HSP65-MUC1 VNTR2融合蛋白的表达、纯化及其抗肿瘤作用

目的：通过基因工程手段在大肠杆菌中表达HSP65-MUC1 VNTR：融合蛋白、鉴定和纯化，并研究其在动物体内的肿瘤生长抑制活性。方法：通过PCR获得结核分支杆菌HSP65基因，以重叠PCR获得人MUC1基因VNTR的2个重复序列，构建原核重组表达载体HSP65-MUC1 VNTR2-pET28a（＋）。在大肠杆菌BL21（DE3）中利用IPTG诱导表达；利用单克隆抗体（mAb）进行Western blot鉴定，以Q柱和凝胶过滤纯化获得纯化蛋白。通过建立转染人MUC1基因的B16黑色素瘤小鼠肿瘤模型，在C57BL／6小鼠体内研究HSP65-MUC1 VNTR，融合蛋白的肿瘤生长抑制活性。结果：获得的结核分支杆菌HSP65基因和人MUC1基因VNTR区的2个重复片段，经测序证明分别与GenBank中结核杆菌HSP65基因和人MUC1基因的VNTR完全相符；构建的原核表达载体HSP65-MUC1 VNTR2-pET28a（＋）可稳定的可溶性表达HSP65-MUC1VNTR2蛋白；经Q柱和凝胶过滤纯化，纯化的目的蛋白纯度达95％以上；利用鼠抗人MUC1mAb对表达蛋白进行验证，结果阳性；小鼠肿瘤预防免疫实验表明，实验组小鼠抑瘤率大于对照组，且具有明显性差异。结论：成功地利用原核表达系统实现了对HSP65-MUC1 VNTR2蛋白的可溶性表达，并对其体内预防实验进行了初步研究，证明该融合蛋白能明显抑制表达MUC1的肿瘤生长。为进一步评价其作为肿瘤疫苗可能性的研究打下了基础。     

HSP65-PSA融合蛋白的体内外抗肿瘤活性研究

目的:研究热休克蛋白65(HSP65)-前列腺特异性抗原融合蛋白在体外对人树突状细胞的活化作用以及在小鼠体内抑制PSA阳性肿瘤细胞生长的作用.方法:利用Westernblot方法对融合蛋白HSP65-PSA的特异性进行鉴定;利用共聚焦显微镜、流式细胞术(FCM)检测和斑点杂交的方法对PcDNA3-GFP-PSA稳定转染的B16细胞进行鉴定;用HSP65-PSA融合蛋白刺激来自于人外周血的未成熟树突状细胞,观察融合蛋白对树突状细胞的体外活化作用;用PcDNA3-GFP-PSA稳定转染的B16细胞种植C57BL/6小鼠,继而用HSP65-PSA融合蛋白来免疫小鼠以观察融合蛋白对PSA阳性B16肿瘤细胞生长的体内抑制作用.结果:Western blot检测显示融合蛋白HSP65-PSA具有PSA蛋白特异性.共聚焦显微镜、FCM检测和斑点杂交结果均显示PcDNA3-GFP-PSA转染的B16细胞转染情况良好.体外细胞实验显示,将HSP65-PSA融合蛋白作用于人外周血树突状细胞后可以明显促进树突状细胞表面分子CD86的表达,其上调率为52.93%.动物体内实验显示,HSP65-PSA融合蛋白可以明显抑制PSA阳性B16肿瘤细胞在小鼠体内的生长.10 μg蛋白免疫组的肿瘤体积(4.91±5.21)与对照组(10.56±6.10)相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:HSP65-PSA融合蛋白可以在体外活化树突状细胞,在小鼠体内抑制PSA阳性B16肿瘤细胞的生长.HSP65-PSA融合蛋白可能具有应用于PSA阳性肿瘤的免疫治疗作用.     

