人转化生长因子β1质粒真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定人转化生长因子β1(TGF-β1)基因真核表达栽体。方法设计含XbaI和XhoI酶切住点的TGF-β1cDNA引物，采用RT-PCR法，扩增TGF-β1cDNA片段，纯化PCR产物，XbaI和XhoI双酶切并连接至pcDNA3。转化感受态大肠杆菌DH5α。酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果琼脂糖凝胶电泳显示，用XbaI和XhoI双酶切后可形成两条带，分子量分别为1．2kb和5．38kb。符合物理图谱，表明栽体成功构建，并且测序结果与预期结果完全一致。结论成功构建了人TGF-β1基因真核表达栽体。     

人胰岛素样生长因子1前体基因的重组、表达及纯化

目的 构建含有人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）前体编码基因的重组载体,在E.coli BL21中表达,并探讨其抗原性和应用价值。方法 用PCR法,从现有重组质粒pBakPAK 8／hIGF-1中,扩增编码hIGF-1前体的基因片段,经双酶切、纯化、连接后得到pET29a（＋）／hIGF-1重组体,再将其转化大肠杆菌BL21-CodonPlus并诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后,用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果 重组持粒pET29a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析证实构建成功。在大肠杆菌BL21-CodonPlus中经IPTG诱导表达,有一相对分子质量15000的重组蛋白hIGF-1前体,该蛋白经镍柱亲和层析获得了良好的纯化效果,具有特异的抗原活性。结论 成功地克隆并表达相对分子质量为15000的hIGF-1前体编码基因,为进一步制备抗hIGF-1抗体和后续hIGF-1生物学功能研究打下了良好基础。     

抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因(VH),并构建其原核表达载体.方法 从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出VH cDNA,用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT-PCR产物和原核表达载体pET28a( ),在T4 DNA连接酶作用下室温连接.重组质粒经酶切鉴定,阳性克隆测序并进行序列分析.结果 扩增出VH cDNA片段,大小约为370bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致.VH基因序列长度为366bp,编码122个氨基酸.VH基因属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ亚类.结论 成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因,并成功构建其原核表达载体.     

转化生长因子-β_1siRNA表达载体的构建

目的构建人转化生长因子β1(TGF-β1)基因siRNA质粒载体,为放射性肺损伤以及其他TGF-β1高表达疾病的基因治疗提供新的方法。方法根据人TGF-β1mRNA序列为模板,设计合成相应的寡核苷酸序列,经退火形成双链DNA片段,克隆到线性pRNAT载体中,用酶切方法对重组体进行鉴定,最后将构建的TGF-β1特异性siRNA质粒载体转染人胚肺成纤维细胞HFL-I细胞,通过通过荧光定量PCR检测和ELISA检测TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平,以及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到线性pRNAT载体质粒中,与对照组相比,TGF-β1mRNA水平及蛋白水平的表达量均受到明显抑制,人胚肺成纤维细胞凋亡明显增加,统计有显著性差异(P<0.05)。结论成功构建了人TGF-β1基因siRNA质粒载体,对于放射性肺损伤以及其他TGF-β1高表达疾病的基因治疗奠定了基础。     

重组人白细胞介素24蛋白对胰腺癌细胞生长的影响

目的构建人白细胞介素24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化后的IL-24融合蛋白导致人胰腺癌细胞(Panc-1)生长抑制的作用。方法用限制性内切酶从质粒pET30b-IL-24中酶切获取人IL-24cDNA片段。并将该片段与pET42a原核表达载体基因重组,在大肠杆菌中实现重组基因的表达,提取并纯化rhIL-24蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和Westernblot对表达产物进行鉴定。以不同浓度的重组蛋白IL-24与胰腺癌细胞Panc-1、正常肝胚细胞CCC-HEL-1共培养48h,同时设立相应浓度梯度的HIS-GST融合蛋白组对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的生长抑制情况。结果酶切结果证实,成功构建了pET42a-IL24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达。rhIL-24蛋白以浓度依赖性的关系抑制Panc-1细胞的生长,抑制率明显高于HIS-GST蛋白。结论rhIL-24蛋白对胰腺癌细胞Panc-1生长有抑制作用。     

