吡格列酮对脂多糖引起大鼠大脑皮质神经元损伤的抑制作用

目的探讨吡格列酮对脂多糖(LPS)引起的神经元损伤的抑制作用,并探讨其信号传导机制。方法取培养7d的大鼠大脑皮质神经元细胞,除正常对照组外,其余各组先给予相应的处理30min～1h后,再加LPS10mg.L-1处理4～24h。MTT法测定细胞存活率;Hoechst33258核染色观察细胞凋亡的形态学改变;免疫荧光染色法测定磷酸化c-Jun氨基端激酶1(JNK1)细胞内定位;Western蛋白印迹法检测活性胱天蛋白酶3(caspase3)蛋白表达和磷酸化JNK1水平;Griess法测定细胞培养上清液中一氧化氮(NO)含量。结果与对照组相比,LPS可使体外培养神经元细胞存活率明显下降,(100.0±10.9)%vs(72.3±2.1)%;凋亡细胞百分率明显增加,(11.5±4.2)%vs(39.5±8.2)%;活性caspase3蛋白表达和磷酸化JNK1水平增加;细胞培养上清液中NO含量明显增加。吡格列酮0.01,0.1和1μmo.lL-1可明显对抗LPS引起的培养神经元细胞存活率下降,并呈一定浓度依赖性。吡格列酮0.1和1μmol.L-1也可明显对抗LPS引起的培养神经元凋亡细胞百分率、活性caspase3蛋白表达、磷酸化JNK1水平和NO含量增加。LPS+吡格列酮(1μmo.lL-1)组,细胞存活率为(97.8±9.7)%,凋亡细胞百分率为(20.6±5.0)%,NO含量为(6.8±1.3)μmol.L-1。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的特异性阻断剂GW9662不能去除吡格列酮对LPS引起的神经元细胞损伤的抑制作用,在LPS+吡格列酮(1μmol.L-1)+GW9662(10μmo.lL-1)组,细胞存活率为(90.7±6.9)%,凋亡细胞百分率为(23.4±4.1)%,NO含量为(5.8±0.7)μmol.L-1。GW966210μmol.L-1对LPS引起的细胞存活率降低没有影响。与LPS组相比,JNK特异性阻断剂SP6001255μmol.L-1可明显对抗LPS引起的神经元损伤,细胞存活率明显增加,(72.3±2.1)%vs(109.8±11.8)%;凋亡细胞百分率降低,(39.5±8.2)%vs(19.1±4.8)%;NO含量降低,(21.1±5.0)μmol.L-1vs(4.0±1.3)μmol.L-1。结论吡格列酮能明显抑制LPS引起的皮质神经元损伤,这种作用可能与抑制JNK信号传导通路有关,与PPARγ激活无关。     

金纳米粒子对CHO-K1细胞毒性的谷胱甘肽作用机制

目的探讨金纳米粒子(AuNP)对卵巢细胞CHO-K1的毒性作用及谷胱甘肽(GSH)的对抗作用。方法 AuNP 10～100μmol.L-1作用卵巢细胞CHO-K1 72 h,MTT比色法检测细胞存活。AuNP10μmo.lL-1,丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)20μmo.lL-1及GSH 1 mmo.l L-1单独或联合作用细胞72 h,MTT比色法检测细胞增殖,倒置相差显微镜观察细胞形态,AnnexinⅤ-FITC和PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡;AuNP 10μmo.l L-1,BSO 20μmo.l L-1及GSH 1 mmo.l L-1单独或联合作用细胞48 h,共聚焦显微镜检测细胞骨架微丝,JC-1染色流式细胞仪检测线粒体膜电位。结果 AuNP 10～100μmo.lL-1对正常的CHO-K1细胞存活无明显影响。与正常对照组相比,AuNP 10μmol.L-1和BSO 20μmol.L-1联合作用,可明显抑制CHO-K1细胞存活,抑制率为(80±2)%(P<0.01),胞体皱缩、变圆,细胞骨架微丝破坏;凋亡率为(66±6)%(P<0.01);细胞线粒体膜电位显著增加(P<0.01);加入外源性的GSH可逆转AuNP对因细胞GSH水平受抑而产生的细胞毒性。结论 AuNP对CHO-K1细胞损伤可能与GSH水平降低有关。     

