烟草提取物与环氧化酶-2对食管鳞癌细胞株增生作用的研究

目的通过研究烟草提取物对食管鳞癌细胞系EC109和EC9706的促增生作用,探索烟草致癌的机制。方法将人食管鳞癌细胞株EC109和EC9706与烟草提取物孵育后,用噻唑蓝法定量检测细胞增生情况,用反转录聚合酶链反应法检测其环氧化酶-2(COX-2)的mRNA表达情况。结果细胞培养结果表明,2种烟草提取物对EC109和EC9706细胞株的促增生作用均具有时间依赖性的特点,但剂量依赖性不明显。组间差异有统计学意义(P<0.01)。烟草乙醇提取物(EE)的促增生作用与COX-2基因表达增强相关。结论烟草提取物对食管鳞癌细胞存在促增生作用,且这种促增生作用可能与COX-2的表达增强有关。     

RNA干扰阻断COX-2基因表达对食管鳞状上皮癌EC109细胞株增生和凋亡的影响

目的研究COX-2基因与食管鳞癌细胞EC109增生和凋亡的关系,观察阿司匹林对食管鳞癌细胞EC109增生和凋亡的影响,探索基因治疗和药物抑制肿瘤的机制。方法采用RNA干扰的方法,用荧光显微镜观察RNA干扰的转染效率,用Westernblot方法分析RNA干扰的效果,用噻唑兰法定量检测RNA干扰和阿司匹林对食管鳞癌细胞增生的影响,用流式细胞仪检测RNA干扰和阿司匹林对食管鳞癌细胞凋亡的影响。结果Westernblot方法证实,RNA干扰后EC109细胞COX-2表达下降至对照组的40%。MTT法检测结果显示,用COX-2基因干扰后,EC109细胞生长抑制作用增强,COX-2基因干扰和阿司匹林联合作用后,肿瘤细胞的生长抑制作用进一步增强。流式细胞仪检测结果显示,母本细胞组和RNA干扰的阴性对照组凋亡率较低,COX-2基因干扰后,促凋亡作用增加。COX-2基因干扰后再给予阿司匹林,促凋亡作用进一步增加。结论RNA干扰特异性抑制细胞COX-2蛋白的表达后,抑制食管鳞癌细胞株EC109的生长增生,增强凋亡作用,阿司匹林和RNA干扰对肿瘤细胞的增生和凋亡可产生协同效果。     

尼美舒利、阿司匹林对COX-2不同表达水平的食管鳞癌细胞株的抑制作用

目的比较选择性和非选择性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂对不同COX-2表达水平的食管鳞癌细胞的抑制作用。方法选取食管鳞癌细胞株EC109和TE-1,采用Western blotting法测定COX-2蛋白表达、MTT法检测细胞增生以及流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡(PI标记),观察阿司匹林及尼美舒利对2株细胞增生、凋亡的作用。结果 Westernblotting结果显示,EC109细胞表达COX-2,TE-1细胞不表达COX-2。选择性COX-2抑制剂———尼美舒利可抑制EC109细胞的增生,抑制率为(17.5±3.3)%~(80.1±3.9)%。尼美舒利仅在0.4 mmol/L时对TE-1细胞有抑制作用,抑制率为(16.2±7.0)%。尼美舒利可使EC109细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期,并诱导细胞凋亡,但对TE-1细胞无上述作用。非选择性COX-2抑制剂———阿司匹林在0~4 mmol/L浓度区间对EC109和TE-1均有抑制作用,并呈剂量依赖关系。阿司匹林作用后,EC109与TE-1的细胞周期均被阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率分别为(10.55±0.01)%及(8.52±6.65)%。结论食管鳞癌(esophagealsquamous cell carcinoma,ESCC)细胞株中COX-2的表达水平影响了选择性COX-2抑制剂的抑制作用,而对非选择性COX-2抑制剂影响较小。阿司匹林可能通过非COX-2依赖途径从而发挥对肿瘤的抑制作用。     

尼美舒利对食管鳞癌细胞的增生抑制和诱导凋亡作用

目的研究特异性环氧化酶-2抑制剂尼美舒利对食管鳞癌细胞的增生抑制和诱导凋亡作用。方法EC109细胞与不同浓度的尼美舒利共同孵育。1)用MTT方法研究细胞增生抑制作用;2)用荧光标记的流式细胞检测技术研究尼美舒利的诱导凋亡作用;3)检测细胞培养上清液中前列腺素E2质量浓度,观察尼美舒利对环氧化酶功能的影响。结果尼美舒利抑制食管鳞癌细胞增生,呈浓度及时间依赖性;尼美舒利可诱导食管鳞癌细胞凋亡,可抑制前列腺素E2的合成。结论尼美舒利抑制食管鳞癌细胞增生诱导凋亡作用,可能是通过抑制前列腺素E2的合成而实现的。环氧化酶-2抑制剂有可能在食管鳞癌的预防及治疗上发挥重要作用。     

