赫坎按蚊种群近缘种核糖体基因内转录第二间隔区序列分析

目的　分析赫坎按蚊种群内4个近缘种核糖体基因内转录第二间隔区(rDNAITS2)特征。　方法　采用特异性ITS2引物对中华按蚊和嗜人按蚊江苏实验株、辽宁省沈阳市和朝鲜开城现场捕获的嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2进行PCR扩增、基因测序和限制性内切酶酶切位点图谱分析。　结果与结论　赫坎按蚊种群近缘种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2分别为472、452、456和456bp,各基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶酶切位点     

PCR-RFLP技术用于鉴别赫坎按蚊复合体近缘种按蚊的研究

目的区别赫坎按蚊种团内近缘种.方法应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)技术,对辽宁省现场捕获的按蚊用特异性ITS2引物进行PCR扩增,限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分析.结果中华按蚊的PCR扩增产物能被限制性内切酶RsaⅠ酶切成350 bp和200 bp两条酶切DNA条带;嗜人按蚊核糖体DNA(rDNA)的PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfⅠ酶切成410 bp的酶切DNA条带; 雷氏按蚊的ITS2基因PCR扩增产物能分别被限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ酶切,分别显示350 bp和400 bp的酶切DNA条带;八代按蚊的PCR扩增产物没有显示明显的限制性内切酶RsaⅠ或HinfⅠ酶切条带.结论依据rDNA的ITS2区段基因特征建立的PCR-RFLP技术可用于鉴别赫坎按蚊种团的中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4个近缘种按蚊.     

用PCR-RFLP技术鉴别嗜人按蚊和中华按蚊的研究

目的　依据嗜人按蚊和中华按蚊rDNA的ITS2区段基因特征 ,建立一种新的嗜人按蚊和中华按蚊基因鉴别技术。方法　对不同地区的嗜人按蚊、可疑嗜人按蚊和中华按蚊样本通过采用特异性ITS2 引物PCR扩增 ,限制性内切酶RsaI和HinfI消化 ,以及琼脂糖凝胶电泳分析进行PCR -RFLP基因鉴别。 结果　不同地区嗜人按蚊rDNA的ITS2 基因PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfI酶切 ,并显示一条 4 5 0bp的酶切DNA条带 ;中华按蚊的ITS2 基因PCR扩增产物则能被限制性内切酶RsaI酶切 ,并显示 4 0 0bp和 2 0 0bp两条酶切DNA条带 ;辽宁可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与嗜人按蚊相同而广东珠海可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与中华按蚊相同。结论　依据rDNA的ITS2 区段基因特征建立的PCR -RFLP技术可用于嗜人按蚊和中华按蚊的基因鉴别。采用该PCR -RFLP基因鉴别技术发现辽宁可疑嗜人按蚊的基因与中国大陆的嗜人按蚊属同种 ,而广东可疑嗜人按蚊的基因与中华按蚊属同种。     

一种简便的赫坎按蚊复合体近缘种按蚊基因鉴别新技术

目的 建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内不同近缘种按蚊的基因鉴别技术。方法 依据赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊ITS2区段的基因序列特征设计特异性引物，建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊的简便的PCR基因鉴别技术，并采用传统的形态学分类方法和新建立的基因鉴别技术对从辽宁、河南省以及在朝鲜现场捕获的按蚊分别进行了形态学和基因鉴别及比较。结果与结论 新建立的基因鉴别技术能准确鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊。具有比传统的形态学分类方法准确，比已有的PCR-RFLP蚊种基因鉴别技术更简便、价廉和省时的特点。适用于不同的复合媒介地区的疟疾媒介调查和监测。     

