EGFR抑制剂AG1478对子宫内膜癌细胞上皮-间质转化的影响

目的:研究表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂AG1478对子宫内膜癌细胞增殖和上皮-间质转化的影响。方法:蛋白印迹法检测子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白E-cadherin、α-catenin,间质标记蛋白N-cadherin、vimentin及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平。MTT法检测不同浓度AG1478对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用。蛋白印迹法检测AG1478对子宫内膜癌细胞E-cadherin、α-catenin,N-cadherin、vimentin及MMP-9、MMP-2蛋白表达水平的影响。体外迁移实验检测AG1478对子宫内膜癌细胞迁移能力的影响。结果:(1)EGFR过表达可下调子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白并上调间质标记蛋白及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平(P<0.05)。(2)AG1478对两种子宫内膜癌细胞均有增殖抑制作用,以经转染稳定过表达EGFR的Ishikawa细胞更为敏感(P<0.05)。(3)AG1478上调子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白并下调间质标记蛋白及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平,以转染EGFR的Ishikawa细胞变化更为显著(P<0.05)。(4)AG1478可减弱子宫内膜癌细胞的迁移能力,以过表达EGFR的Ishikawa细胞更为明显(P<0.05)。结论:EGFR抑制剂AG1478可有效地抑制子宫内膜癌细胞增殖和上皮-间质转化。     

RNA干扰抑制EZH2基因表达对子宫内膜癌细胞上皮-间质转化的影响

目的:利用RNA干扰技术靶向沉默EZH2基因,检测其对子宫内膜癌细胞增殖、迁移能力及上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:实时荧光定量PCR、Western blot检测EZH2在子宫内膜细胞ESC及子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中的表达差异。利用化学技术合成小分子siRNA转染子宫内膜癌细胞,靶向抑制EZH2基因表达。CCK-8、Transwell小室检测干扰前后子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2增殖、迁移能力变化。Western blot检测干扰前后子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中EMT相关蛋白E-cadherin、α-catenin、N-cadherin和Vimentin的表达变化。结果:(1)EZH2在子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中的表达明显高于子宫内膜细胞ESC(P0.01)。(2)RNA干扰抑制EZH2基因表达后,ECC-1、RL95-2细胞增殖、迁移能力降低(P0.01)。(3)RNA干扰抑制EZH2基因表达后,ECC-1、RL95-2细胞中上皮标志物E-cadherin和α-catenin的蛋白表达水平上调(P0.05),间质标志物N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平下调(P0.01)。结论:EZH2在子宫内膜癌细胞中高表达,siRNA靶向沉默EZH2基因可抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和上皮-间质转化。     

RANKL对人子宫内膜癌细胞上皮间质转化的影响

目的:探讨RANKL对人子宫内膜癌细胞转移和上皮间质转化的影响。方法:体外构建针对细胞核因子κB受体活化因子(RANK)的过表达质粒载体(p IRES2-3FLAG-EGFP-RANK),脂质体法转染人子宫内膜癌HEC-1A细胞株,形成HEC-1ARANK细胞(过表达质粒组),并与HEC-1A~Control细胞(空白质粒组)相对照。给予1μg/ml可溶性细胞因子sRANKL处理后,细胞划痕试验检测细胞迁移能力,CCK-8试验检测细胞的增殖能力,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别检测EMT相关指标E-cadherin、N-cadherin及Vimentin mRNA及蛋白的表达变化。结果:经1μg/ml sRANKL刺激后,HEC-1ARANK细胞迁移能力增强(P0.01),增殖效应没有明显改变(P0.05),上皮性标记物E-cadherin mRNA及蛋白的表达水平下降,间质性标记物N-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白的表达水平显著上调(P0.01)。结论:RANKL可通过诱导HEC-1A细胞发生上皮间质转化促进子宫内膜癌的转移。     