槲皮素对多柔比星致乳大鼠心肌细胞抗氧化酶活性及Fas/FasL表达变化的影响

目的探讨槲皮素对多柔比星致乳大鼠心肌细胞损伤的保护作用及机制。方法原代培养乳大鼠心肌细胞,随机分为正常对照组、多柔比星1.72μmol·L-1损伤组和多柔比星+槲皮素25,50及100μmol·L-1组。槲皮素与心肌细胞培养3h后,加入多柔比星继续培养24h,正常对照组仅加等量DMEM培养液。倒置显微镜下观察细胞生长状态,比色法检测培养液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,用RT-PCR和Western印迹法检测Fas和FasL的mRNA和蛋白的表达。结果与正常对照组相比,多柔比星损伤组心肌细胞生长状态差,GSH-Px和SOD的活性降低,Fas和FasL的mRNA和蛋白的表达均升高。槲皮素25,50及100μmo·lL-1均可拮抗多柔比星所致的上述变化:GSH-Px分别为(76±3),(73±4),(71±3)vs(69±3)kU·L-1;SOD活性分别为(31±2),(29±2),(29±2)vs(26±2)kU.L-1;Fas mRNA:0.61±0.11,1.04±0.12,1.29±0.11 vs 1.61±0.16;FasL mRNA:0.81±0.07,1.24±0.10,1.57±0.09vs1.79±0.11;Fas蛋白:1.08±0.12,1.54±0.10,1.89±0.11 vs 2.15±0.15;FasL蛋白:1.51±0.08,1.70±0.12,2.20±0.09 vs 2.41±0.26。结论槲皮素可减轻多柔比星致乳大鼠心肌细胞凋亡,Fas和FasL蛋白表达的减少是其可能机制之一。     

辛伐他汀对K562细胞端粒酶活性及人端粒酶逆转录酶表达的影响

目的探讨辛伐他汀治疗慢性粒细胞白血病可能的作用机制。方法辛伐他汀10和20μmol.L-1与K562细胞作用48或72 h后,用流式细胞术AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡百分率;提取细胞端粒酶,用PCR-ELISA检测端粒酶活性;实时荧光定量PCR检测人端粒酶逆转录酶(hTERT),c-myc和bcl2-mRNA表达。结果辛伐他汀10和20μmo.lL-1与K562细胞作用48 h后,细胞凋亡率分别为(6.24±0.18)%和(9.41±0.22)%,与对照组(1.88±0.14)%比较明显增加;作用72 h后细胞凋亡率分别为(12.41±0.32)%和(19.08±0.26)%,与对照组(4.20±0.19)%比较明显增加。辛伐他汀10和20μmo.lL-1与K562细胞作用48或72 h后,端粒酶活性,hTERT,c-myc和bcl-2 mRNA表达明显低于对照组。结论辛伐他汀可使K562细胞端粒酶活性降低,其机制可能与下调hTERT mRNA表达有关。     

肝细胞生长因子预处理对过氧化氢诱导大鼠神经干细胞凋亡的保护作用

目的研究肝细胞生长因子(HGF)对神经干细胞(NSC)凋亡的保护作用及其作用机制,为HGF用于NSC移植提供实验基础。方法分离培养大鼠NSC。细胞分为正常对照、模型(H2O2100μmo.lL-1)、HGF+H2O2(HGF15,30及60μg.L-1预处理24h后,再加入H2O2100μmol.L-1处理4h),LY294002(PI3K/Akt通路抑制剂)+HGF+H2O2(先加入LY29400220μmol.L-1处理30min,再加入HGF60μg.L-1处理24h,最后再加入100μmo.lL-1H2O2培养4h)组。MTT法检测细胞存活率;TUNEL法检测细胞凋亡率;比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3活性;Western印迹分析Bcl-2,Bax蛋白表达。结果MTT检测发现,随着HGF浓度的增加,NSC细胞的存活率也增加。与模型组〔(63.5±2.4)%〕比较,HGF15,30及60μg.L-1预处理组细胞存活率明显升高〔(79.1±7.5)%,(83.8±6.1)%和(86.6±8.2)%;n=3,P<0.05〕。TUNEL法检测发现,HGF预处理组凋亡细胞明显减少,模型组的凋亡率为(43.5±6.2)%,HGF预处理组则分别为(34.2±8.6)%,(21.7±3.8)%及(19.4±4.0)%。Caspase-3活性检测表明,与模型组相比,HGF预处理组细胞caspase-3活性降低。Western印迹分析结果显示,与模型组比较,HGF预处理使细胞的Bcl-2蛋白表达升高,但Bax蛋白表达不受影响;HGF的抗凋亡效应可被PI3K/Akt通道阻滞剂LY294002阻断。结论HGF可减轻H2O2所诱导的大鼠NSC凋亡,且呈一定的浓度依赖关系,其作用机制可能与NSC的PI3K/Akt通路激活和Bcl-2表达增强有关。     

