Western-blot法测定风疹病毒特异性抗原

①目的初步确定风疹病毒(RV)特异性抗原的相对分子质量，为RV特异性抗原的进一步纯化奠定基础。②方法从RV感染人的胚肺成纤维细胞中粗提蛋白，应用RV标准血清，以免疫印迹法鉴定特异性RV抗原，并参照蛋白分子质量Marker，初步确定其相对分子质量。③结果在相对分子质量为59000，42000～51000，34000，17000的位置出现几条特异性显色带，其中以相对分子质量为34000及17000左右的条带显色较深。④结论RV特异性细胞工程抗原的相对分子质量主要在34000及17000左右。     

卫氏并殖吸虫成虫的特异性诊断抗原

目的：寻找诊断并殖吸虫病的特异性抗原。方法：应用SDS-PAGE和Western blot对卫氏并殖吸虫成虫可溶性抗原中的蛋白组分进行分析。结果：卫氏并殖吸虫成虫可溶性抗原蛋白经SDS-PAGE后显示14条蛋白带，其中相对分子质量为53000、3l000、25000、16000、11000是主带；相对分子质量为53000和34000的条带可与华支睾吸虫病患者血清反应；108000、94000、65000的条带可与血吸虫病患者血清反应；58000、53000、43000的条带可与旋毛虫感染的大鼠血清、小鼠血清及旋毛虫病患者血清反应。37000的蛋白带只能被斯氏狸殖吸虫感染的大鼠血清和并殖吸虫病患者血清所识别，而不与华支睾吸虫病、血吸虫病患者血清、旋毛虫感染的大鼠和小鼠血清、旋毛虫病患者血清、正常大鼠、小鼠血清及正常人血清发生交叉反应。结论：卫氏并殖吸虫成虫可溶性抗原中相对分子质量为37000的蛋白组分为卫氏并殖吸虫成虫的特异性抗原，可用于并殖吸虫病的免疫学诊断及血清流行病学调查．     

风疹病毒E1膜抗原的原核表达与纯化鉴定

①目的 重组表达风疹病毒（RV）E1膜蛋白的抗原决定簇多肽，探索制备用于RV血清学检测的基因工程抗原。②方法 通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增RV E1膜蛋白212-241位氨基酸的编码基在片段nt8886-8976,将此片重组于质粒载体pGEX4T-2上，在大肠杆菌中表达目的多肽片与谷胱甘肽巯基转移酶（GST）的融合蛋白，纯化融合蛋白并经Western-Blot鉴定其抗原性。③结果 有效的表达出相对分子质量约为33000的融合蛋白，经Western-Blot检测结果证实可与RV的单克隆抗体发生特异性结合反应。④结论 在原核表达系统中有效地表达了保留风疹病毒抗原性的融合蛋白，为今后进一步研制RV重组抗原提供了方法学和实验室基础。     

截短型A组轮状病毒VP6在E.coli中的高效表达

目的：研究A组轮状病毒（RV）组特异性抗原（VP6）片段的表达，为RV免疫检测技术提供材料。方法：以pcDNA3.1 VP6为模板，通过PCR扩增得到VP6的截短突变体编码基因VP6 1，将其插入谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体pGEX 5X，在E.coli中用异丙基 β D 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。对表达产物进行SDS PAGE和Western blot分析。通过改变宿主菌、培养基、IPTG浓度和培养温度等条件，提高目的蛋白的可溶性表达水平，使用GST Sepharose 4B亲合层析进行初步纯化。结果：选定VP6 氨基酸12～143片段为目的蛋白， PCR扩增其396?bp的编码基因片段，构建出pGEX 5X VP6 1。将该重组质粒转化E.coli后，SDS PAGE和Western blotting 分析均显示，含有截短VP6蛋白的重组融合蛋白GST::VP6 1在E.coli中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％。该蛋白主要以包涵体形式存在，经条件优化，最终通过低浓度IPTG、低温诱导提高重组蛋白的可溶性表达水平，GST亲和层析可对其进行初步纯化。结论：VP6 1蛋白在E.coli中可被高效表达和纯化，为下一步制备抗VP6的特异性单克隆抗体并用于免疫检测打下基础。     

