山东省赫坎按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的 进一步确认山东省赫坎按蚊复合体成员种。方法 采用鉴别PCR方法,对采自山东省8个地点经形态学初步鉴定的645只蚊虫进行检测,并对已检测的标本随机抽取数个样本,进行rDNA-ITS2序列测定。结果 645份样本中,中华按蚊占90.85％(586/645)、雷氏按蚊占5.27％(34/645),无扩增条带的标本占3.88％(25/645)。测定已鉴别的山东省中华按蚊、雷氏按蚊的ITS2序列长度分别为469bp和451hp,经Blast比对分析,显示与已公布的序列完全相同;3份无扩增条带标本的序列经核对为库蚊。结论 山东省分布的赫坎按蚊复合体成员种主要为中华按蚊、雷氏按蚊,其它成员种有待进一步证实。     

山东省赫坎按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的 进一步确认山东省赫坎按蚊复合体成员种。方法 采用鉴别PCR方法，对采自山东省8个地点经形态学初步鉴定的645只蚊虫进行检测，并对已检测的标本随机抽取数个样本，进行rDNA-ITS2序列测定。结果 645份样本中，中华按蚊占90．85％(586／645)、雷氏按蚊占5．27％(34／645)，无扩增条带的标本占3．88％(25／645)。测定已鉴别的山东省中华按蚊、雷氏按蚊的ITS2序列长度分别为469bp和451bp，经Blast比对分析，显示与已公布的序列完全相同；3份无扩增条带标本的序列经核对为库蚊。结论 山东省分布的赫坎按蚊复合体成员种主要为中华按蚊、雷氏按蚊，其它成员种有待进一步证实。     

PCR-RFLP技术用于鉴别赫坎按蚊复合体近缘种按蚊的研究

目的区别赫坎按蚊种团内近缘种.方法应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)技术,对辽宁省现场捕获的按蚊用特异性ITS2引物进行PCR扩增,限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分析.结果中华按蚊的PCR扩增产物能被限制性内切酶RsaⅠ酶切成350 bp和200 bp两条酶切DNA条带;嗜人按蚊核糖体DNA(rDNA)的PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfⅠ酶切成410 bp的酶切DNA条带; 雷氏按蚊的ITS2基因PCR扩增产物能分别被限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ酶切,分别显示350 bp和400 bp的酶切DNA条带;八代按蚊的PCR扩增产物没有显示明显的限制性内切酶RsaⅠ或HinfⅠ酶切条带.结论依据rDNA的ITS2区段基因特征建立的PCR-RFLP技术可用于鉴别赫坎按蚊种团的中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4个近缘种按蚊.     

我国多斑按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的建立我国多斑按蚊复合体5成员种的分子鉴别方法。方法测定并分析各成员种的rDNA-ITS2序列,并设计种特异引物,应用PCR法鉴别。结果多斑按蚊复合体5成员种的ITS2序列长度和GC含量分别为伪威氏按蚊328bp、58.54％、多斑按蚊330bp、57.85％、威氏按蚊337bp、59.05％、达罗毗按蚊334bp、58.68％和塞沃按蚊338bp、57.69％,各种内的ITS2序列保守,而种间的差异率范围为9.7％～18.9％。应用5.8S引物和5个种特异引物可以分别扩增出119、186、231、327和406bp等5条清晰不同的种特异条带,以鉴别各蚊种。结论基于ITS2序列差异建立的我国多斑按蚊复合体5成员种的PCR鉴别简便易行、可靠。     

