晚期糖基化终产物对肾小球系膜细胞表达Fractalkine的诱导作用

目的 探讨晚期糖基化终产物（AGE）对肾小球系膜细胞表达Fractalkine（Fkn）的影响. 方法 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,实验设AGE组:加入AGE BSA ( 100 mg/L);对照组:加入牛血清清蛋白（BSA）（100 mg/L）;PDTC组:先加入PDTC100 μmol/L 孵育1 h,再加入AGE BSA ( 100 mg/L) ;AGE抗体组:先加入抗AGE 抗体(100 mg/L IgG) 孵育2 h后,再加入AGE BSA ( 100 mg/L).培养所需时间收集细胞,检测Fkn mRNA及蛋白表达,激光共聚焦显微镜检测NFκB活化. 结果 AGE诱导体外培养的大鼠系膜细胞大量表达Fkn mRNA及蛋白,PDTC和AGE抗体显著抑制AGE诱导系膜细胞表达Fkn mRNA及蛋白.经AGE刺激后NF κB/P65迅速核转位,30 min达高峰。 结论 AGE通过活化NF κB诱导肾小球系膜细胞表达Fkn.     

PV-杀白细胞素和PDTC对THP-1巨噬细胞IL-1β表达的影响

目的探讨NF-κB信号通路在金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞毒素相关性肺损伤中的作用。方法实验前用100 nmol·L-1佛波酯孵育THP-1细胞48 h,充分诱导使其分化为巨噬细胞,分为三组,正常对照组、PDTC阻断组和rPVL刺激组,PDTC阻断组实验前1 h加入PDTC孵育,1 h后分别加入PBS和rPVL刺激其诱导分化好的巨噬细胞,采用ELISA检测细胞上清IL-1β的蛋白含量,RT-PCR检测IL-1βmRNA水平的表达,Western-blot检测NF-кB的表达。结果 PV-杀白细胞毒素能促进THP-1巨噬细胞分泌IL-1β,同时rPVL能活化NF-κB蛋白,NF-κB信号通路的特异性阻断剂能够抑制NF-κB蛋白的活化。结论 NF-κB信号通路蛋白激活及细胞因子大量释放可能是PVL相关肺损伤重要的发病机制。     

姜黄素对TNF-α诱导人肾小球系膜细胞增殖及PTX3表达的作用研究

目的本实验研究姜黄素(Cur)对TNF-α诱导人肾小球系膜细胞过度增殖以及PTX3过度表达的影响,并对其作用机制进行初步探究。方法本实验选择人肾小球系膜细胞进行体外研究。实验共分为6组:空白对照组、TNF-α组、Cur 20,40和80μmol·L~(-1)组和PDTC组。1. Cur对TNF-α诱导人肾小球系膜细胞过度增殖及PTX3过度表达的影响。(1)使用MTT法检测Cur对人肾小球系膜细胞过度增殖的影响。(2)使用免疫荧光法检测Cu对人肾小球系膜细胞PTX3过度表达的影响。2. Cur对TNF-α诱导人肾小球系膜细胞PTX3过度表达的作用机制研究。(1)使用Western印迹法检测Cur对人肾小球系膜细胞内NF-κB信号通路中蛋白水平及PTX3蛋白表达的影响。(2)使用qRT-PCR法检测Cu对人肾小球系膜细胞内NF-κB信号通路中mRNA水平及PTX3 mRNA表达的影响。结果 (1)Cur对TNF-α诱导人肾小球系膜细胞PTX3的过度表达有良好的抑制作用。(2) Western印迹结果表明,Cur明显抑制NF-κB P65和IKKβ的蛋白表达,增加IκBα的蛋白表达。(3)qRT-PCR结果表明,Cur明显抑制NF-κB、P65和IKKβm RNA表达,增加IκBα的mRNA表达。结论 (1) Cur可有效抑制TNF-α诱导人肾小球系膜细胞的过度增殖。(2) Cur对TNF-α诱导人肾小球系膜细胞PTX3的过量表达产生良好的抑制效果,极有可能是通过抑制NF-κB信号通路的激活而达到。     

外源性硫化氢抑制ox-LDL诱导血管内皮细胞组织因子的表达与降低ROS产生和抑制NF-κB活化有关

目的探讨外源性硫化氢抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导内皮细胞组织因子(TF)表达的机制。方法分别用不同浓度NaHS(25、50、100和200μmol·L-1)和50mg·L-1ox-LDL孵育人脐静脉内皮细胞(HUVECs),用RT-PCR和ELISA法检测HUVECs TF mRNA表达和蛋白含量,DCFH法测细胞内活性氧(ROS)的含量,Western blot测核蛋白转录因子(NF-κB)的活化。结果 ox-LDL明显诱导HUVECs TF mRNA的表达和蛋白含量增加;细胞内ROS水平升高,NF-κB活化。NaHS明显抑制了ox-LDL对TF mRNA和蛋白表达的诱导作用,同时降低ox-LDL诱导的细胞内ROS生成和NF-κB活化。此外,NF-κB抑制剂BAY 11-7082(10μmol·L-1)或抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(1 mmol·L-1)也能抑制ox-LDL诱导TF mRNA表达和蛋白含量的增加,同时降低细胞内ROS生成和NF-κB活化,该作用与200μmol·L-1NaHS的效应相似。结论 NaHS抑制ox-LDL诱导内皮细胞TF的表达与降低ROS产生和抑制NF-κB活化有关。     