UBE3C在雌激素促进子宫内膜癌细胞迁移及侵袭中的作用机制研究

目的:探讨泛素连接酶E3C(UBE3C)在雌激素(E_2)诱导子宫内膜癌细胞发生迁移、侵袭及上皮间质转化(EMT)过程中的作用。方法:免疫组化法检测子宫内膜癌组织中UBE3C表达情况。qRT-PCR及Western blot法检测UBE3C在子宫内膜癌细胞株、子宫内膜间质细胞株及正常子宫内膜上皮细胞中的表达。雌激素以浓度及时间梯度处理Ishikawa细胞,qRT-PCR及Western blot法检测UBE3C mRNA和蛋白表达。雌激素处理siNC或siUBE3C转染的Ishikawa细胞,划痕试验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力,Western blot法检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、snail及slug表达。结果:UBE3C在子宫内膜癌组织及细胞中高表达。雌激素能上调Ishikawa细胞UBE3C mRNA及蛋白表达,且在一定范围内呈剂量时间依赖性。雌激素刺激增强Ishikawa细胞的迁移、侵袭能力,促进EMT;si-UBE3C干扰能显著抑制上述作用,且能减弱雌激素对Ishikawa细胞迁移、侵袭能力的增强及EMT的促进。结论:UBE3C与雌激素能增强子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭能力,促进上皮间质转化,UBE3C可能是雌激素下游重要的靶基因之一,介导雌激素诱导子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化。     

EGFR过表达降低人子宫内膜癌细胞孕激素敏感性的研究

目的:检测表皮生长因子受体(EGFR)基因在子宫内膜癌孕激素敏感细胞株Ishikawa及孕激素不敏感细胞株KLE的表达,探讨EGFR基因过表达对人子宫内膜癌细胞孕激素敏感性的影响。方法:实时定量PCR法和蛋白印迹法检测Ishikawa和KLE细胞中EGFR及PR-BmRNA和蛋白的表达。将EGFR全长cDNA真核表达质粒在脂质体介导下转染至Ishikawa细胞,同时以转染空载体和未转染的Ishikawa细胞为对照,分别应用实时定量PCR检测各组细胞EGFR、PR-BmRNA表达的变化,应用蛋白印迹法检测各组细胞EGFR、PR-B蛋白表达的变化;CCK-8法观察转染EGFR基因后Ishikawa细胞对孕激素敏感性的变化。结果:(1)Ishikawa细胞中,EGFRmRNA和蛋白的表达明显低于KLE细胞(P<0.001),而PR-BmRNA和蛋白的表达则显著高于KLE细胞(P<0.001);(2)稳定转染EGFR基因后,Ishikawa细胞中EGFRmRNA和蛋白的表达水平明显高于转染空载体和未转染的Ishikawa细胞(P<0.001),而PR-BmRNA和蛋白的表达水平则显著降低;(3)10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的MPA对未转染和转染空载体的Ishikawa细胞的抑制作用显著(P<0.05),但对稳定过表达EGFR的Ishikawa细胞无明显抑制作用(P>0.05)。结论:转染EGFR基因能有效提高Ishikawa细胞内EGFR基因的表达,但可下调PR-B基因的表达使Ishikawa细胞对MPA不敏感。     

过表达NDRG1通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进滋养层细胞上皮-间质转化

目的:探讨N-myc下游调节基因1(NDRG1)过表达对滋养层细胞上皮-间质转化(EMT)的影响以及对Wnt/β-catenin信号通路的作用。方法:采用携带NDRG1基因的慢病毒感染人胎盘滋养层细胞系HTR-8/SVneo,建立NDRG1基因稳定过表达的HTR-8/SVneo细胞株。qRT-PCR和Western blot法检测慢病毒感染后细胞中NDRG1基因mRNA和蛋白的表达水平,Transwell小室法观察细胞侵袭和迁移能力,免疫荧光实验检测β-catenin蛋白核转位情况,Western blot法分析EMT相关蛋白、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9等蛋白表达。结果:慢病毒介导NDRG1过表达后,HTR-8/SVneo细胞中NDRG1 mRNA和蛋白表达水平显著上调。NDRG1过表达可显著增强细胞的侵袭和迁移能力,并上调MMP-2、MMP-9、波形蛋白(Vimentin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)、β-catenin、Snail1和环氧化酶-2(COX-2)等蛋白的表达水平,下调上皮钙黏蛋白(E-cadherin)和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)磷酸化水平,同时促进β-catenin蛋白由细胞质向细胞核转位。结论:NDRG1过表达可促进HTR-8/SVneo细胞EMT过程,提高细胞侵袭和迁移能力,其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路转导相关。     