我国赫坎按蚊种团的分子鉴别及中华按蚊的区系分布研究

目的改进赫坎按蚊种团部分成员种的多重PCR鉴别方法,鉴别赫坎按蚊种团中的中华按蚊,研究我国中华按蚊的区系分布及其影响因素。方法依据赫坎按蚊种团成员种中华按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊、比伦按蚊和克莱按蚊的核糖体DNA内转录间隔区2 (rDNA-ITS2)序列差异设计种特异引物,改进多重PCR分子鉴别方法。2013-2018年,在我国8个省(直辖市、自治区)共18个地点,以诱虫灯和人工吸取相结合的方法采集按蚊,依据形态特征初步鉴定为赫坎按蚊种团的成员种。提取单只蚊虫基因组DNA,使用改进的多重PCR方法鉴定种类。对多重PCR法无扩增产物的个体分析rDNA-ITS2序列,在GenBank上进行BLAST比对,确定其种类。查找我国以及韩国和俄罗斯远东地区用分子特征鉴别为中华按蚊的文献,结合本研究结果,汇总中华按蚊采集地的地理位置和气候数据,使用地理探测器模型计算影响决定力q值,分析经度、纬度、年平均气温和年平均降雨量对中华按蚊分布的影响。结果改进的多重PCR法一次扩增即可依据扩增片段大小鉴别赫坎按蚊种团的5个成员种:中华按蚊(490 bp)、雷氏按蚊(313 bp)、八代按蚊(216 bp)、克莱按蚊(386 bp)和比伦按蚊(165 bp)。在我国18个采集点共捕获赫坎按蚊种团按蚊365只,多重PCR鉴别为中华按蚊114只(来自陕西、安徽与山东的采集点)、八代按蚊34只、雷氏按蚊9只、克莱按蚊181只和比伦按蚊5只。22只多重PCR无扩增产物的蚊虫中,经rDNA-ITS2序列分析鉴定为贵阳按蚊2只、类中华按蚊1只、朝鲜按蚊8只、林氏按蚊7只和帕氏按蚊4只。获取用分子特征鉴别为中华按蚊的文献17篇,共汇总了101个采集地信息,其中有中华按蚊分布的采集点80个,无中华按蚊分布的21个地点。地理探测器软件计算获得的q值,从大到小依次为0.592 0(年平均气温)、0.507 2 (纬度)、0.351 2 (经度)和0.214 4 (年平均降雨量)。中华按蚊的分布与年平均气温关系最为密切,其次是纬度。综合分析分布地的纬度和年平均温度等结果显示,年平均气温10℃可以作为划分中华按蚊在我国分布北界线的依据。我国中华按蚊的分布范围包括云南、贵州、重庆、河南、山东、天津、江苏、安徽、湖北、浙江、上海、福建、江西、广西、广东、海南等省(直辖市、自治区)及台湾、香港、澳门特别行政区的全境,以及西藏、四川、甘肃、陕西、山西、河北、北京、辽宁等省(直辖市、自治区)的南部部分地区。结论改进的赫坎按蚊种团多重PCR分子鉴定方法快速简单、客观可靠。综合分析显示划分中华按蚊在我国分布北界线的依据是年平均气温10℃线,中华按蚊在我国的分布应小于之前记载的范围。     

微小按蚊复合体研究进展

摘要 近年来,有关微小按蚊复合体的研究相继开展,尽管现代分子生物学技术在按蚊复合体研究中日渐重要,但传统的生物学方法在微小按蚊复合体近缘种鉴别研究中仍占主导地位。本文从以上两方面对其研究进展进行综述。     

一种简便的赫坎按蚊复合体近缘种按蚊基因鉴别新技术

目的 建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内不同近缘种按蚊的基因鉴别技术。方法 依据赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊ITS2区段的基因序列特征设计特异性引物，建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊的简便的PCR基因鉴别技术，并采用传统的形态学分类方法和新建立的基因鉴别技术对从辽宁、河南省以及在朝鲜现场捕获的按蚊分别进行了形态学和基因鉴别及比较。结果与结论 新建立的基因鉴别技术能准确鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊。具有比传统的形态学分类方法准确，比已有的PCR-RFLP蚊种基因鉴别技术更简便、价廉和省时的特点。适用于不同的复合媒介地区的疟疾媒介调查和监测。     

我国雷氏按蚊和嗜人按蚊的分子鉴别和分类地位的探讨

[目的 ]论证我国雷氏按蚊与嗜人按蚊的分类地位。 [方法 ]采用分子鉴别法 (鉴别PCR和rDNA ITS2序列 )检测辽宁及山东两省现场按蚊标本 ,并依据ITS2区序列建立分子系统树。 [结果 ]分子鉴别显示 ,辽宁和山东两省均存在雷氏按蚊和嗜人按蚊。我国雷氏按蚊 (辽宁和山东省 ,n =6 )和嗜人按蚊 (辽宁、云南、河南和四川省 ,n =10 )ITS2序列长度和GC含量分别为 45 1bp、 46 2 % ,44 8bp、 46 0 % ;各地雷氏按蚊和嗜人按蚊序列均无差异 ,但各地嗜人按蚊与对照组江苏的嗜人按蚊相比 ,种内序列差异为 0 88% ;雷氏按蚊与嗜人按蚊种间序列差异为 2 5 7%。分子系统树显示雷氏按蚊与中华按蚊、嗜人按蚊与凉山按蚊亲缘关系较近。 [结论 ]根据分子鉴别 ,确认我国雷氏按蚊与嗜人按蚊为同域分布的 2个独立种     

内蒙古赫坎按蚊种团一新种(双翅目:蚊科)

