胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体穿梭质粒的构建及鉴定

目的构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。方法提取新生大鼠纹状体总RNA,用RT-PCR方法克隆大鼠GDNFcDNA,PCR产物回收后经H indⅢ和KpnⅠ双酶切,插入pAdTrack-CMV中,用氯化钙法将其转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、PCR及测序分析对重组质粒做进一步鉴定。结果大鼠GDNFcDNA被成功克隆,重组载体的PCR检测、酶切鉴定及测序分析表明,所克隆的GDNFcDNA与基因库注册的相同,大鼠GDNFcDNA被定向插入。结论成功构建了GDNFcDNA重组腺病毒载体。     

GM-CSF基因重组腺病毒穿梭载体的构建及Xba Ⅰ甲基化位点的应用

目的构建GM-CSF基因重组腺病毒穿梭载体并探讨XbaI甲基化位点在构建中的应用,为构建GM-CSF基因重组腺病毒及更方便地利用XbaⅠ多克隆位点打下基础。方法体外分离小鼠脾细胞,经ConA刺激,用含两种不同的XbaⅠ位点毗邻碱基的引物RT-PCR获取小鼠GM-CSF基因,经XbaⅠ及XbaⅠ双酶切后分别定向克隆入pAdTrack-CMV重组腺病毒穿梭载体中,比较两种重组载体酶切鉴定的效率并通过测序验证。结果成功逆转录得到小鼠GM-CSF基因并克隆入pAdTrack-CMV中,测序结果与预期一致。酶切鉴定显示由于XbaI位点毗邻碱基的不同导致甲基化的XbaⅠ位点在克隆菌株中不能被有效切开。结论成功构建GM-CSF基因重组腺病毒穿梭载体,XbaⅠ位点对甲基化敏感。     

小鼠noggin基因的重组腺病毒构建与鉴定

目的：构建小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法：采用基因工程技术。经过2次亚克隆将 noggin 基因片段克隆至穿梭质粒 AdTrack-CMV 上,利用 pAdEasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染 293T 细胞包装、扩增。采用 PCR 方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白 GFP 报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果：酶切鉴定及 PCR 结果证明 noggin 基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6．3×10~(10)pfu/ml。结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体。     

大鼠GLUT1基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

目的:构建携带大鼠葡萄糖转运体1基因（GLUT1）的复制缺陷型重组腺病毒载体，为进一步研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡机制奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法获取大鼠GLUT1基因全长cDNA，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-Glut1，经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α，构建重组腺病毒质粒pAd-Glut1，酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒，重组腺病毒在HEK293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反应（PCR）及免疫印迹法（Western blotting）从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果:经PCR分析及DNA测序显示GLUT1 cDNA序列正确；筛选出重组腺病毒质粒pAd-Glut1后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包装后冻融细胞行PCR及Western blotting检测表明重组腺病毒包装成功。结论:成功扩增了大鼠GLUT1基因并构建了携带大鼠GLUT1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，这有助于研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡的机制。     

鼠A20基因的腺病毒载体构建及耳蜗毛细胞表达

目的 构建鼠锌指蛋白A20基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠耳蜗毛细胞的感染情况.方法 采用基因工程技术,经亚克隆后将A20基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染HEK293细胞包装、扩增,将重组腺病毒感染耳蜗毛细胞.PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因对病毒滴度和感染情况进行监测.结果 酶切鉴定及PCR结果表明A20基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5×109pfu/mL,并对耳蜗毛细胞有很强的感染能力.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含鼠A20基因的重组腺病毒载体.     

两步法细菌内同源重组制备重组单核细胞趋化因子-1腺病毒

目的 两步法提高细菌内同源重组效率制备重组人单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)复制缺陷型腺病毒.方法 制备含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183,Hind Ⅲ酶切筛选未发生细菌内重组的菌落,并将其制备成感受态(BJ5183pAdEasy-1).RT-PCR法克隆得到MCP-1 cDNA片段,连接到pMD18-T载体后亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack上构建重组穿梭载体pAdTrack-MCP-1.PmeⅠ酶切线性化并碱性磷酸酶处理pAdTrack-MCP-1,然后电穿孔转化感受态BJ5183pAdEasy-1.PacⅠ酶切筛选得到正确重组的腺病毒载体pAd-MCP-1,将pAd-MCP-1转染入HEK293细胞中包装病毒颗粒,以PCR法鉴定.结果 成功构建pAd-MCP-1,效率可达50%以上,pAd-MCP-1能有效转染HEK293细胞并在细胞内包装.PCR鉴定病毒携带有MCP-1基因片段.结论 两步法细菌内同源重组构建重组腺病毒载体较常规电穿孔共转化效率高.成功制备重组腺病毒颗粒为进一步研究MCP-1的作用提供了重要的方法.     

