ATG16L1在自噬及非自噬途径中的功能研究进展

<正>巨自噬(以下简称“自噬”)需要形成隔离膜,延伸并吞噬部分细胞质或者细胞器,随后闭合形成自噬体,成熟的自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,并降解其内容物^[1]。许多自噬相关蛋白参与介导自噬所需的自噬体的生物发生^[1]。在这些蛋白中,ATG16L1作为ATG12-ATG5/ATG16L1复合物的亚基存在,并且在自噬中发挥重要的功能,如将ATG12-ATG5定位到PAS,     

去泛素化酶USP2对米色脂肪产热功能的影响

目的 探讨去泛素化酶2(ubiquitin-specific protease 2,USP2)在白色脂肪棕色化过程中的作用及其潜在机制.方法 运用实时定量PCR和Western blot法检测USP2在小鼠代谢组织中的表达谱.检测米色脂肪细胞诱导分化过程中(0、2、4、6、8天)USP2 mRNA和蛋白表达.建立小鼠白...     

沉默ATG5及ATG7可抑制顺铂介导的耐顺铂睾丸癌细胞的自噬和增殖

Objective To observe the changes in autophagy of cisplatin-resistant I-10 testicular cancer cells (I-10/DDP cells) in response to cisplatin treatment and the effect of silencing ATG5 and ATG7 on autophagy and proliferation of cisplatin-treated cells. Methods I- 10/DDP cells treated with 15 μmol/L cisplatin for 12 h were examined for expressions of LC3 and p62 by Western blotting and for autophagy level through transmission electron microscopy and mCherry-GFP-LC3B. I-10/DDP cells were transfected with short hairpin RNAs shRNA-ATG5 or shRNA-ATG7 via Lipfectamine2000, the empty vector (NC group), or Lipfectamine2000 alone (blank control group), and the cellular expressions of ATG5 and ATG7 were detected with Western blotting. The transfected cells were treated with 15 μmol/L cisplatin for 12 h, after that the expressions of LC3 and p62 were detected with Western blotting. Transmission electron microscopy and mCherry-GFP-LC3B were used to detect autophagy level in the cells. MTT assay and colony-forming assay were performed to assess the cell survival fraction and colony formation ability of the treated cells, respectively. Results After cisplatin treatmert, the expression level of LC3 II increased significantly (P<0.001), the expression level of p62 decreased (P<0.05), and the number of autophagosomes increased in I-10/DDP cells. The cells transfected with shRNA-ATG5 or shRNA-ATG7 showed significantly decreased expressions of ATG5 or ATG7 (P=0.005 or P<0.001). Cisplatin treatment of the transfected cells obviously reduced the cellular expression of LC3 II (P< 0.001), increased the expression of p62 (P<0.001), and decreased the number of autophagosomes, cell survival fraction and colony formation ability of the cells (P<0.001). Conclusion Silencing ATG5 and ATG7 inhibits cisplatin-mediated autophagy and enhances the inhibitory effect of cisplatin on inhibiting cell proliferation.     

自噬活性改变对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)自噬活性的改变对其向成骨细胞分化能力的影响,初步探讨自噬在骨髓MSCs成骨分化中的作用.方法 不同浓度的雷帕霉素处理骨髓MSCs 48 h后,向成骨细胞诱导分化2周.免疫荧光激光共聚焦法检测LC3表达;单丹磺酰戊二胺(MDC)荧光染色检测自噬囊泡;Western blot检测LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达;实时定量PCR检测成骨相关基因ALP和Runx2表达;Von Kossa染色检测钙质沉积程度改变.结果 经雷帕霉素处理后,激光共聚焦和Western blot检测均可见骨髓MSCs中LC3的表达明显增加;自噬囊泡数量增加;成骨相关基因ALP和Runx2的mRNA表达量明显减少;Von kossa染色可见MSCs钙质沉积程度减弱.上述改变呈剂量依赖性.结论 骨髓MSCs的基础自噬活性较低,雷帕霉素能够增加骨髓MSCs的自噬活性,但同时减弱其向成骨细胞分化的潜能.自噬可能参与骨髓MSCs向成骨细胞分化的过程.     

