体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化

目的: 探讨人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的过程.方法:采用体外细胞三维立体培养的方法在转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)的诱导下通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法探索外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的可能性及生长因子在其中所起的作用.结果:人胚胎面突外胚间充质干细胞在胶原中生长良好.培养4 d在TGFβ1+DNCP组中细胞出现核极化有很长的突起细胞平行排列.诱导的细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构.抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应.碱性磷酸酶活性增强.细胞在矿化液中能形成矿化结节.RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP).结论:三维立体培养下人胚胎面突外胚间充质干细胞在TGFβ1及DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞.本结果将外胚间充质干细胞作为前体诱导分化出成牙本质样细胞为研究牙齿的发育及分化提供了良好的模型和实验依据.     

体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚问充质干细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨人胚胎面突外胚间允质干细胞向成牙本质样细胞分化的过程。方法：采用体外细胞三维立体培养的方法，在转化生长因子B1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)的诱导下，通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法，探索外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的可能性及生长因子在其中所起的作用。结果：人胚胎面突外胚间充质干细胞在胶原中生长良好。培养4d，在TGFβ1 DNCP组中细胞出现核极化，有很长的突起，细胞平行排列。诱导的细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构。抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应。碱性磷酸酶活性增强。细胞在矿化液中能形成矿化结节。RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSFP)。结论：三维立体培养下，人胚胎面突外胚间充质干细胞在TGFB1及DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞。本结果将外胚间充质干细胞作为前体，诱导分化出成牙本质样细胞，为研究牙齿的发育及分化提供了良好的模型和实验依据。     

组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响研究

目的研究组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成牙本质向分化的影响。方法原代分离培养DPSCs,用流式细胞术和茜素红染色鉴定DPSCs。体外诱导DPSCs成牙本质向分化不同时间(0、3、5、7、14 d),qRT-PCR检测Jmjd3及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)的表达情况。用不同浓度(0、1、10μmol/L)的Jmjd3抑制剂GSK-J4处理DPSCs 14 d,q RT-PCR检测DSPP、DMP1的表达情况。结果原代培养的DPSCs表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD29、CD146,体外诱导培养具有成骨分化潜能。DPSCs成牙本质向分化过程中,Jmjd3、DSPP、DMP1表达水平均上调(P<0.05),且可能具有时间依赖性。10μmol/L GSK-J4处理DPSCs可明显抑制DSPP、DMP1的表达(P<0.05)。结论Jmjd3在DPSCs成牙本质向分化过程中发挥正调节作用,且与其去甲基化酶活性相关。     

经典Wnt通路调节骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞的分化

目的:探讨经典Wnt通路在骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化中的作用,以期为临床治疗牙髓损伤提供新策略。方法:用牙胚细胞条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞的分化,培养液内分别加入外源性Wnt激活剂Wnt3a/抑制剂DKK-1,检测经典Wnt通路中β-catenin、LEF1、TCF4及成牙本质样细胞特异表达物DSPP、DMP-1变化。结果:骨髓间充质干细胞经Wnt激活剂/抑制剂处理后,胞浆内β-catenin水平明显上升/下降,其下游核内转录因子LEF1、TCF4基因水平明显上升/下降,而细胞内DSPP、DMP-1的表达明显降低/升高。结论:Wnt信号通路抑制骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化。     

DLK1对人牙髓干细胞增殖和成牙本质分化的影响

目的研究DLK1在人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖分化中的作用。方法用免疫组织化学分析法来检测小鼠上颌第一磨牙中DLK1的表达。构建重组慢病毒使DLK1在hDPSCs中稳定过表达,用CCK8法和Ed U核素渗入法分别检测hDPSCs的细胞活力和增殖;hDPSCs进行成牙本质细胞向分化诱导后,通过ALP活性分析、ALP和茜素红染色,以及ALP、DSPP、DMP1等矿化相关基因的表达,研究hDPSCs的成牙本质细胞向的分化。结果 DLK1在小鼠上颌第一磨牙的成牙本质细胞和牙髓细胞中高表达,而且正常hDPSCs在成牙本质细胞向分化诱导14 d后,ALP蛋白水平增长1.6倍,DSPP增长1.16倍,DMP1增长1.42倍,DLK1增长1.54倍。hDPSCs中过表达DLK1后,相比于对照组增加了1.7倍,显著促进了细胞增殖,却抑制了其成牙本质细胞向分化。结论 DLK1在牙齿发育中发挥重要作用,DLK1过表达促进hDPSCs的增殖,但抑制其成牙本质细胞向分化。     