C型CpG单链寡核苷酸对肿瘤疫苗抑瘤效果的增强作用

目的：研究C型CpG单链寡脱氧核苷酸（CpG ODN）对肿瘤疫苗抑瘤效果的增强作用.方法：利用体外淋巴细胞增生实验和病毒保护实验确定新C型CpG ODN, 采用小鼠体内抑瘤实验观察CpG ODN对肿瘤疫苗HSP65-MUC1重组蛋白抑制MUC1阳性肿瘤生长的增强作用, 并对小鼠血清中抗HSP65-MUC1抗体的类型进行了初步鉴定.结果：自行设计的CpG ODN BW005能刺激人PBMC和小鼠脾细胞增生,其刺激后的培养上清具有保护Vero E6细胞免受VSV感染的作用, 属于新型C型CpG ODN.将BW005与HSP65-MUC1联合应用于C57BL/6小鼠后, MUC1阳性肿瘤的发生明显延缓（平均44.8 d）, 其终末肿瘤发生率最低（33.33%）;荷瘤小鼠的生存期明显延长（平均49.5 d）, 其终末生存率最高（66.67%）.小鼠血清中抗HSP65和抗MUC1的IgG2a抗体水平增加.结论：C型CpG ODN可以增强肿瘤疫苗HSP65-MUC1的抑瘤效果, 考虑与小鼠体内Th1环境的形成有关.     

人乳腺癌疫苗HSP65-HER2联用CpG684的抗肿瘤作用

目的:检测人乳腺癌融合蛋白疫苗HSP65-HER2联用CpG684的抗肿瘤效果。方法:C57BL/6小鼠分别皮下注射PBS,CpG684,HSP65-HER2和CpG684混合物,一周一次,共三次,随后给小鼠腹腔接种7.5×104个转染了pcDNA3-GFP-HER2质粒的B16肿瘤细胞(HER2+B16),监测各组小鼠的生存期至接种肿瘤后70天。结果:免疫了HSP65-HER2和CpG684的小鼠在接种肿瘤后70天时,仍有80%存活,而GpG684组的小鼠仅有10%存活,PBS组小鼠在接种肿瘤后36天后全部死亡。与PBS和CpG684对照组相比,免疫了HSP65-HER2和CpG684的小鼠的生存期显著延长(P<0.01)。结论:HSP65-HER2联用CpG684在体内发挥了强大的抗肿瘤活性,为进一步的临床研究和应用奠定了基础。     

OAZI-1 蛋白复合物在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤效应的研究

目的:在实验动物的水平上分析来源于肿瘤细胞的鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(Ornithine decarboxylaseantizyme inhibitor-1,OAZI-1) 蛋白复合物能否在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤效应。方法:用包被有OAZI-1 抗体的免疫磁珠从B16-F1 小鼠黑色素瘤细胞中分离OAZI-1 蛋白复合物,用此复合物免疫小鼠后, 再在小鼠皮下接种B16-F1 活细胞,然后观察接种瘤在小鼠体内的成瘤及生长状况。ELISA 法用于检测免疫小鼠血清中IFN-γ含量。乳酸脱氢酶释放实验(LDH)检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞对B16-F1 细胞的杀伤效应。上述动物实验用原核表达纯化的OAZI-1 蛋白和PBS 免疫的小鼠作为对照。结果:与对照小鼠相比,接种OAZI-1 蛋白复合物的小鼠脾淋巴细胞(效应细胞)对B16-F1 黑素瘤细胞(靶细胞)具有更强的杀伤能力。在三种不同的效：靶比下(10 ：1、50 ：1、100 ：1),该组小鼠脾淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性分别为46.2%、59.5% 和92.5%,显著性高于接种纯化OAZI-1 蛋白组(36.1%、26.8% 和45.9%)和接种PBS 组(24.6%、24.0% 和27.2%)小鼠脾淋巴细胞。此外,接种OAZI-1 蛋白复合物的小鼠血清中抗肿瘤细胞因子IFN-γ含量(538.3 pg/ ml)也显著性高于接种纯化OAZI-1 蛋白组(256.2 pg/ ml)和接种PBS 组(131.0 pg/ ml)小鼠。上述方法免疫的小鼠在皮下再接种B16-F1 活细胞后,免疫OAZI-1 蛋白复合物组小鼠成瘤率为40%,而PBS 组和纯化OAZI-1 蛋白组小鼠成瘤率为100%,且接种瘤在OAZI-1 蛋白复合物免疫小鼠体内生长更为缓慢。结论:从B16-F1 肿瘤细胞中分离的OAZI-1 蛋白复合物中可能含有肿瘤抗原,用此复合物接种小鼠能在实验动物体内诱导抗肿瘤免疫杀伤活性。     

