不同月龄雌性SD大鼠成骨细胞内雌激素受体表达规律分析

目的:建立一种灵敏度高,特异性强的成骨细胞内雌激素受体检测方法,探讨不同月龄雌性SD大鼠成骨细胞内雌激素受体表达规律,以此拟描述不同年龄人类女性个体成骨细胞内雌激素受体表达的生理曲线.方法:以不同月龄雌性SD大鼠为标本,二次酶消化法收集成骨细胞并培养,倒置相差显微镜观察成骨细胞形态,钙钴法碱性磷酸酶染色、上清液碱性磷酸酶(ALP)及骨钙素(OCN)检测对成骨细胞进行鉴定,应用流式细胞仪对不同月龄雌性SD大鼠成骨细胞内雌激素受体进行检测, 根据每个成骨细胞被激发后标记-FITC的雌激素受体(ER)抗体荧光强度来表达细胞内ER的含量.结果:二次酶消化法获得的成骨细胞,形态呈多边形,碱性磷酸酶染色阳性细胞染色率80%,不同培养时间的成骨细胞和成纤维细胞上清液碱性磷酸酶和骨钙素含量相比较成骨组明显高于成纤维组,统计学检验有显著意义(p<0.01),流式细胞仪检测结果显示: 1、2月龄组ER荧光强度低表达,3月组ER荧光强度虽然呈低表达但已经显示出上升趋势,4月组以后ER荧光强度表达逐渐升高,至8、9、10月ER荧光强度表达至高峰,11月组之后各组ER表达荧光强度呈下降趋势.结论:二次酶消化法可获得较多的成骨细胞,符合成骨细胞的生物学特性,可作为成骨细胞相关研究的细胞来源.雌性SD大鼠成骨细胞内含有丰富的ER,其表达有赖于雌激素的存在.雌性SD大鼠成骨细胞内ER表达随月龄增加呈现出1、2、3月组ER低表达,4月组以后ER表达逐渐升高,至8、9、10月ER表达至高峰,11月组之后各组ER表达呈下降趋势的规律性变化.     

去卵巢大鼠成骨细胞雌激素受体表达的研究

目的 观察研究去卵巢SD大鼠成骨细胞内雌激素受体(ER)表达水平的变化规律.方法 SD雌性大鼠随机分为正常对照组和去卵巢(OVX)后第5周组、第7周组;采用二次酶消化、反复贴壁法分离纯化培养大鼠颅骨成骨细胞,进行钙钴法碱性磷酸酶(ALP)染色,I型胶原免疫组化染色来观察、鉴定大鼠成骨细胞.应用半定量Western blot对各组SD大鼠成骨细胞内雌激素受体进行检测.结果 通过ALP染色、I型胶原免疫组化及形态学观察符合成骨细胞特征.western blot显示雌激素受体表达OVX组明显低于正常组,第7周组低于第5周组.结论 随着去卵巢后时间延长,成骨细胞表达的雌激素受体下降,骨质疏松风险变大.     

雌性大鼠成骨细胞内雌激素受体表达的研究

目的：研究雌性大鼠一生中成骨细胞内雌激素受体(ER)表达水平的变化规律。方法：采用二次酶消化、反复贴壁法分离纯化培养大鼠成骨细胞并进行鉴定,应用半定量Western blot对不同月龄雌性Wistar大鼠成骨细胞内雌激素受体进行检测。结果：ER表达在1、2月龄组呈低度表达,3月组ER开始呈现上升趋势,至8、9、10月组ER达到高峰,10月组以后表达呈现下降趋势。结论：ER表达在不同月龄大鼠呈规律性分布,雌激素受体的表达应与雌激素水平是相一致的。     

骨质疏松大鼠成骨细胞雌激素受体与颅骨IL-10表达的相关性研究

目的探讨骨质疏松sD大鼠颅骨中IL-10的表达与成骨细胞内雌激素受体表达的相关性。方法40只SD雌性大鼠用随机数字表法随机分为对照纽20只和去势（去卵巢）组20只（去势第5周组、第7周组各10只）,用双能X线吸收法测定各组骨密度,用免疫组织化学ABC法及图像分析技术观察各组颅骨组织中IL-10表达;用二次酶消化、反复贴壁法分离纯化培养大鼠颅骨成骨细胞,并用钙一钴法碱性磷酸酶（ALP）染色法则型胶原免疫组化染色法观察、鉴定大鼠成骨细胞。应用半定量Western blot法检测各组SD大鼠成骨细胞内雌激素受体。结果去势组骨密度明显低于对照组（P〈0．01）;去势组骨小梁周边IL-10阳性成骨细胞数明显少于对照组（P〈O．01）,并且染色较对照组浅。ALP染色、Ⅰ型胶原免疫组化及形态学观察符合成骨细胞特征。去势组雌激素受体表达明显低于对照组,去势第7周低于去势第5周（P〈0．01）。结论雌激素受体的表达与成骨细胞IL-10表达水平成正相关。     