抗抑郁新化合物SIPI-C和SIPI-F对PC12细胞内游离钙离子浓度的影响

目的研究抗抑郁新化合物SIPI-C和SIPI-F对PC12细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,初步探讨其神经毒性的机制。方法 接种PC12细胞于经胶原Ⅰ包被的培养皿,加入钙离子荧光探针Fluo-3/AM染色后,用激光共聚焦显微镜分别记录①有钙外液中,10μmo.lL-1的SIPI-A,B,C和F对PC12细胞[Ca2+]i的影响;②有钙外液中,1,10和100μmol.L-1的SIPI-C和SIPI-F对[Ca2+]i的影响;③有钙外液中,硝苯地平10μmo.lL-1对10μmo.lL-1的SIPI-C或SIPI-F作用的影响;④无钙细胞外液中,10μmo.lL-1SIPI-C和SIPI-F对[Ca2+]i的影响。结果 有钙外液中,SIPI-A 10μmol.L-1给药后[Ca2+]i下降,10μmol.L-1的SIPI-B,SIPI-C和SIPI-F分别使[Ca2+]i增加27%(P<0.05),84%(P<0.05)和87%(P<0.01);SIPI-C和SIPI-F明显升高[Ca2+]i;同时给予SIPI-C 10μmol.L-1和硝苯地平10μmo.lL-1或SIPI-F 10μmo.l L-1和硝苯地平10μmo.lL-1,给药后荧光强度立即上升达到峰值,随后下降,[Ca2+]i分别增加24%和15%(P<0.05)。在无钙外液中,SIPI-C和SIPI-F 10μmo.lL-1分别使[Ca2+]i增加16%和18%(P<0.01)。结论 抗抑郁化合物SIPI-C和SIPI-F可以引起PC12细胞中[Ca2+]i显著增加,此影响可能与其神经毒性有关。     

ATP敏感性钾通道在U50488H抑制去氧肾上腺素诱导的乳大鼠心肌细胞肥大中的作用

目的研究ATP敏感性钾通道(KATP)在κ-阿片受体激动剂U50488H抑制乳大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法以原代培养的新生大鼠心肌细胞为模型,应用去氧肾上腺素(PE)10μmol.L-1诱导心肌细胞肥大。细胞处理分为正常对照组、PE10μmol.L-1模型组、5-羟基癸酸(5-HD)100μmol.L-1组,格列本脲(Gli)50μmol.L-1组、PE10μmol.L-1+U50488H1μmol.L-1组、PE10μmol.L-1+Gli50μmo.lL-1+U50488H1μmo.lL-1组和PE10μmo.lL-1+5-HD100μmo.lL-1+U50488H1μmol.L-1组,细胞培养液中先加入Gli50μmol.L-1或者5-HD100μmol.L-1,30min后再加入U50448H1μmol.L-1,30min后最后加入PE10μmol.L-1,48h后进行指标检测,Lowry等法检测心肌细胞蛋白质含量;消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积;Western印迹法测定KATP通道Kir6.2亚基的表达。结果与正常对照组相比,PE10μmol.L-1模型组使心肌细胞总蛋白质含量比正常细胞增加了52.2%,细胞体积增加了95.0%,而Kir6.2的表达没有明显变化。与PE10μmol.L-1模型组相比,细胞加入U50488H1μmol.L-1后,心肌细胞总蛋白质含量和细胞体积分别降低了42.3%和47.9%,但是Kir6.2表达增加了39.2%。与PE10μmo.lL-1+U50488H1μmol.L-1组相比,在非选择性KATP通道阻滞剂Gli50μmol.L-1或线粒体KATP通道阻滞剂5-HD100μmol.L-1存在的情况下,Kir6.2表达分别减少了49.3%和52.1%,U50488H抑制PE诱导的心肌细胞肥大作用减弱,并且两组之间没有显著差异。结论 U50488H可能是通过开放KATP通道,主要是线粒体KATP通道来抑制PE诱导的乳大鼠心肌细胞肥大。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对鱼藤酮诱导的嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤的保护作用及其可能机制。方法将培养的大鼠PC12细胞分别加入EGCG1,5和10μmol.L-1预处理30 min后加入鱼藤酮250 nmol.L-1继续作用24 h。MTT比色法检测细胞存活率,Hoechst33258染色观察细胞核形态的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,JC-1染色检测线粒体膜电位变化。结果与鱼藤酮模型组存活率(77.0±1.3)%相比,EGCG1,5和10μmol.L-1组细胞存活率显著增加(P<0.05),分别为(79.8±2.3)%,(82.4±2.2)%和(88.3±2.0)%。Hoechst33258染色发现,EGCG组细胞核形态明显改善。与正常对照组比较,模型组细胞凋亡率增加8.2倍;与鱼藤酮模型组比较,EGCG组细胞凋亡率分别下降46%,25%和63%,差异具有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测鱼藤酮组凋亡率为33.8%,EGCG 1,5和10μmo.lL-1组的凋亡率下降至30.6%,14%和15.7%。与模型组相比,EGCG1,5和10μmol.L-1组线粒体膜分别增高了2.48,3.96和4.04倍,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 EGCG具有抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡作用,其机制可能与其稳定线粒体膜电位有关。     