嗜人按蚊和中华按蚊的ITS2区段序列分析和比较

目的 分析和比较不同地区中华按蚊和嗜人按蚊的ITS2区段的基因特征。方法 采用特异性ITS2引物对嗜人按蚊和中华按蚊江苏实验株以及从湖北省和越南现场捕获的嗜人按蚊和中华按蚊进行PCR扩增、克隆并对ITS2区段序列进行分析。结果 嗜人按蚊实验株的ITS2区段序列有452bp，与嗜人按蚊现场株的ITS2区段序列相同，中华按蚊实验株的ITS2区段序列有472bp，与中华按蚊现场株的ITS2区段序列也相同；但嗜人按蚊和中华按蚊的ITS2区段基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶位点。结论 可依据中华按蚊和嗜人按蚊的ITS2基因序列内限制性内切酶切位点不同的基因特征，采用PCR-RFLP技术建立中华按蚊和嗜人按蚊基因鉴别技术。     

山东省赫坎按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的 进一步确认山东省赫坎按蚊复合体成员种。方法 采用鉴别PCR方法,对采自山东省8个地点经形态学初步鉴定的645只蚊虫进行检测,并对已检测的标本随机抽取数个样本,进行rDNA-ITS2序列测定。结果 645份样本中,中华按蚊占90.85％(586/645)、雷氏按蚊占5.27％(34/645),无扩增条带的标本占3.88％(25/645)。测定已鉴别的山东省中华按蚊、雷氏按蚊的ITS2序列长度分别为469bp和451hp,经Blast比对分析,显示与已公布的序列完全相同;3份无扩增条带标本的序列经核对为库蚊。结论 山东省分布的赫坎按蚊复合体成员种主要为中华按蚊、雷氏按蚊,其它成员种有待进一步证实。     

rDNA ITS2区段基因序列分析技术用于江苏省疟疾疫情不稳定地区传疟媒介的鉴定

目的了解江苏省近年来疟疾疫情回升地区媒介按蚊种类。方法采用rDNA ITS2区段基因序列分析技术，对半通宵室外人饵诱捕法和清晨蚊帐内捕蚊法捕获的现场按蚊进行蚊种鉴定。结果经形态学鉴定和PCR基因扩增，并与实验室模式种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊DNA基因比较，现场捕获的按蚊均为中华按蚊。结论中华按蚊仍是目前江苏省疟疾疫情回升地区的主要传疟媒介。     

山东省赫坎按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的 进一步确认山东省赫坎按蚊复合体成员种。方法 采用鉴别PCR方法，对采自山东省8个地点经形态学初步鉴定的645只蚊虫进行检测，并对已检测的标本随机抽取数个样本，进行rDNA-ITS2序列测定。结果 645份样本中，中华按蚊占90．85％(586／645)、雷氏按蚊占5．27％(34／645)，无扩增条带的标本占3．88％(25／645)。测定已鉴别的山东省中华按蚊、雷氏按蚊的ITS2序列长度分别为469bp和451bp，经Blast比对分析，显示与已公布的序列完全相同；3份无扩增条带标本的序列经核对为库蚊。结论 山东省分布的赫坎按蚊复合体成员种主要为中华按蚊、雷氏按蚊，其它成员种有待进一步证实。     

应用rDNA ITS2区段基因序列分析对浙江省传疟媒介的鉴定

目的 对浙江省传疟媒介种类进行鉴定，以指导疟疾防治工作。方法 针对媒介按蚊核糖体核酸内转录间隔2（rDNAITS2）区段基因特征，应用PCR基因鉴别技术，对浙江省现场捕捉的按蚊与嗜人按蚊、八代按蚊、中华按蚊、雷氏按蚊实验室标本进行基因鉴别和比较。结果 浙江省现场捕捉的按蚊DNA样本的PCR扩增产物均为250bp，与实验室中华按蚊标本一致。结论 中华按蚊目前仍是浙江省的主要传疟媒介，现场调查未发现嗜人按蚊。     

