应用RT-PCR构建人表皮生长因子基因真核表达质粒

目的体外克隆及构建带信号肽的人表皮生长因子(hEGF)基因真核表达质粒。方法设计人表皮生长因子(hEGF)基因和信号肽基因引物,采用RT-PCR技术从胎肾组织总RNA中扩增出hEGF基因和信号肽基因序列,克隆入pGEM-T载体,酶切鉴定和序列分析后经T4连接酶连接并克隆入表达质粒pcDNA3.1( ),再次酶切鉴定和序列分析。结果RT-PCR扩增产物电泳获得约90 bp和180 bp条带,与hEGF及其信号肽cDNA大小符合;克隆入T载体后经序列分析与hEGF及信号肽基因一致,克隆入pcDNA3.1( )质粒后双酶切获得约230 bp和5.4 kb条带,再次测序与hEGF cDNA一致。结论成功构建带信号肽的hEGF基因的真核表达质粒。     

HCMV IE1蛋白对小鼠Raw264．7细胞株TNF-α、IL-1β表达的影响

目的构建人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)立即早期蛋白1(IE1)真核表达载体pcDNA3.1(-)-IE1,将其转染小鼠巨噬细胞Raw264.7细胞株,观察IE1蛋白在细胞中的表达及其对小鼠巨噬细胞Raw264.7分泌细胞因子功能的影响。方法双酶切pQE30-IE1,回收目的基因IE1,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),筛选、鉴定阳性克隆得pcDNA3.1(-)-IE1;提取质粒pcDNA3.1(-)-IE1,通过Super FectTM脂转染试剂将质粒pcDNA3.1(-)-IE转染Raw264.7细胞,Western-blot鉴定IE1蛋白的表达,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测培养上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β的表达水平。结果与结论①成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-IE1;②pcD-NA3.1(-)-IE1能在Raw264.7细胞中表达;③IE1的表达可上调巨噬细胞TNF-α、IL-1β的表达水平。     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:采用基因工程技术,将转化生长因子β前体相关蛋白(LAP)通过基质金属蛋白酶(MMP)水解部位与人可溶性TNFⅠ型受体(hsTNFRⅠ)连接,构建pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白真核表达载体,获得LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白。方法:将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3.1( ),得到pcDNA3.1/MMP重组体;将TGF-β1的LAP段和hsTNFRⅠ与MMP水解部位连接,获得pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ真核表达载体。测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果:酶切及测序结果证实pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ重组载体构建成功,转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ,并获得融合基因的瞬时表达,为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

奈瑟氏淋球菌外膜蛋白PIA基因的克隆、真核表达与鉴定

目的克隆奈瑟氏淋球菌外膜蛋白PIA基因,构建稳定的真核重组表达载体,并在HELA细胞中表达。方法根据淋球菌PIA基因序列,利用Primer Premier5.0生物学软件设计一对特异性扩增引物,以淋球菌国际标准株基因组DNA为模板,PCR扩增除掉信号肽后PIA基因开放读码框（ORF）,将其插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建含目的基因的pcDNA3.1（＋）/PIA重组质粒,PCR及酶切鉴定重组载体,脂质体转染HELA细胞,以间接免疫荧光法检测PIA基因在HELA细胞中的表达。结果成功构建了pcDNA3.1（＋）/PIA重组质粒;pcDNA3.1（＋）/PIA能在HELA细胞中高效表达PIA蛋白。结论重组质粒pcDNA3.1（＋）/PIA构建成功并在HELA细胞中高效表达了PIA蛋白,为该蛋白的抗原性及功能学研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

日本血吸虫ATP合酶脂结合蛋白样基因DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达

[目的]构建日本血吸虫ATP合酶脂结合蛋白样基因(ATP synthase lipid-binding protein-like protein gene of Schistosoma japonicum, SjAslp)核酸疫苗,并观察其在真核细胞中的表达情况.[方法]根据GenBank中SjAslp cDNA全长设计特异性引物,从实验室已构建好的重组质粒pBCSK /SjAslp中扩增出SjAslp cDNA全长,将其克隆入pUCm-T.载体,再亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )构建成日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶全基因核酸疫苗(pcDNA3.1( )/SjAslp);经PCR、酶切及测序鉴定后,利用电穿孔将其转染HeLa细胞.采用免疫细胞化学法检测SjAslp在HeLa细胞内的表达情况.[结果]成功构建SjAslp核酸疫苗,免疫细胞化学技术检测其能在HeLa细胞浆内表达.[结论]pcDNA3.1( )/SjAslp核酸疫苗能在真核细胞内表达,为抗日本血吸虫核酸疫苗的研制打下了必要的基础.     

肠上皮细胞中性氨基酸载体B0AT1的真核表达及稳定转染体系的建立

目的: 构建可表达人中性氨基酸载体B0AT1基因的真核表达载体,建立重组质粒转染的Hela细胞系,筛选出稳定表达人B0AT1的细胞株. 方法: 提取人正常小肠上皮细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出B0AT1基因片段,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后,将其插入至真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-B0AT1,转化E.coli DH5α菌株感受态细胞,将阳性克隆脂质体法转染Hela细胞,经G418筛选获得稳定表达株,用RT-PCR法检测B0AT1基因的mRNA表达. 结果: 从小肠上皮细胞中成功克隆到人B0AT1基因.酶切和序列测定表明已成功构建真核表达载体pcDNA3.1-B0AT1,将此重组质粒转染的Hela细胞,可稳定表达人B0AT1基因,并筛选出稳定表达B0AT1的Hela细胞系.氨基酸摄取实验证实,转染pcDNA3.1-B0AT1的Hela细胞具有B0AT1基因的生物学活性. 结论: 重组人中性氨基酸载体B0AT1克隆成功,并在Hela细胞中获得稳定表达.     

