由构建的基因组全长cDNA所回收的我国登革2型病毒株的鉴定

目的 由构建的病毒基因组全长cDNA回收具有感染性的我国登革2型病毒株,为进一步阐明登革2型病毒的致病机制及其新型疫苗的研制奠定基础。方法 用SP6 RNA聚合酶系统制备我国登革2型病毒（D2－43）株基因组全长cDNA的体外RNA转录物,纯化后经电穿孔法转染C6／36细胞,观察致细胞病变作用以判断其感染性。从病变的细胞和培养上清中提取总RNA,通过RT－PCR扩增及克隆测序的方法证实细胞病变确为RNA转录物感染所致。同时收集可产生细胞病变的培养上清,再感染C6／36细胞以进一步证实所回收的登革2型病毒感染的稳定性。结果 以我国D2－43病毒株基因组全长cDNA为模板制备的体外RNA转录物可使C6／36细胞产生病变,从病变细胞和培养上清中可扩增获得病毒特异的基因片段。在培养细胞中进行连续传代仍可产生细胞病变作用。结论 构建的我国D2－43株基因全长cDNA的体外RNA转录物对传代蚊细胞具有感染性,表明可产生完整的病毒颗粒。本研究可为阐明登革2型病毒的致病机理及探索新的预防和治疗措施奠定基础。     

应用长链RT-PCR法扩增我国登革2、4型病毒株全长cDNA

目的：采用长链RT-PCR技术扩增登革2型及4型病毒基因组全长cDNA，为构建登革病毒全长cDNA克隆、表达，深入阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法：根据已测定的登革2、4型病毒全基因组序列，设计上下游引物。从感染登革病毒的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA，采用长链RT-PCR技术进行扩增。为检验扩增产物的特异性，以PCR产物为模板扩增覆盖基因组的10个片段。将含有复杂二级结构的5′非编码区扩增片段，在377A型自动测序仪进行序列分析。结果：扩增出登革2、4型病毒基因组全长近11kb cDNA分子，非编码区测序结果表明扩增产物为登革2、4型病毒所特有。结论：利用长链RT-PCR首次成功扩增出登革病毒全长cDNA分子。     

我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性研究

目的 研究我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性，为构建登革病毒的感染性克隆、深入阐明病毒的致病机理奠定基础。方法 以我国登革2、3、4型病毒基因组全长cDNA为模板，用SP6 RNA聚合酶系统制备体外RNA转录体，经电穿孔转染细胞，观察其致细胞病变效应。从病变细胞培养上清中提取总RNA，用病毒特异引物进行RT-PCR扩增，以证实细胞病变为转录体RNA的恢复病毒所致。结果 我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体均可使细胞产生病变，从细胞培养上清中可扩增出登革病毒特异的片段。结论 构建的我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体具有感染性．可在蚊传代细胞内恢复为登革病毒颗粒。     

登革2型病毒04株基因组全序列的测定

目的 对我国登革２型病毒０４株（Ｄ２－０４）基因组进行全序测定及分析，为了解其基因组织结构与生物功能的关系及研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法 根据登革２型国际标准株ＮＧＣ的序列，设计１３对重叠引物，通过ＲＴ－ＰＸＣＲ扩增同Ｄ２－０４株不同的ｃＤＮＡ片段，分别克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体，转化受体菌ＤＨ５α，挑取阳性克隆进行ＰＣＲ、酶切鉴定及序列测定。结果 Ｄ２－０４株的基因组全长１０７２３个碱基，     

我国登革2型病毒43株非结构蛋白NS1基因的特征

对我国１９８７年从广西分离的登革２型病毒４３株非结构蛋白ＮＳ１基因的核苷酸序列进行了分析，结果表明登革２型病毒４３株非结构蛋白ＮＳ１基因含有１０５６核苷酸编码３５２个氨基酸，并就其核苷酸序列及其相应的氨基酸序列与我国１９８５年海南流行高峰期分离的Ｄ２－０４株、国际参考株新几内亚Ｃ株（ＮＧＣ）、牙买加株（ＪＡＭ）、候选疫苗株（Ｓ１）和马来西亚流行株Ｍ１（登革出血热）、Ｍ２（登革休克综合征）、Ｍ３（登革热）进行比较，发现核苷酸序列的同源性分别为９２．２％，９３．７％，９３．３％，９０．７％，８９．９％，８９．５％，８９．３％，氨基酸的类似性分别为８９．８％，９２．６％，９３．３％，９１．２％，９０．６％，９０．１％，８９；９％，推断的氨基酸序列含有两个糖基化位点，分别位于氨基酸残基的１３０和２０７位，一个可能的蛋白裂解位点３５０～３５２和１０个保守的半胱氨酸残基。     

我国登革2型病毒43株PrM-E基因的DNA免疫原性研究

目的 观察我国登革２型病毒４３株ＰｒＭ－Ｅ基因的ＤＮＡ免疫原性及非甲基化细菌性ＣｐＧ对ＤＮＡ免疫效果的影响。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段，并将其插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ中。在证明其可在哺乳动物细胞中高效表达的基础上，进一步用重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果 用含ＰｒＭ－Ｅ基因的重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠可诱导产生     

