到９０％，效果很好。     

改进的PCR模板制备及DNA回收方法

直接用煮沸的细菌裂解液中的ＤＮＡ作为ＰＣＲ模板，扩增效果与用酚／氯仿抽提纯化的质粒ＤＮＡ作模板的结果一致，缩短了实验时间，利用简单材料因收酶切片段，省去了有机溶剂反复抽提和沉淀的步骤，回收率达了９０％，效果很好。     

大肠杆菌表达耐热DNA聚合酶的纯化和鉴定

目的探讨工程菌表达的耐热ＤＮＡ聚合酶的纯化方法。②方法收集ＩＰＴＧ诱导带有耐热ＤＮＡ聚合酶（ＴＤ聚合酶）基因表达质粒的工程菌株ＤＨ－ＴＤ４，用溶菌酶裂解，６０℃处理后，上清液用硫酸铵沉淀，根据溶解度差异进行粗分级，然后进行离子交换层析细分级，并经聚合酶链式反应（ＰＣＲ扩增）鉴定其活性。③结果纯化的ＴＤ聚合酶具有良好的聚合活性。④结论溶解度差异与离子交换层析是工程菌表达的耐热ＤＮＡ聚合酶纯化的主要步骤。基因工程制备的ＤＮＡ聚合酶可用于ＰＣＲ检测     

我国肝病病人和健康人群中TTV基因型分析

目的 分析我国肝病患者和健康人群ＴＴＶ基因型。方法 用巢式ＰＣＲ扩增我国不同地区不明病因的急性肝炎，慢性肝炎，肝癌和自然健康人群ＴＴＶ ＤＮＡ片段，并对ＰＣＲ产物进行克隆，测序分析和同源性比较。结果 武汉ＷＨ１，ＷＨ２，ＷＨ３个病人血清中ＴＴＶ ＤＮＡ序列与Ｎ２２同源性分别为９７％、９７％和９８％；广州ＧＺ１，ＧＺ２，ＧＺ３例病人血清中ＴＴＶ ＤＮＡ序列与Ｎ２２同源性分别为９８％，９５％和９５％，     

用聚合酶链反应快速检测痰液中结核杆菌

本研究以结核杆菌染色体中重复出现的长度为１２３个碱基对（ｂｐ）的ＤＮＡ片段作为作为聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增的模板，合成一对寡核苷酸引物。痰液标本先经三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ），乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ－２Ｎａ）和三硝基甲苯（Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００）加热、震荡处理，裂解结核杆菌，再作ＰＣＲ扩增和琼脂糖凝胶电泳。同时，与痰液直接涂片、抗酸染色镜检抗酸染色阳性杆菌作比较。用该ＰＣＲ扩增和琼脂糖凝     

日本血吸虫26ku谷胱甘肽硫—转移酶基因的克隆及分析

目的 扩增日本血吸虫２６ｋｕ谷胱甘肽硫－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因片段,构建其重组原核载体,以研制ＳｊＧＳＴ重组克隆。方法 根据已知基因序列设计一对引物,运用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增Ｓｊ２６ＧＳＴ目的基因ｃＤＮＡ片段,将其克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ）质粒中,并经酶切、ＰＣＲ和测序鉴定。结果 获得ＧＳＴ－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ）重组克隆。结论 本实验获得Ｓｊ２６ＧＳＴ重组克隆,为进一步研     

三种方法对日本血吸早抗原cDNA克隆的筛选和鉴定

利用融源表达、平板裂解法和ＰＣＲ扩增三种不同方法分别对日本血吸虫抗原ｃＤＮＡ基因进行鉴定和分析，８个免疫筛选阳性克隆均能在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达，表达蛋白分子量为１４０－１５０ｋＤａ，抗原ｃＤＮＡ基因经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ酶解后，琼脂糖凝胶电泳显示其大小为７００－９００ｂｐ，ＰＣＲ能扩增出特异性条带，结果表明，上述三种方法能从蛋白质和核酸水平有铲地鉴定血吸虫抗原ｃＤＮＡ基因。     

尿嘧啶DNA糖苷酶防止PCR产物污染及其对核酸杂交的影响

目的 采用ＰＣＲ微板核酸杂交ＥＬＩＳＡ分析脲嘧啶ＤＮ糖苷酶（ＵＮＧ／ＵＤＧ）防止ＰＣＲ产物污染及其对ＰＣＲ扩增效率的影响。探讨在不同Ａ／Ｔ含量的微生物中含尿嘧啶的ＰＣＲ产物对核酸杂交的影响。方法 以３组ｄＵＴＰ含量不同的ＰＣＲ产物作模板，抗污染组用ＵＮＧ处理，直接进行再次扩增。用微板核酸杂交ＥＬＩＳＡ检测第二次ＰＣＲ扩增的结果。结果 抗污染组中含ｄＵＴＰ的ＰＣＲ产物作模板，结果为阴性，而以不含ｄＵ     

人4-1BB-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体。方法：ＰＣＲ扩增人４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ基因片段，用ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔＩ酶切４１ＢＢ胞膜外区，ＰｓｔＩ　、ＥｃｏＲ　Ｉ　酶切ｈＩｇＧ１Ｆｃ　，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ　酶切ｐＣＤＮＡ３，纯化后的酶切产物经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，ＰＣＲ及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ的引物进行ＰＣＲ扩增，电泳后观察到一５５８ｂｐ、７０８ｂｐ的特异性条带，与４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在ｐＣＤＮＡ３　质粒中的４１ＢＢ和ｈＩｇＧ１Ｆｃ序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体，为表达４１ＢＢ融合蛋白奠定基础。     