重组钩端螺旋体多抗原位点同源合成基因的表达及其抗原性鉴定

目的：构建重组钩端螺旋体(钩体)优势抗原表位原核表达系统,以期获得高纯度的钩体优势抗原表位重组融合蛋白,为进一步研究钩体快速检测方法奠定基础。方法：利用基因重组的方法构建表达质粒pET-rLP。经IPTG诱导后,获得高效表达带组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白,包涵体蛋白经尿素变性溶解,采用镍离子亲和纯化,利用SDS-PAGE、Western blotting和间接ELISA法鉴定。结果：在相对分子质量为20 000处有1条特异性蛋白条带,为重组钩体优势抗原表位融合蛋白;ELISA结果显示其可与钩体阳性血清特异性结合,而与其他血清无交叉反应。结论：成功构建重组钩体优势抗原表位原核表达系统,并获得高纯度的重组钩体优势抗原表位融合蛋白。     

结核杆菌分泌蛋白Ag85A基因的克隆、表达及其诊断价值

目的：获得重组抗原85A(rAg85A)，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法：应用基因工程技术克隆、表达、纯化Ag85A蛋白，通过Western印迹分析其抗原性。分别以结核分支杆菌纯蛋白衍生物（PPD）或纯化的rAg85A蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）及结核病一步检测血清中抗结核抗体。结果：重组质粒pET30a-Ag85A测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的2％左右，Western印迹分析它与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化的rAg85A样品纯度约85％左右，每100ml培养菌可获得2mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值 2s为正常界限值，一步法的特异性和敏感性分别为87.9％和65.6％；PPD分别为93.9％和62.5％；rAg85A分别为93.9％和15.6％。结论：pET30a-Ag85A大肠杆菌工程菌能以包涵 体形式表达rAg85A蛋白，该蛋白具有较高的抗原特异性，但检测抗结核抗体的灵敏度低。     

嗜肺巴氏杆菌外膜蛋白和脂多糖提取及其活性的初步研究

目的　提取嗜肺巴氏杆菌外膜蛋白 (OMP)和脂多糖 (LPS) ,测定其稳定性和抗原性 ,探讨其作为诊断抗原的可能性。方法　选取具有代表性的嗜肺巴氏杆菌 15株及参考株共 16株 ,提取OMP、LPS ,通过SDS -PAGE、Westernblot、ELISA等方法在稳定性、抗原性等方面与全菌抗原 (WC)进行比较。结果　 16株嗜肺巴氏杆菌OMP的SDS-PAGE图谱基本一致 ,不同培养基成分、培养时间和不同体外传代次数的提取物均显示 5条带 ,相对分子质量大约是 (17、2 6、31、37、4 1)× 10 3。其中 5株嗜肺巴氏杆菌的LPS为光滑型和粗糙型LPS的混合物 ,主带相对分子质量在 14 .4× 10 3左右。外膜蛋白和脂寡糖提取物保持了其抗原反应性和免疫原性。OMP和LPS具有种和型的特异性。OMP的 5条条带抗原性存在差异 ,相对分子质量 (2 6、37)× 10 3的蛋白不具有抗原性 ,相对分子质量 17× 10 3的蛋白抗原为受试菌株的共同抗原 ,(31、4 1)× 10 3抗原具有大鼠株和小鼠株的特异性。LPS表现出较强的型的特异性。结论　本研究提取的OMP和LPS活性稳定 ,并保持了抗原性和免疫原性。     