去甲斑蝥素诱导人卵巢癌SK-OV-3细胞发生有丝分裂期阻滞与凋亡

目的考察去甲斑蝥素(NCTD)对人卵巢癌SK-OV-3细胞生长的抑制作用,探究其诱导细胞发生有丝分裂期阻滞及凋亡的过程及相关性。方法 NCTD 30,60,120和240μmol.L-1分别作用人卵巢SK-OV-3细胞24,48和72 h后,MTT法检测细胞存活率;NCTD 60μmo.lL-1分别作用SK-OV-3细胞0,6,12和24 h后,流式细胞术测定细胞周期的变化;NCTD 60μmol.L-1分别作用SK-OV-3细胞0,6,12和24 h,倒置显微镜下检测其对细胞形态学变化的影响;Giemsa染色检测细胞核的变化;间接免疫荧光术结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测细胞内微管分布及有丝分裂期纺锤体形成的影响。NCTD 60μmol.L-1分别作用12和36 h后,流式细胞术检测细胞凋亡情况;再将NCTD 60μmo.lL-1作用12 h后的细胞,采用温和的机械振荡法分离为悬浮细胞和贴壁细胞,继续作用24 h,流式细胞术及Giemsa染色检测分析两个时相两种细胞凋亡的影响。结果 MTT结果显示,NCTD 30～240μmol.L-1对SK-OV-3细胞的生长抑制作用存在明显的时间(P<0.05)和浓度依赖性(P<0.05);NCTD作用SK-OV-3细胞24,48和72 h的IC50分别为(261.3±2.4)μmo.lL-1,(48.3±1.7)μmol.L-1和(10.9±1.0)μmol.L-1。NCTD 60μmol.L-1分别作用于SK-OV-3细胞0,6,12和24 h,SK-OV-3细胞逐渐表现出G2/M期阻滞,呈时间依赖性;倒置相差显微镜下观察,NCTD引起SK-OV-3细胞逐渐收缩变圆,与周围细胞分离;Giemsa染色可见处于有丝分裂期的细胞显著增多,多个核细胞比例增多;免疫荧光染色发现,NCTD组细胞的微管系统受到干扰,有丝分裂期细胞纺锤体形成异常。NCTD作用细胞12和36 h凋亡率分别达20.4%和62.3%;将NCTD作用12 h的细胞,人工振荡分离为悬浮细胞和贴壁细胞,检测凋亡情况,同时检测继续作用24 h后两组细胞凋亡情况,发现处于有丝分裂间期的SK-OV-3细胞凋亡率大于处于有丝分裂期的细胞。结论 NCTD主要通过诱导人卵巢癌SK-OV-3细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡抑制细胞生长。干扰细胞有丝分裂过程中微管的组装和纺锤体的形成可能是NCTD诱导SK-OV-3细胞M期阻滞的原因之一。NCTD诱导的SK-OV-3细胞发生凋亡可不依赖细胞M期阻滞。     