本文记述一种采自我国内蒙古自治区海拉尔市郊，隶属于赫坎按坟种团的新种海拉尔按蚊［Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）ｈａｉｌａｒｅｎｓｉｓｓｐ．ｎｏｖ．］的成虫、蛹、幼虫和卵的形态特征。成虫与其近缘种中华按蚊（ＡｎｏｐｈｅｌｅｓｓｉｎｅｎｓｉｓＷｉｅｄｅｍａｎｎ，１８２８）和黑河按蚊（ＡｎｏｐｈｅｌｅｓｈｅｉｈｅｎｓｉｓＭａ，１９８１）的形态进行比较，并与中华按蚊卵的形态作比较。     

冈比亚按蚊分类研究进展

冈比亚按蚊是非洲重要的传疟媒介,也是寄生虫学研究的模式生物之一。该文介绍了应用染色体和分子特征在冈比亚按蚊分类研究中的进展,对蚊种形成和进化的特点及复杂性进行剖析,并对后基因组时代的相关研究进行了展望。     

用PCR-RFLP技术鉴别嗜人按蚊和中华按蚊的研究

目的　依据嗜人按蚊和中华按蚊rDNA的ITS2区段基因特征 ,建立一种新的嗜人按蚊和中华按蚊基因鉴别技术。方法　对不同地区的嗜人按蚊、可疑嗜人按蚊和中华按蚊样本通过采用特异性ITS2 引物PCR扩增 ,限制性内切酶RsaI和HinfI消化 ,以及琼脂糖凝胶电泳分析进行PCR -RFLP基因鉴别。 结果　不同地区嗜人按蚊rDNA的ITS2 基因PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfI酶切 ,并显示一条 4 5 0bp的酶切DNA条带 ;中华按蚊的ITS2 基因PCR扩增产物则能被限制性内切酶RsaI酶切 ,并显示 4 0 0bp和 2 0 0bp两条酶切DNA条带 ;辽宁可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与嗜人按蚊相同而广东珠海可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与中华按蚊相同。结论　依据rDNA的ITS2 区段基因特征建立的PCR -RFLP技术可用于嗜人按蚊和中华按蚊的基因鉴别。采用该PCR -RFLP基因鉴别技术发现辽宁可疑嗜人按蚊的基因与中国大陆的嗜人按蚊属同种 ,而广东可疑嗜人按蚊的基因与中华按蚊属同种。     

Development of a multiplex real-time PCR assay for identification of members of the Anopheles gambiae species complex

Two high-throughput assays for the identification of members of the Anopheles gambiae sensu lato species complex have recently been reported. These methods, are based on TaqMan single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping that enables rapid scoring of mosquito DNA samples in real-time PCR reactions. Unfortunately, both assays are restricted in the number of species that they can identify and a combination of the two assays may be required to identify all possible species in certain regions. To overcome this limitation, and thereby further increase throughput while reducing costs, we have developed a new multiplex real-time PCR assay for identifying members of the An. gambiae complex. The new method uses three probes labelled with fluorophores with distinct emission and excitation spectra, allowing simultaneous detection of the two main malaria vectors from the non-vector sibling species, and can be used on single mosquito legs from silica-dried specimens. A genotyping trial of over 450 specimens collected from 13 countries in sub-Saharan Africa showed the multiplex assay to be highly specific and sensitive and it compared well against the two previously reported TaqMan assays and standard allele-specific PCR.     

西藏墨脱县多斑按蚊复合体尚未发生击倒抗性突变

目的探明西藏林芝地区疟疾流行区墨脱县多斑按蚊复合体是否发生击倒抗性突变,并获得我国多斑按蚊复合体5成员种钠离通道蛋白基因（VGSC）IIS4-S6区段基因序列信息。方法采用简并引物扩增我国多斑按蚊复合体5成员种的VGSC基因IIS4-S6区段,扩增产物双向测序拼接;PCR扩增墨脱县背崩乡、德兴乡、墨脱镇和达木乡捕获的共161只多斑按蚊复合体VGSC基因,对PCR产物双向测序,观察L1014位点是否发生突变。结果获得我国多斑按蚊复合体5成员种VGSC基因IIS4-S6区段基因序列,5成员种L1014位点均为TTA,对墨脱县的背崩乡、墨脱镇和达木乡捕获的伪威氏按蚊和威氏按蚊进行VGSC扩增并测序,均未发生击倒抗性突变。结论西藏林芝地区墨脱县多斑按蚊复合体尚未发生击倒抗性突变。     