旋毛虫成虫可溶性抗原SDS—PAGE及Western—blot分析

目的：初步分析旋毛虫成虫可溶性抗原的蛋白组份及免疫原性。方法：采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和氨银染色对该抗原进行蛋白组份的分析，采用Ｗｅｓｔｅｒｍ－ｂｌｏｔ分析该抗原的免疫原性。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ可显示４０条多肽，其中主 ８条；抗血清可特异性地识别１６条多肽抗原，其中有３条主带。结论：实验结果表明旋毛虫成虫可溶性抗原的蛋白组份及抗原性均较复杂。     

卫氏肺吸虫重组抗原的制备及初步应用研究

目的：纯化重组细菌Pw-1／pRSET B／BL21的表达产物肺吸虫重组抗原，复性后以ELISA法检测肺吸虫病患者、其他寄生虫病患者和正常人血清，评价其敏感性、特异性和应用前景。方法：通过分步洗涤及透析对细菌重组蛋白进行初步纯化．进一步做快速液相层析纯化，比较前后两法的纯化效果。初步纯化产物经氧化／还原型谷胱苷肽复性后即为重组蛋白抗原(以下简称重组抗原)。用该重组抗原，以ELISA法检测肺吸虫、血吸虫、肝吸虫、囊虫和包虫病患者以及正常人血清中相应抗体，并与卫氏肺吸虫粗抗原做比较。结果：经分步洗涤及透析纯化后的重组抗原纯度已较高，快速液相层析进一步纯化效果不明显。以初步纯化后经复性的重组抗原进行ELISA法检测肺吸虫病患者血清，敏感性为91．07％，与其他寄生虫病患者和正常人血清均无交叉反应；粗抗原检测肺吸虫病患者血清敏感性虽为100％，但与其他寄生虫病患者和正常人血清交叉反应率分别为：血吸虫病11．43％，肝吸虫病4．84％，囊虫病3．22％，包虫病5．88％，正常人为2．5％。结论：研究制备的重组抗原应用于肺吸虫病的免疫诊断特异性较高。     

风疹病毒单克隆抗体的研究

用风疹病毒（RV）Gos-10株免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与Sp2/0细胞融合，用ELISA法筛选分泌RV McAb的杂交瘤细胞6株，经克隆培养后发现其中的1A9株能稳定分泌高效价特异性McAb，经鉴定为IgG2a，经ELISA检测、抗原吸收试验、中和试验及HI试验证明该McAb是种特异性的，能与各株RV发生交叉反应，而与其它种病毒不发生反应，证明此McAb对RV抗原有高度特异性与敏感性，可用以制备诊断试剂，实现风疹的早期、快速诊断和基础理论研究。     

特异性SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位初步分析

目的：用分段表达纯化的SARS冠状病毒（SARS-CoV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid N蛋白）制备针对该蛋白不同区域抗原表位的高特异性单克隆抗体（McAb）,初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。方法：用分段表达纯化的SARS～CoV的N蛋白（分别记为N1蛋白、N2蛋白）分别免疫Balb／c小鼠制备McAb,通过检测其亚类、效价及相对亲和力鉴定McAb的生物学特性,以Western blot鉴定单克隆抗体特异性,并对McAb结合表位进行初步分析。结果：筛选出7株抗SARS-CoV N1蛋白及2株抗SARS-CovN2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定6株为IgG1,2株为IgG2b,1株为IgG3,腹水效价10^5以上;亲和常数达10^8以上。Western blot证实所获的单克隆抗体可与SARS-CoVN蛋白发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示2株N1 McAb识别相同的抗原表位,其余均识别不同的抗原表位。结论：通过分段表达纯化的SARS-CoVN蛋白而制备的特异性针对SARS-CoV N蛋白不同区域抗原表位的单克隆抗体中,N1单抗识别N蛋白N端（1-549bp）,N2单抗识别N蛋白C端（496～1269bp）,可初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型Stocker株糖蛋白G基因在PBV221原核表达载体的表达与纯化