MUC1基因疫苗对膀胱肿瘤抑制的免疫学实验研究

目的：研究人粘蛋白MUC1基因DNA疫苗诱导小鼠细胞毒性T细胞（CTL）及体液免疫应答的作用，为膀胱癌的疫苗治疗提供实验资料。方法：接种pcDNA3．1（＋）-MUC1质粒，通过ELISA法检测小鼠血清MUC1抗体生成和脾细胞产生IL-2和1FN-7的量，通过LDH释放法测定CTL对BIU-87细胞的杀伤活性。结果：接种pcDNA3．1（＋）-MUC1疫苗后，小鼠血清中抗MUC1抗体水平明显升高，与对照组相比有显著性差异（P〈0．01）。脾细胞产生的IL-2和IFN-7水平较对照组高（P〈0．01）。在效靶比为100：1、50：1、25：1、12．5：1时，MUC1基因疫苗免疫组小鼠CTL对BIU-87杀伤率（分别为58．4％、47．2％、35．7％、27．4％），较空载体pcDNA3．1（＋）组小鼠和灭菌生理盐水组小鼠（分别为11％、19．2％、9．5％、14％和16．5％、11．9％、8．6％、10．3％）均明显升高，且有显著性差异（P〈0．01）。结论：MUC1基因DNA疫苗能够诱导小鼠产生抗MUC1特异性抗体，诱导产生杀伤表达MUC1细胞的CTL，为MUC1基因疫苗用于膀胱肿瘤生物治疗提供了一定的实验依据。     

整合PD-L1 单链抗体的融合蛋白制备及其抗肿瘤活性的验证

目的:利用酵母表面递呈技术,分泌表达抗PD-L1单链抗体(sc Fv),纯化后得到能特异性结合PD-L1抗原的小分子抗体片段(sc Fv)。根据单链抗体基因序列,合成sc Fv抗体基因序列。选用sc Fv-mFc融合蛋白的方式,并采用p Fuse真核表达载体来表达此sc Fv-mFc融合蛋白,研究其对肺腺癌细胞(A549)的亲和力和体内外抑制作用。方法:采用基因工程的方法构建重组质粒p Fuse-scFv,通过真核转染至293F(人胚肾细胞),使用无血清Pro 293a-CDM培养72 h,收集培养液中分泌的融合蛋白,运用免疫组化检测sc Fv-mFc融合蛋白与肿瘤细胞的结合;流式细胞术分析融合蛋白和肿瘤细胞的亲和力; ADCC(抗体介导的细胞毒实验)测定融合蛋白对肿瘤细胞体外杀伤作用;利用接种肺腺癌细胞的荷瘤小鼠对融合蛋白的体内抗肿瘤效应进行研究。结果:通过重组质粒转染至293F细胞的方法,sc Fv-mFc融合蛋白被分泌到无血清的培养液中;免疫组化和流式结果显示,融合蛋白与表面高表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞有较强的结合能力; ADCC实验结果示融合蛋白在体外对肿瘤细胞的杀伤作用;荷瘤小鼠实验结果示融合蛋白对肿瘤的生长起到抑制作用,在5 mg/kg的药物剂量下,荷瘤小鼠瘤体体积平均增长率从14. 90%降低至3. 72%,两独立样本t检验P0. 05,差异具有统计学意义。结论:成功制备了含单链抗体的融合蛋白,其对A549细胞具有良好的结合能力,在体内外均对肿瘤细胞的增殖产生抑制作用,为研制靶向抗肿瘤药物提供实验室基础依据。     