口腔组织病理学

口腔黏膜上皮细胞及成纤维细胞与PGA的生物相容性研究，槟榔碱诱导体外培养的血管内皮细胞凋亡研究，表皮生长因子对MDPC-23细胞增殖和ALP活性的影响，bFGF、TGF-β对人牙髓干细胞增殖和分化能力的影响，体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化，牙本质涎磷蛋白反义核酸对体外培养牙胚发育、矿化的影响．     

转录因子Klf4在人牙髓组织和牙髓成纤维细胞中的表达研究

目的研究转录因子Klf4在人牙髓组织和体外培养的牙髓成纤维细胞中的表达特点。方法采用免疫荧光技术检测Klf4和增殖标记物ki67在人牙髓组织及体外培养的牙髓成纤维细胞中的表达情况;利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Klf4在人牙髓细胞和矿化诱导14 d的表达情况。结果人牙髓中,Klf4主要表达在成牙本质样细胞和血管内皮细胞中;在体外培养的牙髓成纤维细胞中,与诱导前相比,Klf4在矿化诱导14 d时的表达明显增强。结论 Klf4在成牙本质细胞中呈特异性表达,可能与成牙本质细胞分化相关。     

CD146在人牙髓干细胞中表达的研究

目的:研究CD146在人牙髓干细胞及其诱导分化过程中的表达情况。方法:体外培养人牙髓干细胞,免疫荧光及流式细胞术检测CD146的表达。矿化诱导人牙髓干细胞分化,检测牙本质唾蛋白的表达,从mRNA及蛋白水平检测诱导过程中CD146的表达。结果:免疫荧光及流式细胞术证明人牙髓干细胞中CD146表达阳性。使用矿化诱导液培养人牙髓干细胞,通过检测到牙本质唾蛋白的表达,证明细胞已向成牙本质细胞方向分化;在此诱导过程中,CD146在人牙髓干细胞中的表达逐渐下调。CD146在人牙髓干细胞中有较特异性的表达,有可能作为其特异性标志物。     

Apical bud上皮诱导脂肪间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的研究

目的:通过体外及体内实验探讨大鼠切牙Apical bud上皮细胞诱导大鼠脂肪来源间充质干细胞向成牙本质细胞分化的能力。方法:分离培养大鼠脂肪间充质干细胞、Apical bud上皮细胞,制备Apical bud上皮条件诱导液并体外对ADSCs诱导7d,通过实时定量PCR方法检测成牙本质关键基因DMP-1及DSPP的表达。制备ADSCs及Apical bud上皮重组细胞团进行大鼠肾被膜下移植,8W后取材,分别采用HE染色、Masson三色法和免疫组化方法对移植生成物进行组织学检测。结果:Apical bud上皮诱导ADSCs后DMP-1及DSPP m R NA表达水平显著高于对照组。体内移植8W后H E染色可见管样牙本质和骨样牙本质样结构,Masson三色法可以观察到有绿色的牙本质样结构,免疫组化检测中CK14染色阳性,DSPP染色阳性。结论:Apical bud上皮细胞在体外能够诱导ADSCs向成牙本质细胞分化,且细胞重组在体内可以构建出牙本质样结构。     