大鼠成骨细胞的体外培养和生物学特性的研究

目的：建立一种成骨细胞的体外培养方法,并研究不同培养时期成骨细胞的生物学特性。方法：用成年雌性大鼠松质骨为培养细胞来源,组织块培养法和胰酶消化法相结合进行成骨细胞培养,并测定成骨细胞不同培养阶段的碱性磷酸酶（ＡＫＰ）活性和骨钙素（ＯＣ）分泌水平。     

β2肾上腺素受体阻滞剂对雌激素刺激大鼠成骨细胞分化与增殖的影响

目的:研究β2肾上腺素受体阻滞剂对雌激素刺激大鼠成骨细胞分化与增殖的影响.方法:将不同浓度的β2肾上腺素受体阻滞剂(ICI118551)加入含雌激素(17β-E2)培养的第2代大鼠成骨细胞中,分别于培养3、6、9、12天时,使用PNPP法和放免方法检测成骨细胞培养基中的碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素含量,并用MTT法检测成骨细胞的增殖率.结果:ICI118551可提高雌激素刺激成骨细胞培养上清中碱性磷酸酶浓度促进细胞增殖,尤其当其浓度为10-5及10-6mol/L时,但对成骨细胞培养上清中骨钙素水平的影响不显著.结论:β2肾上腺素受体阻滞剂能够显著促进雌激素刺激大鼠成骨细胞的释放和增殖作用.     

SD大鼠髁突软骨下骨成骨细胞的原代培养与鉴定

目的：建立新生SD大鼠髁突软骨下骨成骨细胞培养模型。方法用新生24 h SD大鼠,分离获取髁突,去尽软骨层,获得纯尽软骨下骨。采用改良贴壁组织块反复消化法培养细胞。通过相差显微镜和HE染色观察其细胞形态,并且用碱性磷酸酶染色和钙化结节染色方法进行细胞鉴定,噻唑蓝（MTT）比色法检测其增值能力。结果细胞呈多种形态,有三角形、梭形、不规则形。碱性磷酸酶染色和钙化结节染色均呈阳性,细胞接种后1～3 d内细胞增殖缓慢,第8天达到高峰,以后增长速度逐渐减慢。结论该方法获得新生SD大鼠髁突软骨下骨成骨细胞能在体外稳定培养,并且细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。     

混合酶消化法大鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定

目的 通过不断的摸索,寻找一种获得细胞数量较多且纯的原代成骨细胞的体外培养方法,为下一步实验研究奠定基础.方法 取出生24 h内的SD大鼠脱臼处死,取出颅盖骨,剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织片;采用胰酶和Ⅰ型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞;采用"差速贴壁法"进行纯化.通过对细胞形态学的镜下观察,碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化法等对细胞进行鉴定.结果 镜下观察所获得的细胞具有成骨细胞的典型特征,细胞多为单核,呈三角形、多边形、长梭形等形态,并伸有粗大伪足;碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性.结论 采用混合酶消化法可获得数量较多且活性较好的细胞,再采用"差速贴壁法"可以去除成纤维细胞等杂质细胞,获得纯度较高的成骨细胞.     

改良组织块法大鼠成骨细胞培养的研究

目的 采用改良组织块法进行大鼠颅骨成骨细胞的体外培养。方法 将新生SD大鼠处死，无菌条件下取出颅骨，剔净后剪成碎块。0．25％胰蛋白酶消化20分钟，碎骨块接种于培养瓶中培养，从形态学、碱性磷酸酶染色等方面鉴定。结果 培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征，碱性磷酸酶呈阳性染色。结论 改良组织块法培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞形态特征，成分较单一。     

骨巨细胞瘤中成纤维样基质细胞体外钙化能力的研究

目的：探讨骨巨细胞瘤的组织来源。方法：体外培养。Ｇｏｍｏｒｉ法碱性磷酸酶染色,生化检测细胞培养上清液中的碱性磷酸酶含量。免疫组织化学染色检测骨钙素在成纤维样基质细胞中的表达。使用含Ｂ甘油磷酸钠和ＣａＣｌ２的培养液,观察成纤维样基质细胞体外钙化能力。结果：成纤维样基质细胞中碱性磷酸酶和骨钙素呈阳性表达,在体外具有钙化能力。在细胞培养上清液中有碱性磷酸酶。结论：骨巨细胞瘤中的成纤维样基质细胞具有某些成骨细胞的特点,为进一步探讨其组织来源提供了实验依据。     

连续植块培养原代成骨细胞及其特性的比较

目的: 探讨简便、经济、高效的原代成骨细胞培养方法,并比较其特性.方法: 收集1～4次连续植块培养获得的SD乳鼠颅盖骨原代成骨细胞,观察第1～4次连续植块培养获得的成骨细胞在细胞形态、分裂增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性及骨钙素和BMP-2免疫组织化学表达的变化.结果:连续植块培养收集的1～4次原代成骨细胞,在细胞贴壁、变形、铺展、汇合时间,Gomori改良钙-钴法ALP活性,骨钙素及BMP-2免疫组织化学染色表达上,均没有明显的区别.结论: 连续植块培养可获得与植块培养性状相同的SD乳鼠原代成骨细胞,且细胞数量多,节约经费、时间,操作简便.     