曲古抑菌素A对细胞PANC-1株凋亡和肿瘤转移相关基因表达的影响

目的探讨曲古抑菌素A(TSA)诱导胰腺癌细胞PANC-1细胞凋亡机制。方法 TSA 0.1～0.6μmol.L-1培养PANC-1细胞0～48 h,MTT法检测细胞存活率并计算IC50。TSA 0.4μmol.L-1PANC-1培养0～48 h,Hoechst 33258染色观察细胞核形态变化。TSA 0.4μmol.L-1PANC-1培养0～12 h,检测胱天蛋白酶3活性。TSA 0.4μmol.L-1与PANC-1培养24 h,实时定量PCR检测c-myc,p53,Bcl-2,Bax,存活素,基质金属蛋白酶1(MMP1)和基质金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)和Notch-1基因的表达。TSA 0.4和0.6μmol.L-1与PANC-1培养24 h,细胞免疫化学方法检测Notch-1蛋白的胞内活性形式NICD表达。结果TSA可以明显抑制PANC-1细胞增殖,12,24和48 h的IC50值分别为0.42,0.32和0.19μmol.L-1,具有量效(r=0.640,P=0.01)和时效(r=0.768,P=0.002)关系。Hoechst 33258染色结果表明,TSA 0.4μmol.L-1增加PANC-1细胞核的蓝色荧光并出现凋亡特征。TSA 0.4μmol.L-1作用4,8和12 h后,胱天蛋白酶3的活性分别为正常对照组的1.62±0.12,2.68±0.17和(3.92±0.23)倍。PCR结果显示,TSA 0.4μmol.L-1作用24 h后,p53,c-myc和存活素mRNA表达下降,分别为对照组的(18.3±5.1)%,(24.2±0.9)%和(15.8±1.0)%,Bcl-2和Notch-1 mRNA未见明显变化,而Bax,MMP1和TIMP-1 mRNA升高(P<0.05),Bcl-2/Bax比值降低到正常对照组的(13.0±2.8)%。Notch-1活性分子NICD明显升高(P<0.05)。结论TSA可通过线粒体途径诱导胰腺癌PANC-1细胞凋亡,而且使Notch-1激活,促进转移相关基因表达。     

γ-羟基丁酸受体在羟丁酸钠保护大鼠海马缺氧复氧损伤中的作用

目的探讨γ-氨基丁酸(GABA)受体与γ-羟基丁酸(GHB)受体在羟丁酸钠(SO)对脑缺血的保护中何者更重要,为临床治疗脑缺血再灌注损伤寻找新的药物靶标。方法采用大鼠海马脑片缺氧复氧(H-R)损伤模型。设正常对照组、H-R模型组、SO1,10和100μmol·L-1组;NCS-382(GHB受体拮抗剂)100μmol·L-1组、荷包牡丹碱(Bic,GABAA受体拮抗剂)100μmol·L-1+saclofen(Sac,GABAB受体拮抗剂)100μmol·L-1(Bic+Sac)组、SO100μmol·L-1+NCS-382100μmol·L-1(SO+NCS-382)组、SO100μmol·L-1+Bic100μmol·L-1+Sac100μmo·lL-1(SO+Bic+Sac)组和SO100μmol·L-1+NCS-382100μmo·lL-1+Bic100μmol·L-1+Sac100μmol·L-1(SO+NCS-382+Bic+Sac)组。用比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)释放率及TTC染色法检测脑组织损伤。结果模型组LDH释放率为(41.5±8.1)%,明显高于对照组(n=6,P<0.01);TTC染色的A490nm值为0.030±0.008,显著低于对照组(n=6,P<0.01)。SO1,10和100μmo·lL-1组的LDH释放率较模型组显著降低(n=6,P<0.05,P<0.01,P<0.01);TTC染色的A490nm值则明显升高(n=6,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。单用GHB受体阻断剂NCS-382,或联合使用GABAA与GABAB受体阻断剂Bic+Sac,LDH释放率和TTC染色的A490nm值均接近模型组(n=6,P>0.05)。SO+NCS-382组LDH释放率较SO100μmol·L-1组明显升高(n=6,P<0.01);SO+NCS-382组和SO+Bic+Sac组TTC染色的A490nm值较SO100μmol·L-1组显著降低(n=6,P<0.01,P<0.05);而SO+NCS-382+Bic+Sac组LDH释放率和TTC染色的A490nm值都与SO100μmol·L-1组有明显差异(n=6,P<0.01),且较SO+Bic+Sac组更明显(n=6,P<0.01),但与SO+NCS-382比较没有明显差异。结论阻断GHB受体比阻断GABA受体对SO对大鼠海马脑片H-R损伤的保护作用影响更大。     