目的：构建Ⅰ型单纯疱疹病毒型特异性包膜糖蛋白G基因片段的表达载体,进行原核表达,并纯化目的蛋白。方法：用PCR法扩增HSV1-gG强抗原决定簇的基因片段,将该段基因克隆于PBV221表达载体。转化大肠杆菌DH5α,温控诱导目的蛋白表达,表达产物以包涵体形式存在。用SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,经离子交换纯化获得较纯的目的蛋白。结果：获得了重组的原核表达载体及相对分子质量为14．7kD的重组蛋白,并纯化获得了纯度大于90％的目的蛋白抗原。结论：成功克隆和表达了高纯度的HSV1-gG蛋白。     

甘草的免疫学鉴定方法研究

目的 利用种属特异性蛋白建立一种生药甘草的免疫学鉴定方法。方法 选用生药甘草为实验对象，利用抗甘草总抗原血清并结合Western—blot的结果确定甘草种属特异性蛋白(RGP)。分离纯化该蛋白抗原并制备和生物素标记其特异性抗体，建立夹心式ELISA法用于甘草的分析鉴定。结果 该方法灵敏度高、专属性强，对不同产地及品种的甘草显示了良好的特异性，可以用于生药的鉴定和分析。结论 以甘草自身的特异性蛋白为指标的免疫学分析方法，将为生药甘草的品种鉴定及中药材的质量管理提供一条新的途径。     

狂犬病毒核蛋白在大肠杆菌中的克隆及高效表达

目的构建原核表达系统对狂犬病毒（RV）CVS株的核蛋白（NP）进行表达，并对其进行初步的血清学鉴定。方法以重组质粒Teasy—RVNP为模板，利用PCR方法扩增狂犬病毒（RV）CVS株核蛋白（NP）的DNA片段，并重组入原核高效表达载体PET-15b。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。在大肠杆菌BL21中进行表达。结果SDS-PAGE电泳结果表明，在51KDa处有一条蛋白表达带Western-blot分析证明，51KDa蛋白带可与抗体血清发生特异性反应。结论成功构建了PET-15b，NP原核表达载体，表达产物为狂犬病毒核蛋白，为生产纯度高且价廉的RVNP抗原奠定了基础。为制备测定RVNP抗体的免疫诊断试剂提供了条件。     

SARS冠状病毒IgG的ELISA检测方法建立

目的：建立适用于SARS冠状病毒临床辅助诊断的ELISA检测方法。方法：以重组SARS冠状病毒结构蛋白作为抗原包被，检测SARS冠状病毒IgG抗体，确定被检血清的最佳稀释度，通过分析52例SARS临床确诊患者及50例其他呼吸道疾病患者、50例正常人群组血清的检测结果。评价其特异性和灵敏度。结果：SARS冠状病毒结构蛋白抗原包被浓度为2μg／ml；被检血清的稀释度为1：50；将酶标反应板37℃放置3天，OD值下降小于5％，对同一批标本在20天内重复3次，阳性、阴性测定结果一致。批内变异系数CV(％)小于5％。结论：我们采用基因重组技术制备的SARS冠状病毒结构蛋白作为抗原建立的EUSA检测方法克服了用SARS病毒颗粒作为抗原的不足，具有更高的特异性和灵敏度，适用于SARS的临床辅助诊断。     

抗人肺表面活性物质相关蛋白A单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

目的 制备抗人肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)单克隆抗体并对其特性进行鉴定。方法 以自行制备的SP-A蛋白作为抗原免疫Balb／c小鼠，建立分泌抗人SP-A单抗的杂交瘤细胞株，诱发小鼠产生单抗腹水，用(NH4)2SO4盐析纯化腹水，用间接ELISA法测定单抗效价，用Westemblotting测定抗体特异性。结果 建立了3株能持续分泌抗SP-A单抗的杂交瘤细胞株，其中286杂交瘤细胞株抗体效价最高，其染色体数目均大于100条。间接ELISA法测定腹水和细胞培养上清效价，分别为l：50000和l：10000。用Westem blotting在SP-A蛋白泳道上相对分子质量3l000左右位置出现明显的一条染色条带。结论 自行制备的抗人SP-A单抗，其具有特异性强、效价高的特点。     