细菌CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因定点突变对酶活性的影响研究

目的构建CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因突变体，比较突变前、后酶活性的变化，进一步阐明酶的分子结构特征和生化特性。方法利用重叠延伸PCR定点诱变技术将CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因Ser240（丝氨酸）AGC定点突变为Gly240（甘氨酸）GGC，分别构建CTX-M型酶的原核重组表达载体及其突变表达载体，重组载体经酶切鉴定和DNA测序鉴定后，转化大肠埃希菌JM109，比较突变前、后酶活性的改变。结果酶切鉴定和DNA测序鉴定表明CTX-M型酶的原核重组表达载体及其突变表达载体构建成功，转化大肠埃希菌JM109后，发现含野生型CTX-M基因的重组菌其酶活性与来源菌株相近，而含突变型CTX-M基因的重组菌未检测到酶活性。结论Ser240对于维持CTX-M型超广谱β-内酰胺酶活性具有重要作用。     

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

新基因Betatrophin原核重组蛋白表达及纯化

目的 构建人Betatrophin基因(h-Betatrophin)原核表达载体,诱导Betatrophin重组蛋白表达及纯化,为制备Betatrophin蛋白多克隆抗体及其功能研究打下基础.方法 体外克隆Betatrophin cDNA序列,酶切后连接到PET32 a(+)原核表达载体上,构建重组载体h-Betatrophin-PET 32 a,然后转入大肠杆菌BL 21(DE 3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE-考马斯亮蓝染色及Western blotting检测蛋白表达情况,然后用Ni-NTA His·Bind(R)Resin纯化目的蛋白.结果 成功构建Betatrophin基因原核表达载体,诱导表达Betatrophin重组蛋白表观分子量正确,经纯化后可以得到纯度较高的Betatrophin重组蛋白.结论 重组载体h-Betatrophin-PET 32 a转入大肠杆菌BL 21后通过诱导及纯化可获取到纯度很高的Betatrophin重组蛋白,为后期研究Betatrophin基因功能奠定基础.     

Daxx-C626-740原核细胞表达载体的构建与诱导表达

目的为了研制Daxx-C抗体并观察其在宫颈癌细胞中的应用效果,构建原核表达载体pET28a／DM626-740,将其在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物,鉴定其抗原性。方法用PRIMER5．0软件设计Daxx-C基因片段（氨基酸626-740）特异性引物,引入BamHl和SalI酶切位点,PCR扩增目的基因。将PCR产物连入载体pMD18-T,构建pMD18-T／DM626-740;然后,将BamHI和Sail酶切产物连入载体pET28a,经酶切鉴定及DNA序列分析后,构建原核表达载体pET28a／DM626-740。将其转化E．coliBL21,IPTG诱导表达,利用Ni琼脂糖凝胶层析柱纯化表达产物,Western-blot检测表达物与纯产物。结果双酶切和DNA测序结果显示,PCR正确扩增了Daxx-C基因片段并成功连入载体pET28a,构建了原核表达载体pET28a／DM626-740,该质粒在E．coli中诱导表达分子量约19kDa目的蛋白,且该蛋白能被抗Daxx抗体检出。结论构建的原核表达载体pET28a／DM626-740能在E.coli中表达目的的蛋白6His-DM626-740,并具有良好的抗原性。     

葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化

目的构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA-ZZ的pET-32a-ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化。方法用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ,构建重组表达质粒pET32-ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE),并用Q-Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化。结果得到了高效表达SPA-ZZ的pET32-ZZ表达载体,表达产物经SDS-PAGE检测相对分子质量为41 000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白。结论SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA-ZZ的应用奠定了一定的基础。     

BIS监测下全身麻醉在宫颈癌患者手术中应用

目的构建VEGFA基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,并检测其在人胚胎肾细胞（HEK293T）中的表达。方法以人脐血单核细胞的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增VEGFA基因,并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl中,构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA。经限制性核酸内切酶BglII和SalI酶切和DNA测序鉴定后,用脂质体法将pEGFP-VEGFA转染HEK293T细胞,转染后24 h和48 h采用荧光显微镜观察pEGFP-VEGFA的表达。结果 pEGFP-VEGFA被双酶切为4 697 bp和1 251 bp两条条带,测序结果证实VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致。在经转染的HEK293T细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pEGFP-VEGFA成功转染HEK293T细胞,并在其中得到了表达。结论成功构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,为进一步研究VEGFA基因的生物学功能奠定了基础。     

人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究

【摘要】目的 构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体,纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法 以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板,聚合酶链反应（PCR）扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体,并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。通过镍柱亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性,蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果 成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白;Western blot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符;KB纸片法证实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论 成功构建HD-5原核表达载体,经诱导表达后纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。     

重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141序列的克隆和表达载体构建

目的：构建人甲状旁腺激素相关蛋白1-141（hPTHrP1—141）基因的表达载体。方法：提取人基因组DNA，PCR扩增PTHrP1—141基因，将其克隆入原核表达载体pQE-30Xa，构建重组表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1—141。结果：重组载体pQE-30Xa／hPTHrP1-141经限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ酶切鉴定，得到符合预期大小的核酸片段。结论：表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1—141构建成功。     

WWOX基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的 构建人WWOX基因真核细胞表达载体.方法 采用RT-PCR方法 ,从人新鲜卵巢组织的总RNA中扩增出1245 bp的人WWOX cDNA片段, 然后用Hind III和Eco RI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA 3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 WWOX基因的序列测定结果 与文献报道完全一致,其真核细胞表达载体被成功构建.结论 成功克隆出WWOX基因,并成功构建其真核细胞表达载体.     