优化组织块法体外培养新生SD大鼠原代成骨细胞与鉴定

分别采用传统组织块法、传统酶消化法和优化组织块法进行新生SD大鼠原代成骨细胞体外分离和培养,并对培养出的细胞予以鉴定和比较。优化组织块法可短期内培养出大量纯度高的成骨细胞,具有典型的形态特征和成骨能力,碱性磷酸酶(ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫荧光均呈阳性,ALP检测活性可达92%。该法优于其他两种方法,提供了一种切实可行、操作简单的体外原代成骨细胞培养方法。     

碱性成纤维细胞生长因子影响兔成骨细胞增殖与分化的实验研究

目的：研究不同剂量碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF)对兔成骨细胞DNA合成、碱性磷酸酶活性的影响。以探讨b-FGF在骨折修复过程中的作用,方法：采用酶消化分段收集法分离培养兔成骨细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态,免疫组化法检测细胞ALP和I型胶原,酶动力学方法检测碱性磷酸酶活性,应用流式细胞仪进行细胞DNA含量分析。结果：b-FGF可明显促进兔成骨样细胞的DNA合成,但却抑制其碱性磷酸酶的活性。结论：b-FGF对骨折修复起重要作用。但仍需通过与其它生长因子的协同来完善。     

改良贴壁组织块法与改良Ⅰ型胶原酶消法对成骨细胞增殖效果的比较研究

目的 比较改良贴壁组织块法与改良Ⅰ型胶原酶消法对SD大鼠颞下颌关节髁突软骨下骨成骨细胞的增殖效果.方法 取10只出生1 -3dSD乳鼠颞下颌关节髁突软骨下骨,将骨片平分成2份,分别采用改良贴壁组织块法和改良Ⅰ型胶原酶消法培养颞下颌关节髁突成骨细胞,并标记为Ⅰ组和Ⅱ组,通过细胞形态学观察、HE染色、ALP染色鉴定成骨细胞.取第4代成骨细胞进行细胞计数、MTT生长曲线及流式细胞仪周期分析,比较2种原代培养方法对成骨细胞增殖能力的异同.结果 （1）Ⅰ组和Ⅱ组培养的细胞经鉴定均为成骨细胞; （2） Ⅱ组成骨细胞总量约为Ⅰ组细胞总量的1.5倍; （3） Ⅱ组成骨细胞MTT生长曲线较Ⅰ组细胞提前2d进入对数生长期及达到生长高峰; （4）2组细胞在达到第4代时,细胞周期含量差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 改良贴壁组织块法和改良Ⅰ型胶原酶消化法均适用于颞下颌关节软骨下骨成骨细胞的培养,但改良Ⅰ型胶原酶消化法可以更快速有效地获得大量成骨细胞.     

成骨细胞的体外培养及其生物学特性

目的 :建立体外分离、培养兔和人成骨细胞的生物学模型 ,并对其生物学特性进行观察。方法 :抽取新西兰兔骨髓 ,采用全骨髓法培养 ;人髂骨松质骨经胰酶消化获得成骨细胞 ,以 1× 10 6 / ml的细胞浓度进行培养 ,约10 d左右得到贴壁生长的单层细胞。随后传代培养 ,对所获得的细胞进行生物学特性观察。 结果 :获得的细胞呈多种形态 ,有长短不一、粗细不均、互相连接的胞浆突起 ,细胞可相互重叠呈复层生长 ,并形成钙结节。经连续传代 ,细胞形态与功能不变 ,具有典型成骨细胞的生物学特性。结论:无论采用兔骨髓基质细胞全骨髓法 ,还是人松质骨经胰酶消化法均能在体外培养出大量高纯度成骨细胞 ,方法简便、易行 ,为成骨细胞复合生物降解材料移植修复骨缺损奠定了基础 ,而且培养的成骨细胞可作为生物学模型 ,供干预研究使用。     