小鼠GITRL基因腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建重组腺病毒pAdEasy-GFP-GITRL,并测定病毒滴度。方法:从PIRES-GITRL载体上用BglⅡ和SalⅠ双酶切,回收目的基因GITRL,插入同样用BglⅡ和SalⅠ双酶切的穿梭质粒pAdtrack-CMV中,将线性化穿梭质粒骨架质粒pAdEasy-1共转染BJ5183菌,鉴定正确后,将重组腺病毒载体pAdEasy-GFP-GITRL转染HEK293细胞,以包装出完整腺病毒。TCID50法测定重组腺病毒滴度,Western blot法检测GITRL蛋白表达。结果:成功构建小鼠GITRL基因的重组腺病毒载体(pAdEasy-GFP-GITRL),经包装后获得高滴度表达GITRL基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.0×109pfu/mL。Western blot结果显示重组病毒载体能表达GITRL蛋白。结论:重组腺病毒表达载体(pAdEasy-GFP-GITRL)的成功构建及重组腺病毒的获得为GITRL基因干预治疗奠定了基础。     

人NR4A1基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的:克隆人NR4A1基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR的方法从人卵巢组织中扩增NR4A1基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdtrack-NR4A1。PmeI酶切pAdtrack-NR4A1,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdtrack-NR4A1转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。PacI酶切线性化重组质粒AdCMV-NR4A1后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。通过GFP报告基因观察重组病毒的产生。PCR、Western blot检测NR4A1基因的表达。结果:用RT-PCR方法,从人卵巢组织中扩增出1797bp的cDNA,测序证实为人NR4A1基因。构建了NR4A1基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论:成功地克隆了人NR4A1基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究NR4A1基因在相关疾病中的作用奠定了基础。     

IκBαM重组腺病毒的构建

为从分子水平研究NF κB/IκBα系统复杂的生物学功能特别是在肿瘤抗凋亡机制中的作用、进而应用其进行肿瘤及其它多种疾病的基因治疗研究 ,我们在成功克隆IκBα基因基础上 ,构建了NF κB超抑制物IκBαM。在此基础上应用新型腺病毒载体构建系统AdEasysys tem构建重组腺病毒AdIκBαM。首先将目的基因IκBαM克隆至穿梭质粒Track CMV质粒 ,提取重组Track IκBαM质粒 ,行单酶切及双酶切鉴定 ,表明重组穿梭质粒Track IκBαM构建成功。以碱法提取重组穿梭质粒Track IκBαM基金项目 :国家 863计划资助项目( 2 0 0 1AA2 1712…     

小鼠FasL全长cDNA的克隆与FasL腺病毒载体的构建

目的: 克隆小鼠FasL全长cDNA, 构建FasL腺病毒载体。方法: 从经ConA(5mg/L)刺激 48h的BALB/c小鼠脾脏单个核细胞中克隆FasL全长cDNA, 构建以CMV启动子转录调控的含小鼠FasL全长cDNA的穿梭质粒mFasL pAdTrack。经PacI酶切后, 与腺病毒骨架质粒pAdEasy 1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。挑选阳性重组子转染HEK- 293细胞, 构建CMV启动子转录调控的mFasL重组腺病毒载体。结果: 成功地克隆小鼠FasL全长cDNA, 经PCR、酶切及荧光检测等证实, 成功地构建了重组mFasL腺病毒载体。结论: 重组FasL腺病毒载体的构建为进一步研究FasL在肿瘤和自身免疫性疾病的作用奠定了基础。     

GDNF基因逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

应用基因重组技术将大鼠 GDNF c DNA克隆到逆转录病毒载体 p L XSN中 ,用限制性内切酶酶切分析重组质粒p L XSN-GDNF中 GDNF基因的插入方向 ,用 PCR、斑点杂交和 Southern杂交对重组质粒作进一步鉴定。结果表明 :GDNF c D-NA已正确地克隆到逆转录病毒载体 p L XSN中而构建成重组逆转录病毒载体 ,成功构建的真核细胞表达载体可作为基因治疗的高效基因转移载体。本研究为进一步开展 GDNF基因治疗 Parkinson' s disease和 Alzheimer' s disease等中枢神经系统疾病提供了资料。     

人端粒酶催化亚单位hTERT基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

为构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)重组腺病毒载体,采用PCR法从pCI-neo-hTERT中钓取hTERT全长cDNA,定向克隆到pADTrack-CMV穿梭质粒。通过分步转化把pADEasy-1和重组穿梭质粒(pADTrack-hTERT)转化入BJ5183菌进行同源重组。hTERT重组腺病毒骨架质粒(pAD-hTERT)转染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,收获重组腺病毒(AD-hTERT)提取DNA行PCR鉴定并扩增。经PCR、酶切和测序鉴定证实hTERT的cDNA正确插入穿梭质粒且与pADEasy-1正确同源重组;PCR鉴定及报告基因分析说明hTERT重组腺病毒包装正确且具有较好的感染活力。结果表明本研究已成功构建了hTERT重组腺病毒,为hTERT的神经保护作用研究奠定了基础。     

Construction and identification of rat GDNF gene recombinant retroviral vector and gene transfection to NSC

By genetic recombinant technique, the rat GDNF cDNA was recombinated to the retroviral vector pLXSN. The recombinant plasmid pLXSN-GDNF was verified by digestion with restriction endonucleases and PCR. Then neural stem cells (NSCs) were infected with pLXSN-GDNF. Immunocytochemistry, RT-PCR and western-blot were used to detect the transfection effect. Results showed that GDNF cDNA was cloned into retroviral vector pLXSN correctly, and the pLXSN-GDNF can infect NSCs efficiently. These results provide the possibility for transplantation and gene therapy with GDNF of nervous system diseases and injury.     