抗HIF-1tx肺腺癌人源单链抗体的筛选和初步鉴定

目的 从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗HIF-lα肺腺癌人源单链抗体(scFv),并进行初步鉴定.方法 先后以肺腺癌细胞A549、HIF-1α为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"从大容量噬菌体抗体库中筛选特异性抗体.感染大肠杆菌HB2151,实现可溶性抗体的表达,ELISA、免疫细胞化学检测抗原-抗体结合活性,SDS-PAGE和Western blot检测可溶性抗体表达和相对分子质量.结果 经筛选后,单链抗体得到富集.随机选取10个克隆,ELISA检测5个与HIF-lα抗原呈阳性反应,阳性率为50%.免疫细胞化学表明抗体与A549细胞特异性结合.SDS-PAGE、Western blot证明单链抗体成功可溶表达,且相对分子质量在30×10~3左右,ELISA显示其有较好的特异性.结论 利用单链大容量噬菌体抗体库技术成功获得特异性抗HIF-1α的肺腺癌人源单链抗体.     

抗HIF-1α肺腺癌人源单链抗体的筛选和初步鉴定

目的 从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗HIF-lα肺腺癌人源单链抗体(scFv),并进行初步鉴定.方法 先后以肺腺癌细胞A549、HIF-1α为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"从大容量噬菌体抗体库中筛选特异性抗体.感染大肠杆菌HB2151,实现可溶性抗体的表达,ELISA、免疫细胞化学检测抗原-抗体结合活性,SDS-PAGE和Western blot检测可溶性抗体表达和相对分子质量.结果 经筛选后,单链抗体得到富集.随机选取10个克隆,ELISA检测5个与HIF-lα抗原呈阳性反应,阳性率为50%.免疫细胞化学表明抗体与A549细胞特异性结合.SDS-PAGE、Western blot证明单链抗体成功可溶表达,且相对分子质量在30×10~3左右,ELISA显示其有较好的特异性.结论 利用单链大容量噬菌体抗体库技术成功获得特异性抗HIF-1α的肺腺癌人源单链抗体.     

部分纯化抗原半定量检测幽门螺杆菌感染

鉴定并提取幽门螺杆菌特异性抗原，建立测定抗ＨＰ抗体的半定量免疫酶技术。方法：１０株ＨＰ可溶性蛋白用于十二烷在磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹分析，凝胶层析提取特异性抗原，方阵滴定建立免疫酶方法。纯化抗原与全菌抗原同批检测１３６例患者，以蛋白印迹分析作为金标准。     

人巨细胞病毒重组PP150的原核表达及其酶联免疫吸附试验检测

目的 探讨人巨细胞病毒重组抗原PP150的原核表达及在酶联免疫吸附试验检测（ELISA）中的应用。方法 采用基因工程方法组建含有巨细胞病毒PP150蛋白强抗原决定簇基因的重组抗原克隆，进行诱导表达及纯化，在此基础上，以纯化的重组PP150蛋白作为包被抗原，对各种条件进行优化（如抗原的包被，作用时间及底物的选择），确定了判定标准，建立了检测HCMV IgM抗体的间接ELISA方法．用此方法检测了266份血清样品，并与DSL公司ELISA试剂盒检测结果相比较。结果 重组表达质粒pMAL-P2-PP150可在E.coliDH5a中有效表达，表达产物经SDS—PAGE电泳后，凝胶成像系统分析显示相对分子质量约为Mr64000，约占菌体蛋白的10％。Westem—blot检测，阳性识别率为80．0％（12／15）。用此蛋白包被ELISA板，检测正常孕妇血清，诊断符合率为98．1％，敏感性达88．2％，特异性100％。应用该方法对正常人血清样品检测HCMV-IgM，阳性率为4．1％。结论 该重组蛋白具有良好的抗原性，可望替代HCMV感染检测中的全病毒ELISA试剂盒。