含人Fc重组凋亡融合蛋白体内外抗肿瘤活性初步研究

目的初步研究含人抗体Fc片段的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL-Fc）重组融合蛋白的体内外抗肿瘤活性。方法①体外实验：将人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞、人结肠癌LOVO细胞、人胃癌MKN45细胞、人表皮癌A431细胞、人肝癌HEPG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和小鼠肝癌H22细胞均随机分为TRAIL-Fc重组融合蛋白组、对照组和空白对照组,分别加入浓度为1000、250、62.5、15.6、3.9、0.97ng/ml的TRAIL-Fc重组融合蛋白和TRAIL对照品以及完全培养液,采用MTT法检测TRAIL-Fc重组融合蛋白对7种肿瘤细胞株的体外生长抑制率。②体内实验：腹腔和腋下接种H22细胞建立小鼠肝癌模型,据治疗药物的不同将小鼠随机分为空白对照组、5-Fu组和TRAIL-Fc重组融合蛋白组。测量记录腹腔接种小鼠的腹围和体重以及腋下接种小鼠的肿瘤体积,15d后取外周血处死各组小鼠,计算抑瘤率并检测血清中AST、ALT含量。结果体外实验结果显示,TRAIL-Fc重组融合蛋白对7种肿瘤细胞株的生长均有不同程度的抑制作用,且抑制作用呈剂量依赖效应;其中对MCF-7细胞的抑制作用最强,其最大生长抑制率为82.5%,其次依次为LOVO（81.9%）、MKN45（52.3%）、H22（51.2%）、Jurkat（50.9%）、HEPG2（35.4%）和A431细胞（20.3%）。与对照品相比,TRAIL-Fc重组融合蛋白对LOVO（IC50为83.5）、MKN45（IC50为243.2）、MCF-7（IC50为84.6）细胞更敏感。体内实验结果显示,空白对照组小鼠腹部明显膨出,后期体重略有下降,肿瘤体积持续显著增加;TRAIL-Fc重组融合蛋白组小鼠腹部轻微膨胀,体重维持较好,肿瘤体积后期略有增加;5-Fu组小鼠腹部无膨胀,体重急剧下降,肿瘤体积明显缩小。TRAIL-Fc重组融合蛋白的抑瘤率为45.79%,AST和ALT检测结果显示其对小鼠肝功能无明显影响。结论 TRAIL-Fc重组融合蛋白具有较强的抑制肿瘤细胞生长的能力,且在体内半衰期明显延长。     

HPV16E7E6抗原表位嵌合体DNA抗肿瘤疫苗的研究

目的:探讨HPV16 E7、E6抗原表位与HSP70 N端重组DNA疫苗抗肿瘤活性.方法:以重叠PCR将HPV16 E7基因N端60个氨基酸的编码序列与E6基因的10个(48～57)氨基酸的编码序列及HSP70 N端序列进行融合.以pcDNA3.0为载体,构建真核表达载体pcD-E76HSP.重组质粒免疫C57BL/6小鼠后,通过淋巴细胞增殖实验和细胞毒性杀伤实验研究该疫苗激发的细胞免疫反应及反应强度;观察该疫苗对C57BL/6小鼠TC-1肿瘤细胞移植瘤的治疗效果.结果:重组DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠后,小鼠脾淋巴细胞体外增殖明显,并可诱导产生针对TC-1肿瘤细胞的特异性CTL反应;体内抑瘤试验显示该疫苗对HPV16病毒转化的TC-1细胞小鼠移植瘤的生长有抑制作用.结论:该疫苗能激发特异性细胞免疫反应,显著抑制HPV16转化的TC-1肿瘤细胞生长.     

沙门菌Ⅲ型分泌蛋白融合HBx抗原介导的T细胞免疫效果观察

目的检测沙门菌减毒株作为载体，Ⅲ型分泌系统（typemsecretionsystem，TrSS）效应蛋白．肿瘤抗原融合蛋白激发机体产生T细胞免疫反应的能力。方法重组原核表达质粒，表达Ⅲ型分泌蛋白SspH2和肿瘤抗原HBx融合分子，转化鼠伤寒沙门菌减毒株SL3261，口饲免疫小鼠。通过检测免疫小鼠脾细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放确定疫苗激发CTL作用；利用ELISPOT方法检测免疫小鼠脾淋巴细胞释放IFN-γ能力；腋下接种稳定表达HBx的B16细胞，观察免疫小鼠肿瘤的体积及重量，检测该疫苗的免疫保护效果。结果通过LDH释放试验发现，经细菌体内表达及投递SspH2．HBx融合蛋白诱发后，小鼠脾淋巴细胞具有特异的CTL反应活性；ELISPOT结果显示细菌表达、投递SspH2-HBx蛋白具有特异诱发淋巴细胞分泌IFN-γ活性；肿瘤接种试验进一步证实这种基于11筠的肿瘤疫苗可以特异抑制肿瘤的生长。结论以沙门菌减毒株作为载体、Ⅲ型分泌蛋白SspH2作为底物融合肿瘤抗原HBx能够激发显著的T细胞免疫反应、产生一定的免疫保护作用；这种基于沙门菌TTSS的疫苗具有一定的开发、应用前景。     