PI3K/Akt抑制剂对人食管癌EC109细胞的生长抑制及促凋亡作用研究

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)特异性抑制剂LY294002对人食管癌EC109细胞生长抑制及凋亡的影响。方法通过不同浓度的LY294002作用于人食管癌EC109细胞,MTT法检测EC109细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hoechst荧光染色和倒置相差显微镜观察EC109细胞形态学变化。结果经LY294002作用后,EC109细胞凋亡率增加,其生长明显受到抑制,经40μmol/L的LY294002作用72h后,荧光染色和相差显微镜观察到EC109细胞呈现典型细胞凋亡改变。且LY294002对食管EC109细胞的抑制率与LY294002的浓度及作用时间呈正相关(r为0.942、0.963,P<0.01),凋亡率亦与LY294002的浓度及作用时间均呈显著正相关(r为0.975、0.938,P<0.01)。结论 LY294002可抑制食管癌EC109细胞生长,并诱导其凋亡。     

没食子酸经线粒体途径对癌细胞的诱导凋亡作用研究

目的 研究没食子酸(GA)对肝癌HepG2细胞、胃癌SGC7901细胞、结肠癌EC109细胞的诱导凋亡作用,并初步探讨作用机制。方法 设置不同的GA含量,分别采用MTT法、CCK-8法、活性氧水平测定、Hoechst 33258荧光染色法、线粒体膜电位与细胞凋亡检测考查GA对三种细胞的诱导凋亡机制。结果 GA对HepG2、SGC7901及EC109 3种细胞活性具有浓度依赖的抑制效果;在N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)作用下,HepG2、SGC7901及EC109细胞的细胞活性及存活率有明显提高(P<0.05),三种癌细胞的ROS水平下降。HepG2细胞荧光染色结果显示活细胞减少而凋亡细胞增多,线粒体膜电位降低。结论 GA作为促氧化剂,通过上调胞内ROS水平使线粒体膜电位降低而诱发细胞内源性凋亡,最终抑制三种癌细胞的生长。     

核因子KappaB途径在烟草提取物促食管鳞状细胞癌细胞增生中的作用

目的观察烟草乙醇提取物(ethanol extraction,EE)的促增生作用和核因子KappaB(nuclear factor of kappa B,NF-κB)抑制剂二硫氨基甲酸肽吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)的抑制作用对NF-κB活性的影响,从而探讨NF-κB在烟草相关食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)发病机制中的作用。方法 EE分别与PDTC预处理的2株ESCC细胞共同孵育24h后,用噻唑蓝法检测细胞增生情况;AnnexinV+PI双染检测细胞凋亡情况;凝胶迁移率、Western blotting方法检测干预前后EE对NF-κB活性的影响。采用免疫组织化学的方法测定ESCC组织标本中NF-κB的表达,并比较吸烟与非吸烟组阳性率的差异。结果 PDTC在25～200mg/L浓度区间可抑制2株细胞的增生,呈剂量依赖性。EE作用24h后,对2株细胞均呈现剂量依赖的促增生和抑制凋亡作用。EE能促进2株细胞中NF-κB的活性。PDTC预处理后,EE的上述作用均减弱。ESCC组织中NF-κB的阳性率为79.59%;吸烟组NF-κB的阳性率高于非吸烟组。结论 EE可促进ESCC细胞株中NF-κB的活性,这种作用可被NF-κB抑制剂所阻断;ESCC组织中NF-κB呈高表达,吸烟可能增加ESCC组织中NF-κB的活性。     

DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人食管癌细胞株Eca109的影响

目的:探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-CdR)对人食管癌细胞株Eca109增殖作用的影响。方法:应用不同浓度(10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR,于不同作用时间(24～168h)处理人食管鳞癌细胞株Eca109,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定5-aza-CdR作用下Eca109细胞株的生存率,倒置显微镜观察细胞的形态学变化。结果:不同药物浓度组在同一作用时间下,细胞株生存率差异有统计学意义(P<0.05);同一药物浓度不同作用时间组之间(24～96h)的细胞生存率差异也有统计学意义(P<0.05),且96h时对人食管鳞癌细胞株Eca109生长抑制作用最明显。形态学观察显示:癌细胞体积缩小,核固缩,染色质凝聚成块。结论:5-aza-CdR有抑制人食管癌细胞株Eca109生长的作用,抑制作用呈时间依赖性及浓度依赖性;并且干预后癌细胞呈现典型的凋亡细胞形态改变。     

DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2''''-脱氧胞苷对人食管癌细胞株Eca109的影响

目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-CdR)对人食管癌细胞株Eca109增殖作用的影响.方法应用不同浓度(10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L)的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR,于不同作用时间(24～168 h) 处理人食管鳞癌细胞株Eca109,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定5-aza-CdR作用下Eca109细胞株的生存率,倒置显微镜观察细胞的形态学变化.结果不同药物浓度组在同一作用时间下,细胞株生存率差异有统计学意义(P＜0.05);同一药物浓度不同作用时间组之间(24～96 h)的细胞生存率差异也有统计学意义(P＜0.05),且96 h时对人食管鳞癌细胞株Eca109生长抑制作用最明显.形态学观察显示癌细胞体积缩小,核固缩,染色质凝聚成块.结论5-aza-CdR有抑制人食管癌细胞株Eca109生长的作用,抑制作用呈时间依赖性及浓度依赖性;并且干预后癌细胞呈现典型的凋亡细胞形态改变.     

RNA干扰沉默食管癌COX-2基因的实验研究

目的:观察人食管鳞癌细胞(Eca-109)在RNAi抑制其环氧合酶2(COX-2)基因表达后生物学行为的变化。方法:采用DNA载体细胞内表达siRNA技术,以含RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的质粒pSUPER,针对人COX-2 mRNA分别构建重组质粒psiRNA-C1、psiRNA-C2,转染Eca-109细胞,对照组采用空白质粒pSU-PER。ELISA测定培养液上清PGE2浓度,Real Time PCR检测细胞COX-2 mRNA水平,流式细胞术分析细胞凋亡与周期分布,绘制细胞生长曲线。结果:在psiRNA-C1p、siRNA-C2转染Eca-109细胞24 h后,细胞COX-2mRNA水平分别下降了17.9%、56.1%,培养液上清PGE2浓度分别下降了10.8%5、4.9%;psiRNA-C2组细胞生长明显减缓,G0~G1期细胞比例增加(P<0.01),G2~M期细胞减少(P<0.05)、细胞凋亡率增加(P<0.01)。结论:RNAi技术可显著抑制人食管鳞癌细胞COX-2基因表达,从而导致肿瘤细胞增殖减缓、凋亡增加。     

Aspirin inhibits the proliferation of tobacco-related esophageal squamous carcinomas cell lines through cyclooxygenase 2 pathway

Background  Cigarette smoking has been verified as the risk factor of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). Overexpression of cyclooxygenase 2 (COX-2) is shown in ESCC. The objective of this study was to investigate the effects of cigarette smoking ethanol extract (EE) on the proliferation of the human ESCC cell lines, and to explore the correlation between the proliferation rate of human ESCC cell lines and the expression pattern of COX-2. Whether aspirin can inhibit the proliferation of the ESCC cell lines pretreated with EE, and regulate the mRNA expression levels of COX-2 are also examined.
Methods  Two human ESCC cell lines were selected. EC109 was poorly differentiated and EC9706 was highly differentiated. EC109 and EC9706 were treated with EE and aspirin for different time course. The cell growth of ESCC was measured by MTT reduction assay and the expression of COX-2 was measured by RT-PCR and Western blot analysis.
Results  EE promoted the proliferation of EC109 and EC9706 in dose- and time-dependent manners. In the concentration range (10−100 µg/ml for EE) and in the time range (24−72 hours) after addition of EE, the cell proliferation was prominent in an up-scaled manner respectively. Aspirin could inhibit the proliferation of cell lines EC109 and EC9706, pretreated with EE for 5 hours, in a dose-dependent manner. In the concentration range (0.5−8.0 mmol/L for aspirin), the cell growth inhibition was prominent in an up-scaled manner accordingly (P<0.05). The effect of EE on cell proliferation was correlated with the up-regulation of COX-2 gene. However, the cell growth inhibition of aspirin was correlated with the down-regulation of COX-2 gene.
Conclusions  EE can stimulate the proliferation of human ESCC cell lines EC109 and EC9706, most likely through up-regulating the expression of COX-2. Aspirin can inhibit the proliferation of ESCC cell lines induced by EE, which suggests it may be advantageous in the chemoprevention and therapy of human tobacco-related ESCC. And its effect is likely to be related with modulating COX-2 activity.