17β-雌二醇对子宫内膜癌细胞上皮间质转化诱导作用的研究

目的:研究17β-雌二醇(17β-E2)对子宫内膜癌细胞发生上皮间质转化的诱导作用。方法:用17β-E2处理Ishikawa和HEC-1A细胞后,Western blot法检测两种细胞中E-cad、N-cad和Vimentin蛋白的表达。结果:经10-8mol/L E2作用后,Ishikawa细胞中的E-cad蛋白表达减少(P0.05),N-cad、Vimentin蛋白增加(P0.05);其他浓度作用前后,各蛋白表达无明显变化(P0.05)。经不同浓度E2作用后,HEC-1A细胞中E-cad、Ncad、Vimentin蛋白均无明显变化。结论:17β-E2仅在特定浓度下存在诱导ER阳性子宫内膜癌细胞Ishikawa发生上皮间质转化的作用。     

NLRC3对子宫内膜样癌作用的研究

目的:探讨NLR家族含CARD结构蛋白3(NLRC3)在子宫内膜癌组织中的表达情况及其对子宫内膜癌细胞系生物学行为的影响。方法:采用GEPIA数据库分析子宫内膜癌患者NLRC3表达水平及其与无病生存率的关系。免疫组化、Western blot法检测NLRC3在子宫内膜样癌组织、癌旁组织、对照组子宫内膜组织中的表达。Ishikawa(ISK)、KLE细胞转染过表达NLRC3慢病毒,细胞平板克隆、划痕愈伤实验、Transwell迁移及侵袭实验检测NLRC3对体外细胞增殖、迁移、侵袭的影响。Western blot实验检测过表达NLRC3对上皮间质转化(EMT)的影响。构建裸鼠皮下成瘤模型,检测过表达NLRC3对肿瘤生长的影响。结果:GEPIA数据库分析显示,NLRC3在子宫内膜癌组织中低表达,较高水平NLRC3与较好的无病生存率有关(P<0.05)。免疫组化、Western blot实验结果与数据库分析一致,NLRC3在子宫内膜样癌组织中的表达水平低于正常子宫内膜组织、配对癌旁组织(P<0.05),NLRC3表达随肿瘤病理分化程度降低而逐渐降低。ISK、KLE细胞过表达NLRC...     

微小RNA-7调控EGFR抑制上皮性卵巢癌细胞上皮间质转化的研究

目的:探讨微小RNA-7(miR-7)调控人上皮性卵巢癌(EOC)细胞上皮间质转化,抑制肿瘤侵袭转移的作用及机制。方法:选取EOC细胞株HO-8910pm、ES-2,用li-pofectmin 2000体外瞬时转染miR-7质粒,分别通过实时PCR和Western blot检测转染前后细胞株miR-7及EGFR蛋白表达情况;Western blot法检测转染前后细胞株上皮标记β-catenin、间质标记Vimentin及EGFR下游信号通路AKT、ERK蛋白磷酸化水平;实时PCR检测转染前后EMT相关转录因子Snail、Slug、ZEB1、ZEB2的表达。Transwell肿瘤细胞侵袭实验检测转染前后细胞体外侵袭能力。结果:转染miR-7质粒后,HO-8910pm细胞miR-7的表达水平提高了(8.015±0.181)倍,ES-2细胞miR-7表达提高了(28.03±1.253)倍;EGFR蛋白表达均显著下降;转染后细胞的侵袭能力显著下降,HO-8910pm与ES-2的侵袭抑制率分别为62.33%、71.32%;转染后两种细胞的β-catenin蛋白表达均升高,而Vimentin蛋白表达降低;转录因子Snail、Slug的表达较未转染前显著降低(P<0.05),转染前后ZEB1、ZEB2无显著差异;转染后细胞p-AKT,p-ERK1/2表达均下降。结论:miR-7可通过调控EGFR的表达抑制其下游AKT和ERK1/2信号通路的活化以及逆转EMT,从而抑制EOC细胞的侵袭转移能力。     