M受体阻断剂对粉防己碱心肌负性肌力作用的调节及其离子机理

研究M受体阻断剂对粉防己碱(Tet)负性肌力作用的影响并探讨其机理. 记录Tet对豚鼠离体左心房收缩力,兔心房肌细胞动作电位及豚鼠单个心室肌细胞Ca²⁺,K^＋通道电流的作用及M受体阻断剂的影响.M受体阻断剂阿托品(0.03 μmol·L^-1)及M₂受体亚型阻断剂AF-DX 116(1.0 μmol·L^-1)能使Tet负性肌力作用的量效曲线平行右移, EC₅₀(μmol·L^-1)由28.9±0.9分别增至125±21和127±13;Tet(1-100 μmol·L^-1)浓度依赖性缩短兔心房肌细胞动作电位时程APD₂₀,APD₅₀, 此作用被阿托品(0.03 μmol·L^-1)部分拮抗,而Tet延长APD₉₀的作用不受阿托品的影响.阿托品(1 μmol·L^-1)部分拮抗Tet(30 μmol·L^-1)对豚鼠心室肌细胞L-型钙电流的阻滞作用,而不影响其抑制内向整流钾电流(I_K1)的作用. 1 μmol·L^-1乙酰胆碱则能逆转Tet对I_K1的抑制. M受体阻断剂对Tet阻滞钙通道作用的影响可能是其拮抗Tet负性肌力作用的主要离子机理.     

苄基四氢巴马汀对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流的影响

利用全细胞膜片钳技术测定大鼠心室肌细胞的I_to, 研究苄基四氢巴马汀（BTHP）对大鼠心室肌瞬时外向钾电流 (I_to) 的影响. 结果显示,5.0 μmol·L^-1 BTHP可以降低I_to, 使I_to幅值从（13.8±2.2）pA·pF^-1降至（5.1±1.4）pA·pF^-1（P＜0.01）. 在1～100 μmol·L^-1范围内BTHP的作用呈浓度依赖性,IC₅₀为3.6 μmol·L^-1,该药不改变I_to 电流-电压曲线的形状,而使电流幅值减少. 5.0 μmol·L^-1 BTHP使稳态激活曲线右移,半激活电压（V_1/2）从（－6.8±0.2）mV移至（－1.5±0.1）mV,但曲线斜率基本不变. BTHP对失活曲线影响不大,5.0 μmol·L^-1 BTHP使通道失活后恢复时间常数从（75±19）ms延长为 （119±21）ms（P＜0.01）. 结果说明,BTHP浓度依赖地阻滞大鼠心室肌细胞的I_to.     

吡格列酮对淀粉样β蛋白片段25-35致大脑皮质神经元损伤的保护作用

目的观察吡格列酮(Pio)对淀粉样β蛋白片段25-35(Aβ25-35)所致培养皮质神经元损伤是否具有保护作用。方法培养7 d的乳大鼠大脑皮质神经元,先加入Pio0.01,0.1,1和10μmol.L-1作用1 h,然后加入Aβ25-3520μmol.L-1作用24 h;或先加入GW9662 10μmol.L-1作用30 min后,加入Pio1μmo.lL-1作用1 h,然后加入Aβ25-35作用24 h。MTT法测定细胞存活率;Hoechst33258核染色观察细胞凋亡的形态学改变及细胞凋亡率;Western印迹法检测磷酸化丝裂原激活蛋白激酶的激酶4(MKK4)水平、磷酸化c-Jun氨基端激酶1(JNK1)水平和Bcl-2蛋白表达水平。结果 MTT结果显示,Aβ25-35可使体外培养神经元存活率明显降到(66.8±1.2)%,Pio 0.1,1和10μmol.L-1可明显对抗Aβ25-35诱导的培养神经元存活率下降,分别为(81.2±2.9)%、(87.9±2.2)%和(98.1±1.9)%,且呈明显浓度依赖性;GW9662能部分拮抗Pio的这种抑制作用。Hoechst33258核染色结果显示,正常培养神经元细胞核荧光染色均匀,只见到极少量细胞出现核固缩,凋亡率为(11.8±1.1)%。Aβ25-35作用24 h后,神经元出现核固缩或核碎裂的数目明显增多,凋亡率增加到(64.6±2.3)%,Pio 0.1,1和10μmol.L-1可明显抑制Aβ25-35引起的培养神经元凋亡率增加,凋亡率分别为(58.3±1.2)%、(52.6±1.3)%和(41.5±1.5)%。Western印迹结果显示,与正常对照组相比,Aβ25-35可使神经元Bcl-2蛋白表达水平明显降低,磷酸化MKK4表达及磷酸化JNK1表达水平明显增加,Pio能上调Bcl-2的表达水平,对抗Aβ25-35诱导的磷酸化MKK4和磷酸化JNK1表达水平增加。结论 Pio能够明显抑制Aβ25-35引起体外培养神经元的损伤作用,这种作用可能与激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ、上调Bcl-2蛋白表达和抑制MKK4/JNK信号转导通路有关。     