百日咳杆菌毒素S_1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合基因在大肠杆菌中表达及其一步纯化

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达,并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１。首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。该片段比原编码Ｓ１蛋白的ＤＮＡ片段在其３′端缺失了１３８个碱基,将其按正确的阅读框克隆入质粒ｐＧＥＸ中ＧＳＴ基因的３′端,构成ＧＳＴ－Ｓ１融合基因表达载体ｐＧＥＸ－Ｓ１。经异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）,可见所表达的ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白存在于细菌上清,为可溶性蛋白。分子量为４９ｋｕ处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析系统,一步纯化出ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白。最后经凝血酶的消化,得到２３ｋｕ的重组百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位蛋白。为百日咳疫苗的发展提供了依据     

GSTM1基因多态性与食管癌遗传易感性的关系

目的：探讨ＧＳＴＭ１基因多态性与食管癌遗传易感性的可能关系。方法：采用ＰＣＲ法对正常人和食管癌患者基因组ＤＮＡ进行ＧＳＴＭ１基因分型：结果１０８例食管癌患者中６８例为ＧＳＴＭ１型;１１２例正常对照组标本中５５例为ＧＳＴＭ１型的。２组人群ＧＳＴＭ１基因缺失率有显著性差异。结论：ＧＳＴＭ１基因多态性与食管癌易感性相关,ＧＳＴＭ１基因型个体食管癌易感性增高。     

人CCR5 5′侧翼调控序列克隆测定及基序分析

目的：克隆人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列及其基序分析。方法：设计单引物,利用单向多循环ＰＣＲ扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列基因组ＤＮＡ,ＰＣＲ产物作为序列分析模板。结果：得到长为１．５ｋｂ的人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列基因组ＤＮＡ序列,并对该区域的基序进行了分析。结论：该方法适合于基因组ＤＮＡ,特别是逆向扩增一些读框区５′侧翼调控序列。     

人卵巢颗粒细胞雌激素β型受体cDNA的克隆和序列分析

目的 测定和分析人卵巢颗粒细胞中雌激素β型受体（ＥＲβ）ｃＤＮＡ的核苷酸序列结构。方法 采用ＤＭＥＭ培养基、以ＰＥＲＣＯＬＬ方法从人体外受精卵泡液中制备颗粒细胞。根据ＴＲｌｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ试剂盒方法抽提ＲＮＡ,并在Ｄｉｓｐｏｃｏｌｕｍｎ柱中用寡聚（ｄＴ）纯化ｍＲＮＡ。用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ＾ＴＭⅡＲＴ试剂盒反转录ＰＣＲ合成ｃＤＮＡ。扩增产物与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,并转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕ     

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因在真核表达载体中的亚克隆

目的 将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因片段克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶＫ ,以便以进行酸疫苗的研究。方法 特定核苷酸引物的设计和合成,ＴＲＩＺＯＬ试剂以日本血吸虫成虫ＲＮＡ〈ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ基因编码序列,将扩增产物连接ＰＧＥＭ－Ｔ克降体,再亚克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶ中。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出ＳｊＧＳＴ编码基因片段。其大小约为６７０ｂｐ,经双酶切、ＰＣＲ鉴定表明所构     

用mRNA差异显示法分离大鼠吗啡依赖相关基因

目的：分离并克隆大鼠吗啡依赖相关基因。方法：ＳＤ大鼠用递增剂量的吗啡作皮下注射,形成吗啡依赖的动物模型。分离鼠脑的中脑导水管周围灰质、伏核、纹状体等核团,提取总ＲＮＡ,用ｍＲＮＡ差异显示（ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙＰＣＲ,ＤＤＰＣＲ）的方法,筛选吗啡依赖大鼠特异表达产物的ｃＤＮＡ片段。用３组锚定引物（Ｔ１２ＭＮ,Ｍ＝Ａ,Ｇ,Ｔ或Ｃ,Ｎ＝Ａ,Ｃ或Ｇ）和６组随机引物（ＡＰ１～ＡＰ６）作不同组合进行ＰＣＲ扩增。结果：获得了８０余个差异表达产物的ｃＤＮＡ片段,经斑点杂交初步筛选,克隆了１０个阳性片段,选取４个克隆进行序列分析,获得了４个ｃＤＮＡ片段。结论：通过ＢＬＡＳＴ数据库序列比较,现已确认获得了４个吗啡依赖表达的新基因片段。     

结核分枝杆菌耐药基因检测

目的：研究结核分枝杆菌耐药的分子机制，建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法。方法：通过聚合酶链反应、ＰＣＲ－单链构象多态性、ＰＣＲ－限制性片段长度多态性分析ＭＴ临床分离株的ｒｐｏＢ、ｒｐｓＬ、ＫａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列。结果：ＰＣＲ分析耐药基因的敏感性为１－１０ｐｇＤＮＡ；除ｒｐｏＢ经物ＰＣＲ扩增为属特异性外，余耐药基因引物ＰＣＲ扩增都具有较高的种特异性。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ与Ｐ