miR-200a靶向雌孕激素受体抑制子宫内膜癌细胞生长的作用研究

目的:探讨miR-200a对子宫内膜癌细胞雌孕激素受体的靶向作用及生长的影响。方法:选取两种人子宫内膜癌细胞株KLE和Ishikawa,q PCR法检测miR-200a、ESR1和PGR含量,Western blot法检测ER和PR表达。分别在Ishikawa、KLE细胞株中敲除、过表达miR-200a,检测miR-200a对Ishikawa细胞中ESR1和PGR mRNA含量,以及ER和PR表达水平的影响。采用MTT、流式细胞仪、细胞划痕实验和Transwell实验检测miR-200a对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结果:Ishikawa细胞中miR-200a、ESR1和PGR含量及ER和PR表达水平均高于KLE细胞(P0.01)。敲除miR-200a后,可降低Ishikawa细胞中ESR1和PGR含量及ER和PR表达水平(P0.01)。敲除miR-200a后,细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强,细胞凋亡水平下降,过表达miR-200a则呈相反效应(P0.01)。给予他莫昔芬和RU-486后,上述效应均被一定程度逆转(P0.01)。结论:miR-200a可靶向作用于子宫内膜癌细胞雌孕激素受体,进而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,有效促进细胞的凋亡。     

HOXA10在子宫内膜癌中的表达及调控机制探讨

目的:探讨HOXA10在子宫内膜癌组织中的表达情况,以及miRNA135a对HOXA10表达的调控和对子宫内膜癌细胞侵袭能力的影响。方法:通过靶基因预测确定miRNA135a与HOXA10的相关性。应用免疫组化法检测HOXA10在子宫内膜癌组织中的表达。通过脂质体转染法瞬时转染HEC-1B和Ishikawa细胞系建立瞬时过表达miRNA135a模型。Real-time PCR和Western blot法检测转染前后HOXA10 mRNA和蛋白水平表达的变化,通过划痕实验、Transwell侵袭实验观察细胞侵袭和迁移能力的变化。结果:子宫内膜癌中HOXA10表达水平显著低于正常子宫内膜组织(P0.01);过表达miRNA135a后,HEC-1B和Ishikawa细胞的迁移和侵袭能力显著增强,差异有统计学意义(P0.01),两种细胞中HOXA10 mRNA和蛋白水平均显著降低(P0.01)。结论:子宫内膜癌中miRNA135a通过抑制HOXA10促进内膜癌细胞的侵袭和迁移能力,参与子宫内膜癌生物学行为的调控。     