我国赫坎按蚊种团的分子鉴别及中华按蚊的区系分布研究

目的改进赫坎按蚊种团部分成员种的多重PCR鉴别方法,鉴别赫坎按蚊种团中的中华按蚊,研究我国中华按蚊的区系分布及其影响因素。方法依据赫坎按蚊种团成员种中华按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊、比伦按蚊和克莱按蚊的核糖体DNA内转录间隔区2 (rDNA-ITS2)序列差异设计种特异引物,改进多重PCR分子鉴别方法。2013-2018年,在我国8个省(直辖市、自治区)共18个地点,以诱虫灯和人工吸取相结合的方法采集按蚊,依据形态特征初步鉴定为赫坎按蚊种团的成员种。提取单只蚊虫基因组DNA,使用改进的多重PCR方法鉴定种类。对多重PCR法无扩增产物的个体分析rDNA-ITS2序列,在GenBank上进行BLAST比对,确定其种类。查找我国以及韩国和俄罗斯远东地区用分子特征鉴别为中华按蚊的文献,结合本研究结果,汇总中华按蚊采集地的地理位置和气候数据,使用地理探测器模型计算影响决定力q值,分析经度、纬度、年平均气温和年平均降雨量对中华按蚊分布的影响。结果改进的多重PCR法一次扩增即可依据扩增片段大小鉴别赫坎按蚊种团的5个成员种:中华按蚊(490 bp)、雷氏按蚊(313 bp)、八代按蚊(216 bp)、克莱按蚊(386 bp)和比伦按蚊(165 bp)。在我国18个采集点共捕获赫坎按蚊种团按蚊365只,多重PCR鉴别为中华按蚊114只(来自陕西、安徽与山东的采集点)、八代按蚊34只、雷氏按蚊9只、克莱按蚊181只和比伦按蚊5只。22只多重PCR无扩增产物的蚊虫中,经rDNA-ITS2序列分析鉴定为贵阳按蚊2只、类中华按蚊1只、朝鲜按蚊8只、林氏按蚊7只和帕氏按蚊4只。获取用分子特征鉴别为中华按蚊的文献17篇,共汇总了101个采集地信息,其中有中华按蚊分布的采集点80个,无中华按蚊分布的21个地点。地理探测器软件计算获得的q值,从大到小依次为0.592 0(年平均气温)、0.507 2 (纬度)、0.351 2 (经度)和0.214 4 (年平均降雨量)。中华按蚊的分布与年平均气温关系最为密切,其次是纬度。综合分析分布地的纬度和年平均温度等结果显示,年平均气温10℃可以作为划分中华按蚊在我国分布北界线的依据。我国中华按蚊的分布范围包括云南、贵州、重庆、河南、山东、天津、江苏、安徽、湖北、浙江、上海、福建、江西、广西、广东、海南等省(直辖市、自治区)及台湾、香港、澳门特别行政区的全境,以及西藏、四川、甘肃、陕西、山西、河北、北京、辽宁等省(直辖市、自治区)的南部部分地区。结论改进的赫坎按蚊种团多重PCR分子鉴定方法快速简单、客观可靠。综合分析显示划分中华按蚊在我国分布北界线的依据是年平均气温10℃线,中华按蚊在我国的分布应小于之前记载的范围。     

我国雷氏按蚊和嗜人按蚊的分子鉴别和分类地位的探讨

[目的 ]论证我国雷氏按蚊与嗜人按蚊的分类地位。 [方法 ]采用分子鉴别法 (鉴别PCR和rDNA ITS2序列 )检测辽宁及山东两省现场按蚊标本 ,并依据ITS2区序列建立分子系统树。 [结果 ]分子鉴别显示 ,辽宁和山东两省均存在雷氏按蚊和嗜人按蚊。我国雷氏按蚊 (辽宁和山东省 ,n =6 )和嗜人按蚊 (辽宁、云南、河南和四川省 ,n =10 )ITS2序列长度和GC含量分别为 45 1bp、 46 2 % ,44 8bp、 46 0 % ;各地雷氏按蚊和嗜人按蚊序列均无差异 ,但各地嗜人按蚊与对照组江苏的嗜人按蚊相比 ,种内序列差异为 0 88% ;雷氏按蚊与嗜人按蚊种间序列差异为 2 5 7%。分子系统树显示雷氏按蚊与中华按蚊、嗜人按蚊与凉山按蚊亲缘关系较近。 [结论 ]根据分子鉴别 ,确认我国雷氏按蚊与嗜人按蚊为同域分布的 2个独立种     

中华按蚊和嗜人按蚊不同地理株基因组DNA的限制酶...