卡介苗作为抗肿瘤重组蛋白疫苗佐剂的研究

目的：探讨卡介苗（BCG）能否增强抗肿瘤疫苗HSP-MUC1的特异性抑瘤作用，从而将BCG开发为肿瘤疫苗的新型佐剂。方法：动物水平上，BCG和HSP-MUC1共免疫小鼠，观察BCG能否增强HSP-MUC1所激发的特异性抑瘤作用。细胞水平上对BCG发挥佐剂作用的机制进行探讨，将BCG和HSP-MUC1共刺激树突状细胞（DC），观察BCG能否协同HSP-MUC1刺激DC表面的CD86分子表达的上调；并对DC培养上清中IL-6、TNF-α的水平进行测定。结果：BCG＋HSP-MUC1组小鼠的肿瘤重量显著地低于HSP-MUC1组（P〈0.05）。细胞学试验显示，BCG能够显著增强HSP-MUC1对DC的激活作用，使DC表面的CD86分子显著上调。BCG＋HSP-MUC1组的DC培养上清中细胞因子IL-6、TNF-α的水平显著地高于HSP-MUC1组（P〈0.05）。结论：BCG能够显著地增强HSP-MUC1的抗肿瘤活性，具有肿瘤疫苗佐剂的良好功效。     

Vaccination of mice with MUC1 cDNA suppresses the development of lung metastases

C57BL/6 mice were immunized intradermally with various doses of purified pCEP4 plasmid DNA containing full-length MUC1 cDNA (22 tandem repeats). Mice immunized with MUC1 DNA three times at weekly intervals had serum antibodies to a synthetic peptide corresponding to the tandem repeats of MUC1. The antibody titer correlated with the plasmid DNA dose. After the third immunization mice were injected intravenously with 5×10⁵ B16-F10 melanoma cells that had been stably transfected with MUC1 cDNA (F10-MUC1-C8 clone cells). The number of lung metastatic nodules three weeks after inoculation of F10-MUC1-C8 cells was significantly lower in mice immunized with MUC1 plasmid DNA than in mice immunized with the vector DNA alone. Thus, the suppression of lung metastasis was antigen-specific. In vivo depletion of lymphocyte subpopulations by specific antibodies revealed that natural killer cells are the major effector cells responsible for the suppression of lung metastasis. CD4⁺ cells and CD8⁺ cells apparently played some roles too. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

MUC1基因疫苗诱导小鼠特异性CTL和体液免疫应答

目的 :观察MUC1基因疫苗诱导小鼠特异性杀伤性T细胞及体液免疫应答的作用。方法 :采用股四头肌肌肉注射 ,将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1 MUC1免疫雌性BALB/c小鼠 ,每次间隔 3wk ,共 3次。最后 1次免疫后第 3周 ,接种表达MUC1的EMT6乳腺癌细胞进行免疫保护实验。用 4h51Cr释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL杀伤活性 ;免疫组化染色法检测小鼠血清特异性抗体的水平。结果 :在效靶比为 10 0∶1、5 0∶1、2 5∶1、12 .5∶1时 ,MUC1基因疫苗免疫组特异性CTL对EMT6靶细胞杀伤活性分别为 5 4 .1%、39.8%、2 6 .4 %和2 0 .1% ,对照组分别为 13.2 %、10 .0 %、8.2 %、7.2 %和 11.7%、9.8%、7.7%、7.0 % ,前者与后二者差异显著 (P <0 .0 1)。免疫组化染色检测显示 ,人乳腺癌组织MUC1呈染色阳性 ;MUC1基因疫苗免疫组仅见 4 0 % (4/ 10 )的小鼠有肿瘤形成 ,而 pcDNA3.1对照组和生理盐水阴性对照组 10 0 %可见肿瘤形成、生长 ,表明MUC1基因疫苗免疫组小鼠具有一定的免疫保护作用。结论 :MUC1基因疫苗可诱导小鼠产生特异性CTL及体液免疫应答 ,对小鼠体内荷瘤可能具有一定的预防作用     