舟山眼镜蛇毒细胞毒素的克隆及原核表达

目的构建舟山眼镜蛇毒细胞毒素（Cytotoxin,CTX）原核表达载体（pET42α（＋）-CTX）,并在大肠杆菌中表达CTX重组蛋白。方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素（CTX）,测定N-末端氨基酸序列并据此设计引物,以提取的舟山眼镜蛇毒腺总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增细胞毒素基因序列（CTXcDNA）。将CTXcDNA定向克隆到原核表达载体pET42α（＋）中,双酶切图谱、PCR和DNA测序鉴定,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导,SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物,GSTrap FF亲和层析纯化融合蛋白CTX;Western-blotting鉴定。结果成功合成CTXcDNA,并构建原核表达质粒pET42α（＋）/GST-CTX,在大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中表达融合蛋白CTX,SDS-PAGE凝胶浓度扫描显示表达量占菌体总蛋白的28.9%,Western-blotting证实纯化蛋白为重组CTX融合蛋白（rCTX）。结论成功构建CTX基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得rCTX具有眼镜蛇毒CTX的抗原性。     

人血管内皮细胞生长因子受体sFlt-1在婴儿双歧杆菌中的表达和鉴定

目的:构建重组质粒pET32a-sFlt-1,并将其导入婴儿双歧杆菌,为婴儿双歧杆菌介导的sFlt-1基因转运系统在体内的抗血管生成作用奠定基础.方法:将编码血管内皮细胞生长因子受体sFlt-1 胞外区1-3 loop 316个氨基酸残基的cDNA插入到pET32a构建重组表达质粒pET32a-sFlt-1,转化婴儿双歧杆菌,阳性克隆菌经质粒提取、酶切鉴定,得到两条大小分别与基因sFlt-1及pET32a质粒片段大小相符的电泳条带,RT-PCR检测到外源性sFlt-1基因已成功导入婴儿双歧杆菌.结果:经酶切鉴定质粒pET32a-sFlt-1构建成功,转化入婴儿双歧杆菌,并证实其在mRNA水平可表达.结论:成功构建重组质粒pET32a-sFlt-1成功导入婴儿双歧杆菌, 并证实其在mRNA水平可表达.     

原癌基因Pokemon的克隆原核表达及纯化

目的克隆小鼠Pokemon(POKeryhroidmyeloidontogenicfactor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化。方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Westernblotting检测其特异性。结果限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Westernblotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性。结论采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础。     

β-半乳糖苷结合凝集素-9真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建β-半乳糖苷结合凝集素-9的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆β-半乳糖苷结合凝集素-9基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:DNA测序和酶切鉴定证明β-半乳糖苷结合凝集素-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论:成功构建β-半乳糖苷结合凝集素-9的真核表达载体pGal-9。     

Tipα基因原核表达质粒的构建及其诱导条件的优化

目的 构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白(Tipα)基因的原核表达载体,并优化诱导实验条件使其在大肠杆菌中表达.方法 提取幽门螺杆菌(H pylori) 26695菌株总DNA,用PCR方法扩增位于H.pylori 0596的Tipα基因编码序列.将Tipα基因与pET29a载体同时经BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切、纯化及连接后,构建pET29a-Tipα原核表达质粒,转化至宿主菌Top10F'中.优化实验条件使pET29a-Tipα原核质粒表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot方法进行鉴定.结果 pET29a-Tipα原核表达质粒经双酶切证实插入片段分子量为519 bp DNA条带,测序结果与H.pylori 0596的Tipα基因编码序列相一致.当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度为1.0 mmol/L,30℃诱导培养4h时,诱导目的蛋白表达量最高.Western blot结果证实,表达的重组蛋白可与Tipα抗体产生分子量约为21.8 KD的特异性条带.结论 成功构建了pET29a-Tipα原核表达质粒,并优化实验条件使其在大肠杆菌中表达了Tipα重组蛋白.