子宫内膜癌肿瘤微环境内IGFBP-3表达及其对肿瘤侵袭能力的影响

目的:探讨子宫内膜癌肿瘤微环境内IGFBP-3表达与肿瘤-间质相互作用的关系,以及IGFBP-3表达对子宫内膜癌侵袭能力的影响。方法:免疫组化法检测子宫内膜癌、正常子宫内膜组织中IGFBP-3的表达情况。肿瘤相关成纤维细胞(CAF)、正常内膜成纤维细胞(NF)与子宫内膜癌Ishikawa细胞在Transwell小室内共培养,RT-PCR、ELISA法检测IGFBP-3表达水平的改变。Transwell侵袭实验评估IGFBP-3表达改变对Ishikawa细胞侵袭能力的影响。结果:子宫内膜癌组织中IGFBP-3表达显著低于正常子宫内膜组织(P0.01)。CAF、NF与Ishikawa细胞共培养后,两种间质成纤维细胞中IGFBP-3 mRNA表达水平均显著下降(P0.01);而在Ishikawa细胞,CAF可使其IGFBP-3 mRNA表达显著降低(P0.01),但NF对其无显著影响(P0.05)。CAF、NF均能促进Ishikawa细胞的侵袭能力;与单Ishikawa细胞组和NF+Ishikawa共培养组相比,CAF共培养能显著增加Ishikawa细胞的侵袭能力(113.33±8.50 vs 65.17±10.23、75.33±8.21,P0.01)。而加入外源性重组人IGFBP-3后,能显著抑制CAF的促侵袭作用。结论:子宫内膜癌肿瘤与间质相互作用可导致肿瘤微环境内IGFBP-3表达下降,而肿瘤微环境IGFBP-3表达的改变与子宫内膜癌的生长、侵袭和转移密切相关。     

子宫内膜癌中孕激素受体亚型表达及其甲基化状态的研究

目的:研究子宫内膜癌中孕激素受体亚型PRA、PRB表达与其启动子区甲基化状态的关系,探讨子宫内膜癌中孕激素受体亚型表达下调的机制。方法:(1)应用Real-Time PCR法检测子宫内膜癌及正常组织中孕激素受体亚型PRA、PRB mRNA的表达及去甲基化试剂5-Aza-CdR处理Ishikawa细胞前后孕激素两种受体亚型及DNA甲基化转移酶mRNA的表达;(2)应用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测子宫内膜癌细胞系Ishikawa中PRA、PRB的甲基化状态。结果:与正常子宫内膜组织比较,子宫内膜癌组织中,总PR表达显著降低,与病理类型相关;PRB表达显著下降,与其临床特征无关。子宫内膜癌细胞系Ishikawa中,加入5-Aza-CdR2.5μmol/L48h后,孕激素受体亚型PRA、PRB甲基化条带均消失;孕激素受体亚型PRA、PRB mRNA表达水平增加;同时Ishikawa细胞中DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3B表达下调。结论:子宫内膜癌组织中,孕激素受体亚型mRNA表达下调可能与子宫内膜癌的发生相关;孕激素受体亚型表达下调与其启动子区甲基化状态相关;去甲基化试剂5-Aza-CdR可逆转基因启动子区的甲基化状态,恢复PR基因的表达。     

P27，P73和CyelinD1蛋白在子宫内膜癌中表达的相关性

目的：探讨P27,P73和CyclinD1在子宫内膜癌组织中的表达及其相关性。方法：采用免疫组化SP法对14例正常增殖期子宫内膜、19例不典型增生内膜以及43例子宫内膜癌组织中P27,P73和CyciinD1蛋白的表达进行研究。结果：在子宫内膜癌中。P27表达降低或缺失,P73和CycJinD1表达明显增高,与正常增殖期子宫内膜和不典型增生内膜相比差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。P27的表达缺失、P73的过表达与组织学分级有关,CyclinD1的高表达与手术一病理分期有关。有肌层浸润者P27,P73和CyclinD1的表达与无肌层浸润者差异均有统计学意义（均P〈0．05）。有淋巴结转移者P73和CyclinD1均明显高表达。子宫内膜癌中,P27与CyclinD1呈负相关（R=-0．3627,P〈0．05）,P73与CyclinD1呈正相关（r=0．3923,P〈0．05）。结论：子宫内膜癌中P27表达缺失,P73和CyclinD1过度表达,联合检测可能成为子宫内膜癌高危人群早期筛查、判断内膜癌的生物学行为及评估预后的参考指标。     