高尔基体通过自噬调控成骨分化的研究进展

临床上由多种原因引起的骨类疾病越来越常见,促进细胞的成骨分化是治疗骨类疾病的一个重要方面。自噬是细胞中普遍存在的一种生物活动,对于细胞的成骨分化具有重要意义。高尔基体是细胞内膜系统的重要组成结构之一,可参与自噬体的形成。本文主要围绕高尔基体、自噬和成骨分化三者之间的相互关系进行综述。     

饥饿对大鼠脂肪细胞分化的影响

目的了解饥饿对大鼠脂肪细胞分化的影响。方法应用cDNA芯片以及Northern印迹等方法,了解在饥饿的情况下,大鼠脂肪细胞基因表达谱的变化,进一步分析饥饿对大鼠脂肪细胞分化的影响。结果在饥饿大鼠的基因表达谱中,总共有98个基因或EST发生了变化,其中许多与细胞分化有关的一些基因也发生了明显的变化。结论在饥饿的情况下,大鼠脂肪细胞的分化受到一定程度的抑制。     

低氧条件下自噬激活对成骨细胞分化的影响

目的:探讨低氧条件下成骨细胞自噬激活对细胞分化的影响.方法:于2％氧浓度下培养hFOB1.19成骨细胞,以常规培养的细胞为对照组,低氧条件下培养不同时间(3 h、6 h、12 h、24 h、48 h)的细胞为实验组.采用Western blotting法检测自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin 1...     

抑制miR-101对糖尿病肾病模型大鼠肾组织中FOXO1蛋白和自噬水平的影响

目的:探究抑制微小RNA(miR)-101对糖尿病肾病(DN)模型大鼠的影响以及对肾组织叉头状转录因子O1(FoxO1)和自噬的影响。方法:通过腹腔注射链脲佐菌素建立DN模型,随机选择30只DN大鼠分为DN组(n=15)和DN+miR-101 antagomir组(n=15),15只健康大鼠作为对照组。尾静脉注射miR-101 antagomir(300μg)以抑制miR-101的水平。通过HE染色验证建模结果和抑制miR-101对肾组织的保护作用。检测和比较各组的肾功能指标、miR-101、FoxO1mRNA和蛋白、自噬蛋白(Beclin1和LC3Ⅱ)表达量。结果:建模后和干预后,DN组和DN+miR-101 antagomir组的血糖水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),且均显著高于对照组(均P<0.05)。三组大鼠的上述各项指标比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。DN组的24h尿蛋白、肌酐和miR-101水平显著高于对照组,FoxO1的mRNA和蛋白、Beclin1和LC3Ⅱ表达量显著低于对照组(均P<0.05)。DN+miR-101 antagomir组的24h尿蛋白、肌酐和miR-101水平显著低于DN组,FoxO1的mRNA和蛋白、Beclin1和LC3Ⅱ表达量显著高于DN组(均P<0.05)。结论:抑制miR-101可以缓解DN大鼠肾组织损伤保护肾功能,并提高FoxO1蛋白表达量,促进细胞自噬。     

双氢青蒿素增强自噬调节PC12向神经元分化

目的 探讨DHA对PC-12细胞的分化促进作用。方法 通过CCK8法筛选DHA的最适浓度,免疫荧光法检测神经元标志物MAP2,qPCR 检测Beclin、ATG5和LC3基因表达量。Western blotting检测蛋白水平的含量。结果 结果显示浓度为0.01、0.1、1 μg/mL的DHA干预PC12h,细胞活力和正常组比较无差异。DHA浓度为0.1μg/mL,干预48 h后PC-12细胞内MAP2阳性细胞数显著增多(P=0.029),细胞突触伸长。qPCR结果显示 ATG5、Beclin的mRNA表达水平显著升高,LC-3的mRNA表达水平升高,Western blotting结果显示Beclin、ATG5蛋白水平有显著升高。结论 低浓度的双氢青蒿素可以通过自噬调节PC12细胞突触伸长,促进细胞分化,对神经退行性等疾病预防和治疗有重要意义。     