登革2型病毒全长cDNA克隆定点诱变的OL-PCR方法

目的 对带有登革2型病毒（DEN-2）全长cDNA的质粒pDVWS501上E62、E203位点进行定点诱变。方法 设计4对点诱变引物,运用OL-PCR（overlapPCR)法,扩增出分别在E62或E203位带有点突变的2条DNA片段,克隆至T载体,获T-TB62、T-TB203两个克隆,将T-TB62用ClaⅠ和SphⅠ分别酶切,T-TB203用SphⅠ NheⅠ酶切后,用T4连接酶分别连接至pDVWS501,获重组质粒TB62和TB203。对TB62和TB203进行序列测定。结果 成功得到分别在E62、E203位带有点突变的TB62、TB203克隆。结论 OL-PCR法是具有较高突变效率的定点诱变方法。     

我国登革2型病毒43株包膜E蛋白MBP-B165抗原性的研究

目的 通过对我国登革2型病毒株包膜E蛋白包括B区在内的第267－432氨基酸编码基因片段的表达,研究MBP－B165蛋白的抗原性。方法 首先采用PCR方法扩增了编码B165蛋白的基因片段,并将其插入到pMal－C2核载体进行融合表达。采用蛋白印迹和ELISA法对表达产物进行特异性鉴定。用表达的融合蛋白MBP－B165免疫大白兔,产通过ELISA法检测兔免疫血清中登革2型病毒特异的抗体。结果 表达的融合蛋白MBP－B165可与我国登革2型病毒株抗体特异结合,而且与登革1、3和4型病毒参考株的多克隆抗体均具有较高的反应性。用表达蛋白免疫大白兔可产生针对我国登革2型病毒株E蛋白的特异抗体,并且该抗体与基他3个型病毒参考株有交叉反应。结论 我国登革2型病毒43株E蛋白包括B区在内的第267－432氨基酸序列具有一定的抗原性,而且具有黄病毒亚组特异的反应性表位,即4个型登革病毒的结构保守性表位。     

冠状病毒全长cDNA感染性克隆研究进展

冠状病毒是已知RNA病毒中基因组最大的一类病毒，其基因组复制不涉及DNA中间体，所以要进行病毒分子水平上的研究，必须将病毒基因组RNA转换成cDNA，然后构建出cDNA克隆，通过对cDNA克隆的操作间接实现对病毒基因组RNA的操作，从而为冠状病毒基因组研究提供易于操作的技术平台，大大提高了病毒的研究潜力。本文就构建冠状病毒基因组全长cDNA感染性克隆的最新进展做一综述。     

新分离登革2型病毒福建株基因组全序列的测定

目的 对新近分离的导致1999年福建省登热流行的登革2型病毒FJ－10株进行基因组全序列测定及系统发生树分析。方法 利用RT－PCR和5′、3′RACE法扩增FJ－10株cDNA,并进行克隆测序,利用DNASTAR折Clustal方法绘制系统发生树。结果 JF－10株基因组全长10723个核苷酸,有1个单一开放读码框架（ORF,第97－10269nt）,编码3391个氨基酸,5′和3′非编码区长度分别为96和454个核苷酸,通过与标准株NGC株和我国其他地区分离株DEN2－04、43、44株比较,核苷酸同源性分别为94.0%、92.8%、93.9%和93.9%,氨基酸同源性分别为97.9%、97.2%、97.7%和97.9%。以47株登革2型病毒E／NS1连接区240个核苷酸序列进行发生树分析,福建株与印度尼西亚和斯里兰卡分离株亲缘关系较近,同属第Ⅳ基因型。结论 FJ－10株基因组全序列一级结构与其他登革2型病毒类似,其基因型不同于我国其他地区分离株DEN2－04、43和44株。     

登革2型病毒海南分离株全长E基因的测定与分析

目的 测定我国登革2型病毒海南分离株E基因的全序列，并分析其病毒学特性和分子进化特征。方法 运用RT-PCR法扩增我国登革2型病毒海南分离株D2V—HN89)E基因，测序并用计算机分析序列，作毒株感染细胞及乳小白鼠试验。结果 D2V-HN89株E基因核苷酸全长1464bp，核苷酸和氨基酸序列与D2V—NGC株的同源性分别为95％和980A，系统树分析显示其与登革2型牙买加株及登革2型巴西90株的亲缘关系最近。D2V—HN89株的细胞病变效应与D2V—NGC株相同，但对乳小白鼠神经毒力较弱。结论 D2V-HN89株的E基因区有缺失，该流行毒株可能来源于牙买加或巴西登革热流行区。     