人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人LIGHT基因，构建其重组腺病毒载体，以研究LIGHT过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法 用RT-PCR法从人外周血单个核细胞（PBMC）中克隆人的LIGHT全长基因。将LIGHT cDNA克隆到穿棱载体pAdTrack-CMV-LIGHT重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒pAdTrack-CMV-LIGHT和骨架质粒pAdEasy-1，以电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、PCR及Western blot分析LIGHT基因的表达。结果 用RT－PCR法从人的PBMC中，扩增出723bp的cDNA，测序证实为人LIGHT基因。荧光显微镜、PCR及Western blot证实，LIGHT重组腺病毒可感染293细胞，并在293细胞内进行有效的复制。结论 成功地克隆了人LIGHT基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究LIGHT基因的功能提供了条件。     

反义HLA-A2和GDNF共表达逆转录病毒载体的构建和鉴定

为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行病毒的包装。收获重组病毒感染的NIH3T3并进行病毒滴度的测定,GDNF及HLA- A2表达的RT -PCR检测,进一步感染人胚肺成纤维细胞,观察GDNF分泌情况。结果表明:GDNF和反义HLA -A2两片段的序列和插入方向完全正确,包装后获得的重组病毒的平均滴度为5×105 CFU/ml。RT PCR显示:在小鼠源性的PA317细胞中有人GDNF和HLA A2的表达,ELISA法测得病毒感染人胚肺成纤维细胞上清液中GDNF含量为450pg/ml。通过本实验,我们获得能共表达GDNF和反义HLA -A2的重组逆转录病毒,其转染的人成纤维细胞具有合成GDNF的能力。     

人GDNF在原代培养的大鼠成纤维细胞中的表达

目的：研究人脑胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在治疗神经系统疾病中的作用，克隆其前体蛋白cDNA序列，并用于真核细胞表达，方法：提取我国自建的脑胶质瘤BT325细胞总RNA，用逆转录PCR法扩增GDNF全长cDNA并构建其真核表达载体pCI-neo-GDNF，然后转染原代培养的成纤维细胞，免疫组织化学及原位杂交检测GDNF在细胞中的表达。结果：从国人脑胶质瘤细胞中扩增到558bp的GDNF全长cDNA，并在GDNF转基因原代成纤维细胞中检测到重组GDNF的转录和表达。结论：克隆到的GDNF全长cDNA片段，可用于真核细胞表达，其转基因细胞脑内移植后应能治疗包括帕金森病的内的神经系统变性疾病。     

人瘦素基因在胎盘中的分离鉴定及在大肠杆菌中的融合表达

目的 克隆人瘦素(leptin)基因,构建融合表达载体,实现在大肠杆菌中的高效表达.方法 从人胎盘中提取RNA,利用反转录聚合链式反应(RT-PCR),克隆到人的leptin基因编码序列,对该基因片段进行T载体克隆、酶切和PCR鉴定,并且对其进行序列分析.将leptin基因插入到原核表达载体PET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,并利用脱氧胆酸钠对表达蛋白进行纯化.结果 DNA序列分析表明,从胎盘中克隆的人leptin序列与文献报道的一致,酶切鉴定证实leptin基因正确地插入到了表达载体中,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳分析,人leptin基因在大肠杆菌中实现了高效融合表达,表达产物的分子量为20kD,经过纯化,得到了较纯的融合表达蛋白.结论 从人胎盘中成功克隆了leptin基因,构建了原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究leptin的生物学功能奠定基础.     

IgE低亲和力受体基因的克隆、表达及初步鉴定

目的利用基因重组的方法建立IgE低亲和力受体（FcεRⅡ）基因的原核表达系统。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞扩增FcεRⅡcDNA基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达载体FcεRⅡ-pGEX-4T-1,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta,诱导表达FcεRⅡ蛋白,通过割胶回收纯化,并用Western blot检测FcεRⅡ的表达。结果测序表明所扩增FcεRⅡcDNA基因,与已报道的序列一致。获得的重组蛋白经Western blot鉴定可以和人IgE特异性结合。结论成功构建了FcεRⅡ-pGEX-4T-1表达载体,获得了能和人IgE特异性结合的重组蛋白,为下一步FcεRⅡ单克隆抗体的制备及应用研究打下了基础。