G蛋白耦联受体30和表皮生长因子受体在子宫内膜腺癌中的表达

目的：探讨G蛋白耦联受体30（GPR30）和表皮生长因子受体（EGFR）在子宫内膜腺癌组织中表达的意义及其关系。方法：20例子宫内膜不典型增生（EAH）组织、50例子宫内膜腺癌（EAC）组织,采用免疫组化EliVision二步法检测各组组织中GPR30和EGFR表达情况,另设20例正常子宫内膜组织标本作为对照组。分析GPR30和EGFR的表达与子宫内膜癌患者临床病理特征的关系。结果：对照组、EAH组、EAC组组织中GPR30的阳性表达率分别为10.0%、45.0%和74.0%,组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）,EAH组显著高于对照组（P＜0.05）,EAC组显著高于EAH组（P＜0.05）;GPR30表达与EAC组织病理学分级有关（P＜0.05）,但与其他临床病理特征无关（P＞0.05）。EGFR在对照组、EAH和EAC组中阳性表达率分别为30.0%、40.0%和70.0%, EAC组显著高于EAH组和对照组（P＜0.05,P＜0.001）,但EAH组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。在EAC组中,EGFR表达与手术-病理分期、组织病理学分级和肿瘤直径有关（P＜0.05）,与其他临床病理参数无关（均P＞0.05）。EAC组中GPR30和EGFR表达呈正相关（r=0.308,P＜0.05）。结论：GPR30和EGFR的过表达可能与子宫内膜腺癌的发生发展相关。GPR30和EGFR在子宫内膜腺癌中表达呈正相关,两者间可能存在相互作用。GPR30和EGFR可能成为治疗子宫内膜癌更为有效的新靶点。     

TLR2及β-arrestin2在子宫内膜癌中的表达及关系的初步研究

目的:初步研究TLR2及β-arrestin 2在子宫内膜癌发生、发展及转移中的表达及关系。方法:(1)选取2005年11月至2011年9月北京大学人民医院的组织标本80例,其中正常子宫内膜20例,子宫内膜非典型增生20例,子宫内膜癌40例(其中复发转移癌20例)。采用免疫组化染色检测TLR2及β-arrestin 2的表达。(2)分别转染β-arrestin 2空白荧光质粒(GFP)、β-arrestin 2全长质粒(全长质粒过表达组)及β-arrestin 2干扰RNA质粒(β-arrestin 2-iRNA干扰组)至子宫内膜癌HEC-1B细胞,real-time PCR方法验证转染效果,同法测定各组总RNA中TLR2、MYD88、NF-κB的表达。结果:子宫内膜癌组织中TLR2、β-arrestin 2表达均显著高于正常内膜组织及非典型增生组织(P均0.01),TLR2与β-arrestin 2表达呈正相关(r=0.875,P0.01)。TLR2、MYD88、NF-κB在β-arrestin 2-iRNA干扰组中表达降低(P0.05),在全长质粒过表达组中表达增高(P0.05)。结论:β-arrestin 2可作为TLR2激动剂,激活TLR2途径的MyD88依赖型信号转导通路活化NF-κB。     

雌激素受体ERα36在子宫内膜癌组织中表达及临床意义的初步研究

目的:分析新型雌激素受体ERα36在子宫内膜癌组织中的表达与临床病理特征的关系。方法:免疫组织化学方法检测73例子宫内膜癌、20例正常子宫内膜、9例不典型增生子宫内膜组织切片ERα36的表达,并分析其与临床病理特征间的关系。结果:ERα36在子宫内膜癌组织中阳性表达率(32.9%,24/73)显著低于正常子宫内膜组织(85%,17/20)(P<0.01);ERα36阴性表达者较阳性表达者出现更多宫颈受侵(48.9%vs 20.8%,P<0.05);ERα36阳性表达者无疾病生存时间短于阴性表达者(P<0.01);ERα36表达与患者年龄、临床分期、组织学分级、肌层浸润、淋巴结转移和病理类型的差异无统计学意义(P>0.05);ERα36表达与ER、PR、PTEN、p53无显著相关性(P>0.05)。结论:ERα36在子宫内膜癌组织的表达明显低于正常子宫内膜组织;ERα36表达与ER无明显相关性,可能是子宫内膜癌预后的一个指标。