小鼠抗登革病毒2型单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备小鼠抗登革病毒2型(TR1751株)的单克隆抗体(Monoclonal antibody mAb)，并对其性质进行鉴定。方法免疫原为病毒感染的Blabfc乳鼠脑组织，匀浆后离心，去除细胞成分。免疫Blab／c小鼠，将小鼠脾细胞和SP2／0细胞融合后，通过ELISA、间接免疫荧光染色、噬斑减少中和实验(Plaque reduction neutralization test，PRNT)及Western blot进行筛选和鉴定。结果筛选到I1、I9和B152 3株杂交瘤细胞系，其分泌的mAb均为识别登革病毒E蛋白的中和抗体。结论获得了3株分泌小鼠抗登革病毒2型mAb的杂交瘤细胞系，利用所制备的抗体，为进一步研究登革病毒致病机理和开发疫苗提供了免疫学工具。     

登革2型病毒广东流行株结构蛋白基因序列测定及分析

目的 对广东省90年代以来流行的3株登革2型病毒(DEN2)的结构蛋白基因序列测定及分析，了解流行株之间的相互关系、变异及基因型：方法 应用RT-PCR技术扩增广东省不同年份流行的3株DEN2型病毒的结构蛋白基因(C、PrM、E基因)。分别克隆到pMD18T载体，转化JM109宿主菌，挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定。结果 3株DEN2病毒结构蛋白基因序列长度均为2325bv，编码775个氨基酸。三者核苷酸(氨基酸)的同源性分别是：GD06／93与GD19／2001为96％(97％)、GD06／93与GD08／98为94％(97％)、GD08／98与GD19／2001为92％(94％)。其在相关毒力位点E383～385处均为GLU—PRO-GLY、E126处均为GLU。3株DEN2与国际参考株比较表明：GD06／93与GD19／2001和澳大利亚TSV01株共享序列非常接近，核苷酸(氨基酸)的同源性为98％(98％)；GD08／98与泰国株ThNH-P28／93核苷酸(氨基酸)同源性为98％(98％)。此3株DEN2二级结构与对乳鼠不致病的04株比较，主要差别位于其393～400氨基酸处，本室分离的3株对乳鼠致病毒株为EEEEHHHH，而04株为EEEE----；337～343处本室分离的3株对乳鼠致病毒株为HH-------HHHHH，而04株为--------HHHHE-，恰好位于Dengue病毒E基因的Ⅲ区：结论 GD06／93、GD19／2001与TSV01亲缘关系较近，属同一基因型。GD08／98与ThNH—P28／93共享序列非常接近，属同一基因型。3株DEN2病毒在E蛋白Ⅲ区结构有一定变异，可能与毒力有关。     

Characterization of Asn130-to-Ala mutant of dengue type 1 virus NS1 protein

The nonstructural protein 1 (NS1) of flavivirus has two N-glycosylation sites that are thought to be important for viral replication. Effects of NS1 glycosylation site mutations on viral replication have been reported in several flaviviruses, but the results have differed. In this report, we examined the role of glycosylation site of NS1 on the replication of dengue type 1 virus (DENV-1). DENV-1 production was not detectable when full-length DENV-1 RNA, which has an N-glycosylation site Asn130-to-Ala (Asn130Ala) mutation in NS1, was transfected into mammalian and mosquito cells. However, replication and secretion of recombinant DENV-1 with the NS1 Asn130Ala mutation were recovered by exogenously expressed wild-type DENV-1 NS1. A growth kinetics experiment showed that propagation of wild-type DENV-1 was prevented by NS1 Asn130Ala mutant expression in trans. Our results suggest that Asn130 of the DENV-1 NS1 is important for viral replication in both mammalian and mosquito cells.     

登革2型病毒ZSO1／01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究

目的对登革2型病毒（DENV-2）ZSO1／01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究。方法RT．PCR扩增DENV-2prM／E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20％区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆人哺乳动物细胞表达载体pcDNA5／FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或Sf9细胞,利用间接免疫荧光（Immunofluoreseence assay,IFA）及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌。结果各重组质粒分别转染293T细胞或Sit）细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20％区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌。结论信号肽及E基因羧基末端20％区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响。     

登革2型病毒ZS01/01株病毒样颗粒免疫原性研究

目的 研究登革2型病毒（Dengue virus type 2,DENV-2）病毒样颗粒（virus-Like particles,VLPs）的免疫原性.方法 利用已构建的DENV-2 ZS01/01株病毒样颗粒的表达质粒转染293T细胞,对分泌型VLPs进行大量培养并通过蔗糖密度梯度离心法对其进行纯化.纯化的VLPs经Western Blot及透射电镜观察等方法鉴定后免疫BALB/c小鼠.利用ELISA及中和试验等方法对体液免疫反应进行检测,ELISPOT法测定细胞免疫水平.结果 登革2型病毒样颗粒表达质粒转染哺乳动物细胞所得上清经蔗糖密度梯度离心后,电镜下可观察到类似于天然登革病毒的大小在45～55nm之间的病毒样颗粒.体液及细胞免疫检测结果显示登革2型VLPs可以刺激小鼠产生较高水平的登革E蛋白特异性抗体及一定水平的中和抗体,免疫小鼠脾淋巴细胞经体外刺激后IFN-γ水平显著升高.结论 登革2型病毒病毒样颗粒免疫BALB/c小鼠后可引起一定水平的细胞免疫及体液免疫反应,该研究结果为四价登革病毒样颗粒疫苗的研制奠定了基础.