盐酸非洛普对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流的抑制作用

目的　已知盐酸非洛普〔1 (2 ,6 二甲基苯氧基 ) 2 (3,4 二甲氧基苯乙氨基 )丙烷盐酸盐 ,DDPH〕对心肌钙电流和钠电流具有抑制作用 ,为全面了解其抗心律失常作用的离子机理 ,研究其对延迟整流钾电流的影响。方法　全细胞膜片钳技术记录豚鼠心室肌细胞快激活的延迟整流钾电流的尾电流(IKr tail)和慢激活的延迟整流钾电流 (IKs)及其尾电流 (IKs tail)。结果　DDPH(1～ 10 0 μmol·L- 1)浓度依赖性地抑制IKr tail,其IC50 为 7.0 (95 %可信限为4 .2 3～ 9.76 ) μmol·L- 1;DDPH 10 μmol·L- 1对IKr tail具有电压依赖性抑制作用。DDPH 10 ,30和 10 0 μmol·L- 1可浓度依赖性地抑制IKs及其IKs tail,使IKs从给药前的 (9.1± 0 .7)pA·pF- 1分别降至 (7.7± 1.7) ,(7.5± 1.8)和 (5 .6± 1.8)pA·pF- 1(P <0 .0 1) ;使IKs tail从给药前的 (1.4± 0 .2 )pA·pF- 1分别降至(1.1± 0 .2 ) ,(0 .9± 0 .2 )和 (0 .6± 0 .2 )pA·pF- 1(P <0 .0 5或P <0 .0 1) ;DDPH 30 μmol·L- 1对IKs tail具有电压依赖性抑制作用。结论　DDPH对豚鼠心室肌细胞延迟整钾电流具有抑制作用。     

胡桃醌及其与顺铂联用对宫颈癌HeLa细胞存活和凋亡的影响

目的探讨胡桃醌及其与顺铂联合用药对宫颈癌HeLa细胞存活和凋亡的影响。方法体外培养人宫颈癌HeLa细胞,加入胡桃醌10～200μmo.lL-1或者胡桃醌20μmo.lL-1+顺铂20μmo.lL-1继续培养8 h或24 h,用倒置显微镜观察细胞形态的变化,用MTT法测定细胞存活率,用流式细胞仪检测细胞周期和细胞早期凋亡率。结果胡桃醌10,20,50,100和200μmo.lL-1与HeLa细胞作用24 h,随着胡桃醌浓度的增加,光镜下HeLa细胞逐渐变小、变圆;HeLa细胞存活率明显降低,分别由对照组的(100.0±0.0)%降低至(87.2±5.6)%,(66.2±4.8)%,(54.5±4.9)%,(42.5±6.4)%和(32.0±2.2)%(P<0.05,P<0.01);HeLa细胞G2/M期百分率逐渐增加,分别由对照组的(7.5±1.2)%增加到(12.9±1.2)%,(16.2±2.8)%,(23.6±3.9)%,(34.2±4.2)%和(52.6±7.8)%(P<0.05,P<0.01)。胡桃醌联合顺铂作用24 h,光镜下脱壁细胞增加,细胞形态变圆,较胡桃醌和顺铂单用组更加明显;联合用药组细胞存活率为(35.0±6.1)%,较胡桃醌和顺铂单用组〔(78.2±12.5)%和(58.5±10.9)%〕明显降低(P<0.01)。胡桃醌联合顺铂作用8 h,HeLa细胞早期凋亡率为(24.6±5.7)%,高于胡桃醌和顺铂单用组〔(6.7±1.5)%和(0.4±2.8)%〕(P<0.01)。结论胡桃醌可抑制HeLa细胞存活,促进HeLa细胞凋亡,与顺铂联合使用具有协同作用。     