核因子-κB和p38丝裂原活化蛋白激酶调节脂多糖诱导的气道上皮细胞白细胞介素8的表达

目的探讨脂多糖(LPS)对HBE4-E6/E7细胞IL-8表达的影响及Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR-4)、p38MAPK、NF-κB在其中的作用。方法在量效实验中,分别以0、0.1、1、10、100μg.L-1 LPS刺激HBE4-E6/E7细胞24 h;在时效实验中,以10μg.L-1 LPS分别刺激HBE4-E6/E7细胞0、8、12、16、24 h。以100μg.L-1 TAK-242、10 mg.L-1SB202190、50 mg.L-1 PDTC预处理HBE4-E6/E7细胞,以100μg.L-1 LPS刺激24 h。半定量RT-PCR法检测IL-8mRNA表达;酶联免疫吸附试验检测IL-8蛋白水平;凝胶阻滞分析实验检测NF-κB活性。结果 HBE4-E6/E7细胞IL-8 mRNA的表达随LPS刺激剂量的增加明显增加(P<0.05);在24 h内,以10μg.L-1 LPS刺激时,IL-8 mRNA的表达随刺激时间的延长明显增加(P<0.05)。TAK-242、SB202190和PDTC均能明显抑制LPS诱导的HBE4-E6/E7细胞IL-8 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。TAK-242和PDTC均能明显抑制LPS诱导的NF-κB的活性(P<0.05);SB202190不能抑制LPS诱导的NF-κB活性(P>0.05)。结论 LPS能诱导HBE4-E6/E7细胞IL-8的表达,TLR4、p38MAPK、NF-κB均参与调控LPS诱导的气道上皮细胞IL-8的表达,且p38 MAPK是通过不依赖NF-κB信号途径来参与调节的。     

硼替佐米对人胃癌SGC-7901细胞uPA、NF-κB表达的影响及与其侵袭力关系

目的硼替佐米对人胃癌SGC-7901细胞uPA、NF-κB表达的影响及与其侵袭力关系。方法 Brdu ELISA法测细胞增殖活性;Boyden小室培养测细胞的迁移率;Western blot测细胞uPA、NF-κB的蛋白水平;细胞免疫化学测NF-κB细胞表达及细胞定位。结果 (1)与对照组(无血清培养基组)相比,10%FCS组细胞增殖活性与迁移率明显增高(P<0.05);与10%FCS组相比,硼替佐米呈浓度依赖性抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖及迁移,硼替佐米浓度为(4μg.L-1),人胃癌SGC-7901细胞增殖活性与迁移率均明显降低(P<0.05);与PDTC组(10μmol.L-1)相比,两者无明显差别;(2)与10%FCS组相比,硼替佐米呈浓度依赖性抑制胃癌SGC-7901细胞uPA、NF-κB蛋白表达,硼替佐米浓度为(4μg.L-1)时uPA、NF-κB蛋白表达均明显降低(P<0.05);与NF-κB特异性抑制剂PDTC组相比,两组uPA、NF-κB表达均无明显差别;硼替佐米浓度为(4μg.L-1)能明显降低NF-κB核蛋白含量,与PDTC组相比,两者无显著差异(P>0.05);(4)细胞免疫化学结果示:硼替佐米(4μg.L-1)抑制10%FCS诱导人胃癌SGC-7901细胞NF-κB核移位。结论①硼替佐米抑制血清诱导胃癌SGC-7901细胞增殖迁移及uPA、NF-κB蛋白表达,②硼替佐米降低胃癌SGC-7901细胞侵袭力可能与其抑制NF-κB活性,降低UPA水平有关。     

氟伐他汀对尼古丁诱导血管内皮功能障碍的保护作用

目的观察尼古丁对人脐静脉内皮细胞白介素(IL)-8表达的影响,及氟伐他汀对尼古丁诱导人脐静脉内皮细胞表达的干预作用,以及这一过程中核转录因子(NF)-κB的调节机制。方法采用人脐静脉内皮细胞株传代培养,细胞随机分为4组,空白对照组:无血清DMEM培养基代替干预因素;尼古丁组:在无血清培养基中加入100 nmol/L尼古丁孵育内皮细胞24 h;氟伐他汀组:在培养基中10-5mol/L氟伐他汀孵育内皮细胞1 h后,100 nmol/L尼古丁孵育内皮细胞24 h;NF-κB抑制剂组:100μmol/L PDTC和100 nmol/L尼古丁孵育内皮细胞24 h,收集细胞标本及培养液。ELISA法检测内皮细胞培养液中IL-8的蛋白表达水平,Trans AM(tm)NF-κBp50检测试剂盒检测细胞NF-κB的活性。结果尼古丁组NF-κB活性较空白对照组明显升高(P<0.05);氟伐他汀组NF-κB活性较尼古丁组显著下降(P<0.05)。NF-κB抑制剂组较尼古丁组IL-8的蛋白表达明显下降(P<0.05),氟伐他汀组较尼古丁组IL-8的蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论尼古丁可通过激活人脐静脉内皮细胞NF-κB的活性,从而诱导IL-8的表达;氟伐他汀可拮抗尼古丁诱发的NF-κB的活化,抑制尼古丁诱导的IL-8的表达,还可拮抗尼古丁引起的内皮功能紊乱,改善内皮细胞功能。     