鲑鱼降钙素对体外培养鼠成骨细胞增殖及IGF-I表达的影响

目的观察鲑鱼降钙素（calcitonin,CT）对离体培养数成骨细胞（osteoblast,OB）的作用,初步探讨CT对OB增殖以及胰岛素样生长因子I（Insulin-like Growth Factor-I,IGF-I）表达的影响,为促进骨修复和再生的临床治疗提供一定的理论依据。方法取新生24hSD乳鼠颅盖骨,采用酶消化法培养OB,经酶解消化后得到原代OB,进行体外培养并鉴定。将体外培养的OB用不同浓度（1×10-12～1×10-8mol/L）的CT处理,采用MTT法（噻唑蓝染色法）观察OB的增殖;Gomori钙-钻法检测碱性磷酸酶（ALP）的表达;RT-PCR方法观察胰岛素样生长因子-I（IGF-I）mRNA的表达。结果经细胞鉴定后证实其系OB;MTT法检测表明,CT浓度为1×10-12mol/L时就可以刺激OB增殖,且随CT浓度升高其增殖能力增加,呈剂量依赖关系;Gomori钙-钻法检测结果表明随着CT浓度的升高OB分化能力增强;经RT-PCR法检测表明,IGF-I mRNA可在乳鼠OB内稳定表达,半定量分析表明,随着CT浓度的升高,IGF-ImRNA的表达量逐渐增加。结论适当浓度的CT可以促进体外培养OB的增殖;部分机制可能与CT促进IGF-ImRNA表达的增加有关。     

高血糖对成骨细胞增殖分化影响的实验研究

目的观察糖尿病大鼠股骨成骨细胞的病理改变以及高糖对成骨细胞增殖分化能力的影响,为临床治疗糖尿病骨质疏松症提供一定的实验基础。方法 2月龄雄性SD大鼠20只,随机分正常对照组和糖尿病骨质疏松组(n=10),糖尿病组大鼠经腹腔注射链脲佐菌素造模,同时体外分离培养成骨细胞,随机分为正常培养基组和高糖培养基组。成模6周麻醉后处死大鼠,分离各组大鼠的左侧股骨,于小动物放射成像系统上,测其近段骨密度,HE染色右侧股骨,观察比较两组大鼠股骨成骨细胞、破骨细胞的形态。同时两组成骨细胞各自培养48h后检测其形态及ALP阳性率。结果糖尿病组大鼠股骨骨密度显著低于对照组,同时骨皮质下成骨细胞显著减少,骨细胞呈扁平或星形,少见新骨形成。而高糖培养组成骨细胞其碱性磷酸酶(ALP)阳性率明显低于正常培养组,增殖分化能力减弱。结论高血糖状态下成骨细胞减少及增殖分化能力减弱,造成成骨细胞和破骨细胞的失衡,从而影响了骨组织的代谢,可能是造成糖尿病骨质疏松症的一个原因。     

雌激素水平对大豆苷原(DAI)促大鼠成骨细胞分化作用的影响

 目的  观察基础雌激素(estrogen)水平对大豆苷原(daizein,DAI)促成骨细胞分化作用的影响。方法  采用酶消化法分离培养新生SD大鼠头盖骨成骨细胞,通过培养液中添加17β-雌二醇改变培养微环境(包括空白对照)雌激素水平,应用MTT法和对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny-phosate,PNPP)法检测细胞增殖率和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,应用real-time PCR法检测其雌激素受体α(ERa)、雌激素受体β(ERβ)和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)γ的mRNA水平变化,研究雌激素基础水平变化对DAI促成骨细胞分化作用的影响。结果  培养环境中雌二醇水平升高致DAI的促分化作用减弱。其中100 nmol/L DAI组ALP比活性较对照组的增幅由雌激素补充前的23%分别降至8%(17β-雌二醇为100 pmol/L)和-11%(17β-雌二醇为1 000 pmol/L),显示基础雌激素水平对DAI促分化的拮抗作用。为避免培养液中血清雌激素的可能影响,进一步采用去激素血清培养(含2%去激素胎牛血清)。此时补充17β-雌二醇至100 pmol/L,DAI各剂量组细胞ALP比活性较对照组明显增加(16%~21%,P<0.05)。继续补充雌激素至1 000和10 000 pmol/L 时,其作用反而减弱。该结果显示,DAI促成骨细胞分化作用与雌激素基础水平有关,低雌激素状态(≤100 pmol/L)可增强其作用。为进一步探索其作用机制,我们初步观察了雌激素(100 pmol/L)和DAI(100 nmol/L)单独或联合作用下成骨细胞ERa、ERβ和PPARγ受体表达变化。结果显示,100 pmol/L 17β-雌二醇明显上调ERβ表达,并部分抵抗DAI下调ERβ的作用。结论  DAI的促成骨分化作用与基础雌激素水平有关,低雌激素(≤100 pmol/L)状态有利于DAI的促分化作用,而雌激素水平升高可减弱其促分化作用。