     

青藤碱调节EC109细胞增殖与凋亡的COX-2信号通路研究

目的研究青藤碱对食管癌EC109细胞增殖和凋亡的影响及其潜在机制。方法以不同浓度青藤碱分别处理体外培养的食管癌EC109细胞,72h后用CCK8法检测细胞增殖,用AnnexinV/PI双染与流式细胞术检测细胞凋亡,用Westernblot检测COX-2和Survivin蛋白的表达。结果采用0.2、0.4mmol/L青藤碱处理EC109细胞72h后,细胞增殖显著被抑制;细胞凋亡检测结果显示,与对照组相比,中、高剂量组细胞凋亡率显著升高;Westernblot检测结果显示COX-2和Survivin蛋白在中、高剂量组中表达水平显著下降。结论青藤碱在体外能抑制EC109细胞增殖并促进凋亡,其机制可能与抑制COX-2和Survivin蛋白表达相关。     

环氧合酶-2启动子甲基化在食管鳞癌中的作用

目的明确在低表达环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的食管鳞癌细胞中COX-2表达与其启动子甲基化状态之间的关系。探讨对于低表达环氧合酶2的食管鳞癌给予去甲基化联合COX-2选择性抑制剂治疗的意义。方法选择低表达COX-2的食管鳞癌TE-1细胞,RT-PCR法检测mRNA表达,DNA测序的方法检测COX-2启动子的甲基化状态。用5-氮杂脱氧胞苷和尼美舒利干预细胞株,比较干预前后细胞的COX-2启动子甲基化状态的变化及COX-2mRNA表达。用MTT法检测不同干预因素对细胞增生抑制作用的差异。ELISA检测前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)浓度。结果食管鳞癌TE-1细胞的COX-2核酸呈低表达,而其启动子呈高甲基化状态,甲基化率为58.3%。用去甲基化制剂5-氮杂脱氧胞苷干预后,该细胞的COX-2启动子甲基化率降低为30%,同时核酸表达增加,差异有统计学意义。单独用尼美舒利干预细胞的抑制率为16.2%,而联合5-氮杂脱氧胞苷和COX-2选择性抑制剂尼美舒利干预后细胞的增生抑制明显,抑制率升高为48.63%,差异具有统计学意义。去甲基化干预后PGE2浓度从553.96pg/mL升高到647.54pg/mL。结论对于低表达环氧合酶2的食管鳞癌细胞其启动子高甲基化可能是影响其核酸表达的原因,给予去甲基化干预可使环氧合酶2的核酸表达增加,再联合环氧合酶2选择性抑制剂能够抑制食管鳞癌细胞的增生,是一种可能的治疗选择。     

阿司匹林对卵巢癌细胞生长的影响

目的 :探讨阿司匹林 (ASP)对卵巢癌细胞生长的影响及其相关机制。方法 :采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT法 )检测ASP对CaOV 3细胞生长的抑制作用 ;用流式细胞术分析ASP对细胞凋亡和细胞周期的影响 ;采用细胞免疫化学的方法检测阿司匹林作用前后细胞环氧合酶 2 (COX 2 )、Ki 6 7表达的变化。结果 :ASP对CaOV 3细胞株的生长抑制作用呈量效和时效依赖关系。可诱导细胞凋亡和G0 G1期阻滞 ;细胞免疫组化结果表明随着ASP浓度的增加Ki 6 7表达下降 ,COX 2在高浓度ASP(5mmol·L-1)作用 72h后表达下降 ,在 1mmol·L-1和 3mmol·L-1作用 72h后表达无明显变化。结论 :阿司匹林通过诱导凋亡和细胞周期阻滞来抑制人卵巢癌细胞的生长 ,这种抑制作用具有时效性和量效性。阿司匹林有可能成为卵巢癌防治的有效药物。     

CAPN4与食管鳞形细胞癌增殖和迁移关系的体外研究

 目的 探讨钙蛋白酶小亚基1(calpain small subunit 1,CAPN4)在食管鳞形细胞癌细胞系中的表达水平,分析其与食管鳞形细胞癌细胞增殖和迁移能力的相关性。 方法 挑选人正常食管上皮细胞系HEEC及食管鳞形细胞癌细胞系EC109与KYSE510,应用Western blot检测细胞系中CAPN4蛋白质水平,应用RNA干扰下调EC109与KYSE510中CAPN4的表达水平,通过CCK-8与Transwell实验分别检测细胞增殖与迁移能力的变化。同时用Western blot检测细胞系中增殖和迁移相关蛋白质水平。结果 CAPN4在EC109与KYSE510中的蛋白质水平显著高于HEEC,下调EC109与KYSE510中CAPN4蛋白质水平后,细胞增殖与迁移能力均显著降低(P<0.05),MMP-2蛋白质水平下调。 结论 CAPN4在食管鳞形细胞癌中高表达,促进食管癌增殖和迁移,并与下游分子MMP-2的表达水平密切相关。