哇巴因对血管内皮细胞ECV304细胞凋亡及胞内游离钙离子和活性氧浓度的影响

目的研究哇巴因(毒毛花苷G)对人脐静脉血管内皮细胞ECV304凋亡的诱导作用,并探讨其可能的作用机制。方法哇巴因0.01,0.05,0.1,0.5,1和10μmol·L-1与ECV304细胞作用24,48和72h,MTT法检测细胞存活率,Hoechst33342/碘化丙锭双荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,激光共聚焦显微镜观察细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)和活性氧(ROS)浓度,逆转录PCR和Western印迹法检测胱天蛋白酶3mRNA和蛋白表达。结果哇巴因在0.01～10μmol·L-1浓度范围内与ECV304细胞分别作用24,48和72h,对细胞存活的抑制率明显增加,且呈浓度和时间依赖性,24,48和72h浓度-效应相关系数分别为0.984,0.994和0.997(P<0.05);哇巴因作用24,48和72h的IC50值分别为0.624,0.184和0.041μmol·L-1,时间-效应相关系数为0.974(P<0.05)。哇巴因0.1μmol·L-1与ECV304细胞作用24h,细胞凋亡百分率由正常对照组的(4.2±0.5)%升高到(26.0±3.2)%,作用48h,细胞凋亡率由(4.7±0.5)%升高到(36.5±5.3)%,差异有统计学意义(n=3,P<0.01);同时细胞出现染色质凝集。哇巴因0.01,0.1和0.5μmol·L-1分别与ECV304细胞作用12,24和36h,[Ca2+]i和ROS浓度呈浓度和时间依赖性增加,在哇巴因0.5μmol·L-1时[Ca2+]i和ROS浓度的时间-效应相关系数分别为0.912和0.924,作用36h时[Ca2+]i和ROS浓度的浓度-效应相关系数分别为0.889和0.907(P<0.05)。逆转录PCR和Western印迹法分析显示,哇巴因0.1和0.5μmol·L-1作用ECV304细胞24h后,胱天蛋白酶3mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);哇巴因0.01,0.1和0.5μmol·L-1作用ECV304细胞24h,胱天蛋白酶3蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论哇巴因可诱导人脐静脉血管内皮细胞ECV304凋亡,其机制可能与增加[Ca2+]i和ROS浓度及胱天蛋白酶3表达有关。     

溶血磷脂酰胆碱刺激脑微血管平滑肌细胞增殖的细胞内信号转导途径

通过测定［³H］胸腺嘧啶核苷(［³H］TdR)参入和结晶紫染色法测定平滑肌细胞增殖,研究了溶血磷脂酰胆碱(LPC)刺激牛脑微血管平滑肌细胞(BCMSMC)增殖的细胞内信号转导途径. 结果显示,LPC能浓度依赖性(1 nmol·L^-1-10 μmol·L^-1)诱导BCMSMC摄取［³H］TdR,在LPC的浓度为10 μmol·L^-1时作用达最大,cpm由366±142升至1761±296(P<0.01);LPC亦能浓度依赖性(1 nmol·L^-1-10 μmol·L^-1)诱导BCMSMC增殖,在LPC浓度为1 μmol·L^-1时促增殖作用达坪值,A_{595 nm}由0.060±0.009增至0.100±0.015(P<0.01). 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)特异性抑制剂PD 98059(2-50 μmol·L^-1),血小板衍生生长因子受体抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1296(2-50 μmol·L^-1)以及蛋白质酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素A(2-10 μmol· L^-1)能浓度依赖性地抑制LPC的上述作用. 表明LPC能促进BCMSMC增殖,其细胞内信号转导与MAPK途径有关.     

7-氯苄基四氢帕马丁及奎尼丁对豚鼠离体心房及大鼠血管环的作用比较

7-氯苄基四氢帕马丁( 7-Cl-BTHP)及奎尼丁(Qui)均能明显延长豚鼠离体左心房的功能性不应期,显著抑制肾上腺素诱发的自律性,但7-Cl-BTHP能明显增强豚鼠离体左心房的收缩力,而Qui则对其无影响. 在心脏肥厚大鼠及正常大鼠的离体主动脉环,7-Cl-BTHP及Qui对去甲肾上腺素所致的收缩均有抑制作用. 7-Cl-BTHP的 IC₅₀分别为76及39 μmol·L^-1,而Qui的IC₅₀则分别为4.6及8 μmol·L^-1. Qui对氯化钾所致心脏肥厚及正常大鼠主动脉环的收缩有明显的抑制作用,其pD₂′分别为4.3及4.0,而7-Cl-BTHP则对其无影响. 结果提示7-Cl-BTHP的抗心律失常作用可能与延长不应期,降低自律性和抗α受体作用有关.