西藏墨脱县疟疾流行区多斑按蚊复合体种型鉴定

目的 鉴定西藏林芝地区墨脱县疟疾流行区多斑按蚊复合体的种型。 方法 墨脱县捕获的5 190只按蚊经形态学鉴定为多斑按蚊复合体后,随机取575只,酚-氯仿法提取单蚊DNA作为模板,根据伪威氏按蚊、多斑按蚊、威氏按蚊、达罗毗按蚊和塞沃按蚊分别设计5对特异性引物,PCR扩增rDNA第二转录间隔区（ITS2）片段,进行种型鉴别。对目标片段进行测序、同源性比对,并运用MEGA（3.1）软件构建多斑按蚊复合体的系统进化树。 结果 575份DNA样本中有11份扩增出约231 bp的条带,即威氏按蚊（1.9%）;564份扩增出约119 bp的条带,为伪威氏按蚊（98.1%）。 PCR种型鉴定结果与同源性比对及系统进化树的结果一致。 结论 西藏林芝地区墨脱县疟疾流行区多斑按蚊复合体由伪威氏按蚊和威氏按蚊构成,伪威氏按蚊为优势蚊种。     

进化速率不同的分子标记对微小按蚊新亲缘种的研究

目的选择进化速率不同的核糖体rDNA-ITS2、rDNA-28S-D3基因和线粒体DNA（mtDNA）COⅡ基因作为分子标记，研究我国微小按蚊变异及新的亲缘种。方法用蛋白酶K消化单蚊蚊腿，提取基因组DNA，PCR特异扩增rDNA-ITS2、rDNA-28S-D3和mtDNA-COⅡ基因片段，对PCR产物进行纯化、测序和序列分析，并基于mtDNA-COⅡ基因采用最大似然法构建种系发生树。分析微小按蚊变异地位和进化关系。结果1）云南元江微小按蚊rDNA-ITS2扩增片段约700bp，其他微小按蚊为480bp左右；2）ITS2和D3序列分析显示3种单倍型，其中元江微小按蚊基因长度与碱基组成显著不同；3）mtDNA-COⅡ种系发生树显示元江微小按蚊与其他微小按蚊的亲缘关系较远。结论我国存在微小按蚊A和C之外的新的微小按蚊亲缘种。     

hsp65 and rpoB PCR-RFLP用于龟/脓肿分枝杆菌复合群种的快速鉴定(英文)

目的探讨和评价hsp65and rpoB PCR-RFLP用于龟/脓肿分枝杆菌复合群种的快速鉴定。方法收集经PNB/TCH鉴别培养基表型鉴定和16s rRNA基因测序鉴定为龟/脓肿分枝杆菌复合群的临床分离菌株,用hsp65and rpoBPCR-RFLP进行种/亚种鉴定。结果经表型鉴定为非结核分枝杆菌的27株临床菌株,16s rRNA基因测序分析与龟/脓肿分枝杆菌的同源性达到99.7%。经hsp65PCR-RFLP and rpoBPCR-RFLP鉴定18株为脓肿分枝杆菌(M.abscessus),4株为溃疡分枝杆菌(M.absecces),另5株表现为独特的指纹特征,可能是一个新的亚种。结论能够快速进行龟/脓肿分枝杆菌复合群种/亚种的鉴定。     

Identification of two species within the Anopheles minimus complex in northern Vietnam and their behavioural divergences

Elucidating the complex taxonomic status of the major malaria vector taxa and characterising the individual species within each complex is important for understanding the complexity of the vector system in the south-east Asian region and will allow to estimate the impact of vector control measures. This applies to countries such as Laos, Cambodia and Vietnam that spend about 60% of their malaria control budget on implementing vector control activities. We used isozyme electrophoresis to clarify the Anopheles minimus s.l. species composition in northern Vietnam and identify behavioural divergences of individual species. Using different collection methods, adult mosquitoes were caught at monthly intervals from June to November 1995 in four villages. An. minimus s.l. could be distinguished from closely related species, An. aconitus and An. jeyporiensis, at the Octanol dehydrogenase (Odh) enzyme locus. Significant positive Fis values gave clear evidence of nonrandom mating within the An. minimus s.l. population. The highest heterozygote deficiency was observed at locus Odh, which was diagnostic for 2 sympatric An. minimus species in Vietnam similar to the An. minimus A and C species known from Thailand. We found no evidence for restricted gene flow between monthly samples, villages, or collection methods in either of the two An. minimus species. They occurred in sympatry, but in different proportions depending on the collection site, and had dissimilar resting and biting behaviours. Thus a vector control strategy will have a nonuniform effect on the various components of this diverse vector system.