补体旁路激活致血管平滑肌细胞增殖活化及干预研究

目的研究补体旁路途径激活诱导人血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活化及其干预作用。方法采用CVF特异激活血浆补体旁路途经。将VSMC与补体旁路激活产物共同孵育,采用倒置相差显微镜和MTT法分别检测细胞形态变化和增殖活性,ELISA法检测培养上清中E-selectin、ICAM-1和VCAM-1含量,Western blot检测p-NF-κB p65、IKK和NF-κB p65蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测NF-κB p65转录活性,采用PDTC对上述指标的变化进行干预。结果补体旁路激活导致VSMC增殖活化,上调表达E-selectin、ICAM-1和VCAM-1,其中ICAM-1和VCAM-1含量在6 h达到高峰,E-selectin在12 h出现明显上调;VSMC经补体旁路激活产物刺激后,NF-κB p65磷酸化明显增加,NF-κB p65核内转录活性升高,IKK和NF-κB p65蛋白表达上调,PDTC对上述相关指标的变化有明确的干预作用。结论补体旁路激活可导致VSMC增殖活化,其机制与NF-κB信号通路活化有密切关系,且NF-κB抑制剂PDTC对其增殖活化具有明显的干预作用。     

鹅去氧胆酸抗脂多糖诱导的BV2小胶质细胞炎症反应作用及机制

目的研究鹅去氧胆酸(CDCA)抗脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的作用及其机制。方法 BV2细胞与CDCA 25～100μmol·L~(-1)预孵育2 h,加LPS 200 mg·L~(-1)继续培养22 h,采用Griess试剂法检测一氧化氮(NO)含量;Western印迹法检测细胞内环氧合酶2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达水平;RT-PCR法检测细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL~(-1)β和G蛋白偶联受体5(TGR5)mRNA表达水平。BV2细胞与CDCA 25～100μmol·L~(-1)预孵育2 h,加入LPS 200 mg·L~(-1)继续培养1 h,Western印迹法检测NF-κB、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)磷酸化水平;细胞免疫荧光法观察NF-κB入核情况。结果与正常对照组相比,模型组培养基中NO含量显著增加(P<0.01);COX-2和iNOS蛋白表达水平升高(P<0.05,P<0.01);TNF-α,IL-6和IL~(-1)βmRNA表达显著上调(P<0.01);TGR5 mRNA表达显著下调(P<0.01);并且NF-κB,IκBα和AKT磷酸化水平显著增加(P<0.05,P<0.01),NF-κB入核增多。与模型组相比,CDCA显著减少培养基中NO含量(P<0.01),降低COX-2和iNOS蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01);显著下调TNF-α,IL-6和IL~(-1)βmRNA表达(P<0.01);显著上调TGR5 mRNA表达(P<0.01)。与模型组相比,CDCA显著降低NF-κB,IκBα和AKT磷酸化水平(P<0.05,P<0.01),并观察到NF-κB核转位减少现象。结论 CDCA可显著抑制LPS诱导BV2细胞炎症反应,其作用机制可能与激活TGR5、抑制Akt/NF-κB信号通路相关。     

吡咯烷二硫代氨基甲酸盐下调基质金属蛋白酶9表达机制的研究

目的探讨TNF-α诱导的肺泡巨噬细胞(AM)性基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的信号通路以及吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对MMP-9表达的影响机制。方法从慢性阻塞性肺疾病患者支气管肺泡灌洗液中分离与培养AM,以PDTC预处理AM,以TNF-α或IL-1刺激AM。半定量逆转录-聚合酶链反应法检测MMP-9 mRNA的表达;Western blot检测MMP-9蛋白的表达及TNF-α或IL-1诱导的IκBα磷酸化水平。凝胶阻滞分析实验检测NF-κB活性。结果TNF-α上调AM源性MMP-9 mRNA和蛋白的表达(P<0.05);PDTC抑制TNF-α诱导的MMP-9的表达(P<0.05)。PDTC对TNF-α或IL-1诱导的IκBα的磷酸化均无抑制作用(P>0.05)。PDTC对TNF-α或IL-1诱导的NF-κB的活化均有抑制作用(P<0.05);且PDTC不能在体外直接抑制NF-κB的DNA结合活性(P>0.05)。结论NF-κB在TNF-α诱导的AM源性MMP-9的表达中起着重要作用;PDTC可能通过抑制泛素化-蛋白酶小体途径来下调TNF-α诱导的AM源性MMP-9的表达。