小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素(resistin)基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中,通过RT-PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1(-)真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363bp相符;重组pGEM-T被EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。     

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(adenynate kimse,AK)基因真核表达载体并予以鉴定.方法 根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T Simple载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性.克隆载体PMD-18T-AK经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切,得到含这2个酶切位点之AK DNA片段,T4连接酶连接到含有这2个酶切位点的真核表达载体pcDNA3.1( ),构建出重组真核表达载体pcDNA3.1( )-AK,经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实DNA片段大小的正确性.结果 经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实含大小正确的AK DNA片段.结论 成功地构建了基因真核表达载体.     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

人细胞间黏附分子1cDNA的克隆及表达载体的构建

目的 构建人细胞间黏附分子-1真核表达重组体pcDNA3．1hisB-ICAM-1。方法 设计、合成ICAM-1基因序列特异性引物，从肝癌组织中提取总RNA，以此为模板经RT-CR扩增人ICAM-1的cDNA片段；然后将其克隆到pGEM-T Easy Vector，构建中介重组体(pGEM-ICAM-1)，再克隆，构建真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1，经菌落PCR和限制性酶切有目的片段出现，进行DNA序列分析。结果 RT-PER扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1622bp，中介重组体(pGEM-ICAM-1)，酶切后与真核表达载体连接，根据酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达重组体pcDNA3.1HisB-ICAM-1；结论：成功构建了真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1。     

hMAM与人HSP70融合基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)与人热休克蛋白70(hHSP70)融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,经酶切测序分析后,与人HSP70基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建了融合基因真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70。将重组载体电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果:成功扩增了人HSP70基因与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSP70的融合基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

pcDNA3．1（＋）／NspA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建pcDNA3.1( )淋病奈瑟菌外膜蛋白—奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface Protein A,NspA)基因真核表达载体,为研制淋病奈瑟菌核酸疫苗奠定基础。方法根据淋病奈瑟菌NspA基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出NspA基因片段,将扩增的产物连接于测序载体pUCm-T上,并构建重组体pcDNA3.1( )/NspA,进行酶切、PCR及测序鉴定。结果NspA基因体外扩增产物大小约为525 bp。所构建的pcDNA3.1( )/NspA重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片断的大小相符;测序结果与GenBank中收录的NspA全长序列一致,表明pcDNA3.1( )/NspA真核表达载体构建正确。结论成功地构建了淋病奈瑟菌真核重组表达载体pcD-NA3.1( )/NspA,为NspA蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌核酸疫苗的研制提供了物质基础。     

真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的构建pcDNA3．1－RASSFl真核表达载体,并检测其对肝癌细胞系HepG2凋亡的影响。方法应用聚合酶链反应技术从人RASSFlcDNA中扩增出RASSF1基因后,以内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切,将其克隆人用相同酶处理的载体pcDNA3．1;将重组质粒pcDNA3．1－RASSF1转染肝癌HepG2细胞,应用Westernblot法检测RASSF1的表达水平;用AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡情况。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3．1．RASSF1构建成功;Westernblot法结果表明转染pcDNA3．1-RASSF1后HepG2细胞中RASSFl表达升高;AnnexinV／PI法用流式细胞术检测凋亡,空白组、pcDNA3．1组和pcDNA3．1-RASSFl组HepG2细胞的凋亡率分别为（5．8±0．42）％、（7．48±0．68）％和（35．1±3．15）％。结论真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1构建成功;RASSF1蛋白在HepG2细胞中高表达,并促进细胞凋亡。     

肿瘤转移抑制基因nm23-H1在人肺癌细胞的表达及其检测

目的：选择已分离鉴定的人巨细胞肺癌细胞高转移亚型PGBEl，转染肿瘤转移抑制基因nm23-H1，以获得稳定表达nm23-H1基因的人肺癌细胞株。方法：采用亚克隆方法获得pcDNA3．1（-）／nm23-H1真核表达载体并进行双酶切和测序鉴定；应用脂质体转染法将重组质粒转染PGBE1细胞；用G418筛选获得阳性细胞克隆，命名为pcDNA3．1（-）／nm23-H1-PGBE1细胞株；用RT-PCR法半定量检测nm23-H1基因的mRNA表达水平和免疫组化法检测nm23-H1基因的蛋白质表达。结果：真核表达载体pcDNA3．1（-）中正确插入了具有完整阅读框的nm23-H1基因；倒置显微镜下观察到经G418筛选出的稳定转染的PGBE1细胞，形成“小岛”；RT-PCR和免疫组化显示转染的细胞中nm23-H1 mRNA和蛋白质水平表达均增高。结论：建立了稳定表达nm23-H1基因的PGBE1转染细胞株，可用于进一步研究肿瘤转移的分子机制。     

人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.     

帕金森病PINK1蛋白真核表达载体pcDNA3．1-myc／PINK1的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。