p38β在矿化诱导液诱导的人牙髓细胞成牙本质向分化中的作用

目的研究p38β丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)对矿化诱导液诱导的人牙髓细胞(h DPC)成牙本质向分化的影响。方法体外培养hDPC,Western blot检测hDPC矿化诱导0、3、7、14 d后p38β蛋白表达情况;构建3条慢病毒载体p38β鄄shRNA并分别转染hDPC,Western blot及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测p38β蛋白及基因表达;设立空白对照组、矿化诱导(OM)组、OM+空载体(NC)组、OM+sh鄄p38β组共4组。成牙本质向矿化诱导1、7、14 d,实时荧光定量PCR检测成牙本质向分化指标牙本质涎磷蛋白(DSPP)、碱性磷酸酶(ALP)的基因表达;Western blot检测成牙本质向分化指标DSPP蛋白的表达;成牙本质向矿化诱导14 d,茜素红染色检测矿化结节的形成情况。结果 Western blot结果表明正常牙髓组织中存在p38β蛋白;成功构建p38β稳定低表达的hDPCs(实时荧光定量PCR显示三条序列干扰效率分别为55.4%、68.3%、54.2%);实时荧光定量PCR显示沉默p38β的hDPCs经矿化诱导后,成牙本质向分化指标DSPP、ALP基因表达水平显著降低,Western blot结果显示成牙本质向分化指标DSPP蛋白表达水平显著降低;茜素红染色结果显示,矿化诱导+sh鄄p38β组与空白对照组较另外两组的矿化结节数量明显减少。结论 p38β在OM诱导的h DPC成牙本质向分化中发挥作用。     

TLR9在成牙本质细胞中的表达

目的：研究成牙本质细胞中TLR9、DSPP基因表达特征及信号转导途径。方法：采用RT-PCR检测TLR9在小鼠牙髓组织中及TLR9、DSPP在成牙本质细胞系中的表达。用CpGODN-A和CpGODN-B刺激细胞,在时间梯度0、3、6、9、12、24h,检测TLR9、DSPP基因的表达特征。结果：TLR9mRNA在小鼠牙髓组织中有表达。TLR9、DSPPmRNA在成牙本质细胞中都有显著的表达,在CpGODN刺激下显著上调,在6h处于峰值。结论：TLR9在成牙本质细胞中有表达;TLR9的特异性表达对DSPP基因表达量有影响。     

牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响

目的：研究牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响,并初步探讨其机制。方法：从人牙髓中提取,培养牙髓干细胞,与皮肤成纤维细胞分组共培养,分为3组：对照组（单纯皮肤成纤维细胞培养）、条件培养基组（利用牙髓干细胞条件培养基培养成纤维细胞）、直接共培养组（采用Transwell共培养小室）。共培养后,进行 β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色,检测成纤维细胞的衰老情况;利用 CCK-8 法检测各组成纤维细胞的活性;流式细胞仪分析成纤维细胞的细胞周期变化;采用RT-PCR和 Western免疫印迹检测各组成纤维细胞衰老相关蛋白 p21、p53以及pRb 的mRNA和蛋白表达水平。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果：与空白组相比,后2组的皮肤成纤维细胞表达β半乳糖苷酶降低、增殖能力增强、G1期细胞减少而S期和G2期增多, p53、p21 mRNA和蛋白表达水平降低而PRb表达升高。结论：牙髓干细胞及其条件培养基具有抗皮肤成纤维细胞衰老的作用,为牙髓干细胞在抗皮肤衰老方面的临床应用提供了依据。     

aFGF和TGFβ1联合诱导猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化

目的建立猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化的体外诱导方案。方法联合应用aFGF和TGFβ1对体外培养的猪牙乳头细胞进行平面诱导,观察诱导后细胞的形态学变化,通过Von Kossa染色检测诱导后细胞的矿化能力,并采用免疫荧光染色和RT-PCR检测成牙本质细胞特异性标志物——DSP蛋白和DSPP mRNA在诱导后细胞中的表达。结果诱导后部分细胞出现细长的单侧细胞突起,在矿化液培养2周后形成典型的矿化结节,并且表达DSP蛋白和DSPP mRNA。结论联合应用aFGF和TGFβ1可以诱导体外培养的猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化。     