A Th2 immune shift to heat shock protein 65 fails to arrest atherosclerosis: Proatherogenic role of Th2-deviated autoantibodies

Many reports regarding the cytotoxicity of antibodies to heat shock protein (HSP) 65/60 have implied the potential disadvantage and risk of HSP65/60-specific Th2 shifting strategy in arresting atherosclerosis. In this study, experiments were specifically designed to investigate the effect of a HSP65-specifc Th1 to Th2 immune shift accompanied with high-titer antibodies on atherosclerosis and explore the proatherogenic cytotoxicity of Th2-deviated anti-HSP65 antibodies to endothelial cells. Rabbits were nasally immunized with a fusion protein HSP65-6 × P277 10 times every other day. Immunologic results, including the repressed T-cell proliferation, increased interleukin-10 production and IgG1-predominated isotype of antibodies, revealed a significant Th1 to Th2 shift of response to HSP65. However, rabbits showed no reduction in atherosclerotic lesions. As a control, HSP65 immunization, which induced no antibodies, obviously attenuated atherosclerosis. Further studies on endothelial cells showed that the Th2-deviated anti-HSP65 antibodies could cross-react with HSP60 highly expressed in stressed cells and mediate damage to cells in the presence of complement. In conclusion, the Th2-deviated antibodies to HSP65 that were induced by over-regulated Th2 shift are cytotoxic to endothelial cells. This proatherogenic effect, in contradiction to the positive impact of Th1 suppression, can eventually invalidate the efficacy of Th2 shift in arresting atherosclerosis.     

GM-CSF对MUC1基因疫苗抑制乳腺癌生长的增强作用

目的 :观察GM CSF有无增强MUC1基因疫苗对EMT6乳腺癌生长的特异性抑制作用。方法 :采用股四头肌肌肉注射法 ,将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1 MUC1免疫雌性BALB/c小鼠 ,每 3wk 1次 ,共 3次。每次基因免疫后 1、3、5d ,皮下注射GM CSF 10 0 μL(1μg/ 10 0 μL)。最后 1次基因免疫后第 3周 ,接种表达MUC1的EMT6小鼠乳腺癌细胞。两周后观察、记录肿瘤的生长情况。于肿瘤细胞接种后第 4 3天 ,处死全部动物 ,称量肿瘤的质量。用 4h51Cr释放法检测小鼠脾特异性CTL的杀伤活性。结果 :接种肿瘤细胞后 4 3d ,MUC1基因疫苗加GM CSF组、MUC1基因疫苗组、pcDNA3.1加GM CSF组及pcDNA3.1组 ,EMT6肿瘤的大小依次为 (135± 33.8)mm3 、(2 5 0± 34.3)mm3 、(5 6 8± 4 3.6 )mm3 和 (5 96± 4 8.2 )mm3 ;平均瘤质量 (g)依次为 (0 .81± 0 .4 2 )g、(1.2 3± 0 .4 1)g、(2 .30± 0 .4 8)g及 (2 .2 8± 0 .5 8)g。与对照组相比较 ,MUC1基因疫苗组EMT6肿瘤的生长受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ;与单独MUC1基因疫苗组相比较 ,MUC1基因疫苗加GM CSF组抗肿瘤生长的作用有显著差异 (P <0 .0 5 )。在效靶比为 10 0∶1、5 0∶1、2 5∶1和 12 .5∶1时 ,MUC1基因疫苗加GM CSF组特异性CTL对EMT6靶细胞的杀伤率 ,依次为 6 8.5 %、 5 3.4 %     