Total DNA was extracted from three geographical strains of Anopheles sinensis and two geographical strains of Anopheles anthropophagus and digested respectively with three restriction endonucleases (Bgl II, Hae III and Pst I). The restriction fragment length differences (RFLDs) of repetitive DNA detected after agarose gel electrophoretic separation and ethidium bromide staining were compared among the above-mentioned geographical strains of both An. sinensis and An. anthropohagus. The results indicated that the band patterns are species- specific and strain-specific, their main bands being similar while their minor bands being distinctly different. Pst I digestion produced unique fragments for three geographical strains of An. sinensis while Bgl II digestion produced unique fragments for two geographical strains of An. anthropophagus. In view of the variation in repetitive DNA of different geographical strains of both An. sinensis and An. anthropophagus presented, the RFLDs could be used as a means to distinguish various closely related geographical strains of anopheline mosquitoes.     

赫坎按蚊种团内各亲缘种间基历组重复DNA...

Genomic DNA were prepared from 5 sibling species of Anopheles hyrcanus group including An. sinensis (ASS), An. anthropophagus (ALA), An. liangshanensis (ALS), An. crawfordi (ACW) and An. xiaokuanus (AXK). High molecular weight DNA from each species were cut with three restriction endonucleases (Bgl II, Hae III and Pst I) and the DNA fragments analysed by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. Three enzymes (Bgl II, Hae III and Pst I) produced unique fragments in all sibling species tested. A diagnostic restriction fragment length of DNA from 5 sibling species of An. hyrcanus group may be derived from a single restriction enzyme pattern (i.e. Bgl II). The results demonstrated that the restriction fragment length differences of repetitive DNA could used as a tool to distinguish sibling species of An. hyrcanus group.     

辽宁省东港市按蚊多样性和蚊虫种群动态变化研究

目的掌握辽宁省东港市按蚊多样性的本底资料以及蚊虫种群密度动态变化和季节消长的情况。方法对1997年至2005年在东港7个地点采集的按蚊进行形态和PCR分子鉴别,分析1998年至2005年间该地的蚊虫密度和季节消长情况。结果东港市的按蚊有4种,为雷氏按蚊、八代按蚊、Anophelesbelenrae和朝鲜按蚊;其中雷氏按蚊占经分子鉴别的173个样本中的93.6%;An.be-lenrae在中国是首次记录,朝鲜按蚊是辽宁省的新记录种。东港市蚊虫种群密度最高的年份为2001年,最低为1998年;绝大多数年份蚊虫的季节消长基本属单峰型,调查期间每年的7月和8月其密度维持在较高水平。结论辽宁省东港市的蚊虫资料得到了更新和充实。     

海南省按蚊物种多样性调查

目的了解海南省按蚊多样性。方法采用牛帐法于2011、2012年的4~6月在海南省11个市县的山区、丘陵及平原三类地形中选取33个村庄进行调查,计算不同市县及不同地形的按蚊多样性指数、均匀度指数、丰富度指数,并用SPSS统计软件进行分析。结果共捕获按蚊17种7 377只,以嵌斑按蚊所占比例最高,为44.76%(3302/7377),其次为中华按蚊,占24.51%(1808/7377)。不同市县、不同地形之间按蚊多样性指数、丰富度指数差异均有统计学意义(P<0.05),但均匀度指数差异无统计学意义(P>0.05)。在陵水、琼海、儋州、五指山、屯昌等市县均捕获微小按蚊,在海口演丰镇捕获嗜人按蚊。结论嵌斑按蚊及中华按蚊是海南省主要按蚊种类。微小按蚊的种群密度可能处于较低水平,分布点也可能在减少,而嗜人按蚊的分布点可能在扩大。按蚊多样性与自然环境条件和人类因素有关。