miR-17在动脉粥样硬化中下调ATG7蛋白水平抑制巨噬细胞的自噬功能

目的 在动脉粥样硬化患者的血液中检测自噬相关miRNA的水平变化,探究差异miRNA是否参与巨噬细胞的自噬过程,并影响巨噬细胞的凋亡及炎症表达。方法 在动脉粥样硬化患者的血液中,用荧光定量PCR的方法检测miRNA的水平。在转染miR-17后,通过蛋白质免疫印迹的方法检测巨噬细胞中ATG7蛋白以及自噬标志物LC3Ⅱ表达。同时,使用MTT实验检测转染miR-17后双氧水诱导巨噬细胞凋亡的改变,通过荧光定量PCR检测炎性因子水平探究转染miR-17后巨噬细胞的炎症表达。结果 在动脉粥样硬化患者的血液中,miR-17的水平特异升高。而转染miR-17后,巨噬细胞中miR-17靶向蛋白ATG7和自噬标志物LC3Ⅱ表达下降。miR-17在巨噬细胞中的升高同时促进了双氧水诱导的细胞凋亡,并增强了TNF-α等炎性因子的表达。结论 miR-17水平在动脉粥样硬化患者的血液中特异升高,并在巨噬细胞通过靶向ATG7介导细胞自噬水平降低,进而增强巨噬细胞的炎症表达并促进其凋亡。     

线粒体对米色脂肪细胞的调控作用

肥胖是由于长期能量摄入大于消耗,使过剩的能量以脂肪形式储存于脂肪组织或者其他部位。脂肪组织适应性产热的激活能够促进能量消耗及改善糖脂代谢,是肥胖治疗的关键。棕色脂肪细胞和米色脂肪细胞均参与产热,成人体内产热脂肪的特性更接近于米色脂肪,即具有储能/耗能双向切换模式,在被寒冷或肾上腺素激动剂等诱导激活后适应性产热增加。 产热脂肪细胞主要通过线粒体中的解偶联蛋白1将化学能转化为热能释放。近期研究发现线粒体动力学、质量控制、代谢产物以及线粒体本身作为细胞间信号传递的载体在米色脂肪细胞生成和功能维持方面也发挥重要作用。文章对米色脂肪细胞中线粒体的特征及线粒体对米色脂肪生成和功能的调控进行综述。     

血小板衍生生长因子-BB对骨髓间充质干细胞多向分化及自噬相关蛋白表达的影响

目的观察血小板衍生生长因子-BB（platelet derived growth factor-BB, PDGF-BB）对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs）多向诱导分化以及自噬相关蛋白表达的影响;建立异位牙髓再生模型,探讨PDGF-BB对再生牙髓样组织中自噬相关蛋白表达的影响。方法体外分离鉴定大鼠BMSCs,随机分为4组,每组培养基中分别加入0、10、50、100 ng/mL PDGF-BB,通过CCK-8、Transwell、qRT-PCR及细胞免疫荧光染色技术,检测不同浓度PDGF-BB对BMSCs增殖、迁移、多向诱导分化及自噬相关蛋白表达的影响,确定PDGF-BB趋化BMSCs细胞归巢的最佳工作浓度范围。依据是否放入PDGF-BB,将试验大鼠随机分为两组： 对照组（Collagen Type Ⅰ）,PDGF-BB诱导组（50 ng/mL PDGF-BB+Collagen Type Ⅰ）,将PDGF-BB联合Collagen Type Ⅰ支架移植入经过根管预备后的离体牙根管内,并移植于大鼠腹部皮下。分别于术后2、4个月,采用免疫组化染色技术观察异位再生牙髓样组织的再生效果及其自噬相关蛋白ATG5和LC3的表达。结果CCK-8结果显示,BMSCs增殖活性随PDGF-BB浓度升高递增（P<0.05）;Transwell结果显示,细胞迁移数随PDGF-BB浓度升高递增（P<0.05）;qRT-PCR结果显示,OPN、Runx2、MAP2、β-Ⅲ-tubulin mRNA表达量随PDGF-BB浓度升高递增（P<0.05）,当PDGF-BB浓度达到100 ng/mL时,mRNA表达量达到最大值;细胞免疫荧光染色结果显示,ATG5和LC3阳性细胞数量随PDGF-BB浓度升高递增,50 ng/mL PDGF-BB诱导后,ATG5和LC3阳性细胞数最大;术后4个月PDGF-BB诱导组得到的再生牙髓样组织形态与天然人牙髓组织相近,其ATG5、LC3蛋白表达高于对照组（P<0.05）。结论PDGF-BB能够促进大鼠BMSCs增殖,对BMSCs具有显著趋化作用。PDGF-BB能够促进大鼠BMSCs向成骨细胞及神经细胞分化,并促进自噬相关蛋白的表达。联合使用PDGF-BB可以有效获得内源性BMSCs迁移,促进大鼠体内牙髓样组织异位再生,及自噬相关蛋白表达。     