通过体内传代和流式分选建立稳定转染MUC1 VNTR的B16细胞株

目的 获得具有较好致瘤性、在动物体内保留表达外源基因MUC1 VNT R(mucin 1,variable number tandem repeats)能力的稳定转染细胞株B16-GFP-MUC1,供MUC1靶向药物研究中体内抑瘤实验所用到的肿瘤模型.方法 用脂质体转染的方法和有限稀释法获得单克隆细胞株;将该细胞株进行体内传代后,流式分选GFP阳性细胞群,并对分选后细胞用有限稀释法进行单克隆化.用流式细胞仪和共聚焦荧光显微镜观察各时期细胞克隆的GFP表达情况 .结果 脂质体转染方法得到的在G418压力选择下存在的细胞B16-1,其G FP阳性细胞比率最高为80%左右;致瘤性较差,75 d内仅87.5%小鼠出瘤;体外的稳定性观察中,在无抗生素的培养液中观察5周,其阳性率降至20%左右;经过体内接种后仅有10%左右的肿瘤细胞保留了外源基因的表达.而经过体内传代和流式分选后得到的单克隆细胞群B16-39,其GFP阳性细胞比率＞90%;致瘤性为20 d内100%小鼠出瘤;体外培养8周,GFP阳性的细胞比率＞90%; 体内剥离后的肿瘤细胞的GFP阳性细胞比率均＞90%.结论 对于用于体内动物模型的稳定转染细胞,通过体内传代,流式分选并单克隆化,是获得致瘤性好,体内体外较为稳定的稳定转染细胞株的一个可行方案.     

Immunization with a vaccine that combines the expression of MUC1 and B7 co-stimulatory molecules prolongs the survival of mice and delays the appearance of mouse mammary tumors

Human epithelial mucin (MUC1) is expressed by many carcinomas, including breast cancer cells. This breast cancer-associated antigen has been widely used for immunotherapy, despite the fact that cellular immune responses to MUC1 are impaired in breast cancer patients and MUC1 transgenic animals. Previously, we found that immunogenicity to MUC1 was also impaired in BALB/c mice injected with a mammary tumor cell line (410.4) expressing human MUC1. We suggested that one reason for its weak immunogenicity was the lack of expression of B7 molecules by 410.4 cells. Recognition of antigenic epitopes in conjunction with MHCI/II by the T-cell receptor without co-stimulation by B7/CD28 association resulted in T-cell anergy. Therefore, we attempted to enhance protective anti-MUC1-specific immunity in mice using B7 co-stimulatory molecules as a component of the MUC1 vaccine. We also compared cell-based with DNA-based vaccination strategies. One group of mice was vaccinated with an irradiated, 410.4 syngeneic mammary tumor cell line co-expressing human MUC1 and CD80 or CD86 co-stimulatory molecules, and a second group of mice was vaccinated with plasmids encoding MUC1 and CD80 or CD86. These mice along with appropriate controls were challenged with mammary tumor cell line 4T1, which expresses MUC1. There were significant inhibition on rates of tumor growth and survival in mice vaccinated with irradiated 410.4/MUC1 cells co-expressing either CD80 or CD86 molecules, compared to non-vaccinated animals. In addition, there were also significant delays in the appearance of measurable tumors and their growth in mice vaccinated by gene-gun immunization with plasmids encoding MUC1 and CD80 or CD86. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

MUC1-specific anti-tumor responses: molecular requirements for CD4-mediated responses

MUC1 was first defined as a tumor antigen in the late 1980s, yet little is known about the types of immune responses that mediate rejection of MUC1(+) tumors in vivo. MUC1-specific antibodies, T(h) cells and cytotoxic T cells can be detected in patients with different adenocarcinomas, yet these tumors usually progress. Thus, there is a need to better understand the in vivo mechanisms of antigen-specific tumor rejection. To characterize the nature of MUC1-specific immune responses in vivo, rejection of a MUC1-expressing melanoma tumor line (B16.MUC1) was evaluated in mice lacking specific T cell subsets, cytokines, co-stimulatory molecules or molecular effectors of cytolytic pathways. Results demonstrated that rejection of the B16.MUC1 tumor cell line was primarily mediated by CD4(+) T cells, and required Fas ligand, lymphotoxin-alpha, CD40, CD40 ligand and CD28, but not perforin, gammadelta T cells, IL-4, IL-10, IL-12 or tumor necrosis factor receptor-1. Depletion of NK cells demonstrated that NK cells might also contribute to MUC1 immunity in the B16.MUC1 tumor model. These results demonstrated that the immune response generated against MUC1 does not fit the type 1 or 2 model described for many immune responses. Additionally, multiple cytolytic mechanisms are required for B16.MUC1 rejection.