人脐带间充质干细胞与牙髓细胞体外共培养对细胞生物学的影响

目的: 研究人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）与经骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）诱导后的人牙髓细胞（human dental pulp cells,hDPCs）共培养对细胞生物学特性的影响。方法: 分别取原代培养的hUCMSCs和hDPCs,分别通过流式细胞术、成骨诱导、成脂诱导以及免疫组织化学染色鉴定细胞;使用BMP2诱导hDPCs,14 d后检查其DSPP、ALP、DMP1的mRNA表达情况;按照1∶1、1∶5、5∶1的比例直接共培养hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs,实时定量PCR检测其DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF、Nanog的mRNA表达情况。根据实时定量PCR结果选取1∶1组与单独培养hUCMSCs组、hDPCs组比较,分别培养21 d后进行茜素红染色,在酶标仪上于562 nm处检测沉淀物形成情况。采用SPSS21.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 直接共培养14 d后,1∶1细胞组的DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF的mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组显著升高（P<0.05）,而Nanog mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组降低（P<0.05）。茜素红染色结果显示,1∶1组的OD值显著高于hUCMSCs组（P<0.05）。结论: 将hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs按照1∶1比例共培养,可以诱导细胞向成牙本质细胞方向分化,并促进血管生成因子的表达。     

Effects of Notch ligand Delta1 on the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells in vitro

Objective

Notch signalling controls cell fate decisions in adult and embryonic tissues. The Notch ligand Delta1 is known to influence proliferation and differentiation of many kinds of tissue specific stem cells. In the present study, we investigated the role of Delta1 in the regulation of dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro.

Methods

DPSCs were isolated from impacted third molars. Expression of human Notch1, 2 and Delta1 in DPSCs were detected by immunochemistry. Delta1 overexpressed DPSCs were constructed by a retroviral method. Delta1 transduced DPSCs proliferation changes were examined by means of colony-forming assay, BrdU incorporation assay and cell cycle analysis. Delta1 transduced DPSCs were cultured in differentiation-inductive medium. The nodule formation and DSPP expression were evaluated.

Results

It was shown that the Notch receptors and Delta1 ligand were expressed throughout the proliferation and differentiation process of cultured dental pulp stem cells. Furthermore, it was found in our study that Delta1 could significantly enhance the proliferation of DPSCs and permit DPSCs differentiating into odontoblast-like cells in differentiation-inductive environments.

Conclusions

Our findings verified that Notch-Delta1 signalling was expressed in human DPSCs in vitro and appeared to play pivotal role in DPSCs proliferation enhancement and differentiation regulation, thereby consistent with the hypothesis that the Notch pathway controls stem cell fate during pulp regeneration.     

脂多糖对诱导分化的牙髓细胞形成矿化基质的影响

目的 研究脂多糖对诱导分化的牙髓细胞牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、骨钙素基因表达及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响. 方法 以脂多糖作用于诱导分化的牙髓细胞,用荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DSPP、骨钙素mRNA的表达,ALP试剂盒检测ALP活性改变. 结果 诱导分化的牙髓细胞在脂多糖刺激后ALP活性由(1156.10±100.60)pmol·h-1·ng-1下降为(884.80±26.72)pmol·h-1·ng1,荧光定量RT-PCR显示脂多糖能显著抑制DSPP和骨钙素mRNA表达,其中DSPP拷贝数由(176 301.62±13 269.77)下降为(39 396.32±12 018.08),骨钙素拷贝数由(4971.46±483.91)下降为(1104.67±63.37)(t=7.922,P<0.001). 结论 脂多糖能显著降低诱导分化的牙髓细胞合成有机基质.     

牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法：取妊娠12．5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,在牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT—PCR等方法,探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能。结果：面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白（DSP）呈阳性反应。RT—PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白-1（DMP-1）。结论：面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC—CM的作用下能分化为成牙本质样细胞,能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据。     

胰岛素样生长因子1诱导外胚间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化

目的：探讨SD大鼠颌突外胚间充质细胞向成牙本质细胞的分化机制。方法：在建立SD大鼠颌突外胚间充质细胞体外培养模型的基础上，用胰岛素样生长因子1(IGF-1)刺激外胚间充质细胞，采用倒置微镜和免疫组化等方法从形态学和功能方面检测细胞的变化。结果：在不含LIF的培养液中加入100ng/mL IGF-1培养的外胚间充质细胞，10d后在倒置显微镜下可见一些细胞出现单一细胞浆突起，似成牙本质细胞。消化后爬片经免疫组化抗DSP染色，部分细胞胞浆呈强阳性着色。结论：IGF-1可部分地诱导外胚间充质细胞向功能性成牙本质细胞分化，可能是牙齿发育过程中的重要细胞因子之一。