亮氨酸拉链蛋白对前脂肪细胞增殖、分化及相关基因表达的影响

目的:探讨亮氨酸拉链蛋白(GILZ)对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的作用及对脂肪细胞分化相关标志基因PPARγ2、C/EBPa、LPL和FAS mRNA的表达。方法:采用MTT法检测GILZ稳定表达3T3-L1细胞从D1到D11细胞的增殖情况。油红O染色观察GILZ过表达对脂肪细胞分化和甘油三酯相对含量的影响。实时荧光定量PCR法检测脂肪细胞分化相关标志基因PPARγ2、C/EBPa、LPL和FAS的mRNA表达。结果:与转染Pc DNA3空载体的对照组相比,GILZ过表达组的细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)。经MID诱导后,与对照组相比,GILZ过表达组的桔红色细胞显著减少。脂肪细胞内甘油三酯相对含量也显著降低(0.365±0.012 vs 0.181±0.014,P<0.001)。分化过程中GILZ过表达的3T3-L1细胞内脂肪细胞分化基因PPARγ2、C/EBPa、LPL和FAS的mRNA表达显著降低(分化第9天时的相对表达分别为11.447±0.831 vs 1.173±0.290,17.700±0.915 vs 1.557±0.384,67.057±5.288 vs 9.467±3.406,40.946±3.968 vs 4.967±1.091,P<0.001)。结论:GILZ对前脂肪细胞的增殖没有明显的影响。GILZ过表达可显著性抑制PPARγ2,C/EBPa,LPL和FAS的mRNA表达,表明GILZ可能通过下调脂肪细胞分化转录因子PPARγ2,C/EBPa的表达而抑制脂肪细胞特异性基因LPL和FAS的表达,进而抑制脂肪细胞的分化。     

PPARγ基因转染对兔骨髓间充质干细胞向脂肪细胞早期分化的影响

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达在骨髓间充质干细胞(MSC)向脂肪细胞早期分化中的调控作用及对脂肪分化相关蛋白(ADRP)表达的影响.方法:原代培养新西兰大白兔MSC,应用脂质体转染法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSC中,G418筛选.成脂诱导剂诱导向脂肪细胞分化,RT-PCR检测PPARγ,ADRPmR-NA表达,Western Blot检测ADRP蛋白表达,细胞形态学、油红O染色法行脂肪细胞计数和定量.结果:未分化的MSC中PPARγ,ADRPmRNA不表达,经pEGFP-N1-PPARγ转染后,调控成脂肪细胞方向分化的转录因子和早期标志PPARγmRNA(0.87±0.08 vs 0.28±0.01,P<0.01),ADRPmRNA(0.52±0.03 vs 0.21±0.02,P<0.01)表达增强;MSC向成脂肪细胞方向分化,成脂率及脂质量提高,分别为(78.5±4.2)% vs (51.4±3.0)%和(0.46±0.05) vs (0.21±0.02),P<0.05;分化成脂的细胞ADRP蛋白表达呈阳性,转染组较空转染组表达增强.结论:PPARγ在MSC向脂肪细胞分化的早期中起重要的正向调节作用,并促进ADRP基因和蛋白的表达;PPARγ基因过表达可增强MSC向脂肪细胞分化的能力,缩短分化进程,提高分化效率,可能与增强ADRP的表达有关.     

营养剥夺诱导的脂肪细胞自噬及与Beclin1的关系

目的探讨3T3-L1脂肪细胞在营养剥夺状态下自噬的发生及自噬相关基因Beclin1的变化。方法培养3T3-L1脂肪细胞至不同诱导分化时期,对照组不做特别处理,营养剥夺组以Hanks液代替细胞完全培养液3 h,形成营养剥夺状态。采用透射电镜观察自噬体;转染携带微管相关蛋白1轻链3(LC3)的绿色荧光蛋白慢病毒(LC3-GFP-LENTIVIRAL)质粒系统,病毒扩增后感染3T3-L1靶细胞,荧光显微镜下观察LC3-GFP点状聚集;蛋白免疫印迹分析检测自噬抗体LC3以及Beclin1的变化;双荧光素酶报告基因检测Beclin1基因转录区(Promoter)及3′非编码区(3′UTR)的变化。结果营养剥夺组自噬体数量较对照组增多;营养剥夺组较对照组LC3-GFP点状聚集增多;营养剥夺组LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达较对照组升高;与对照组相比,营养剥夺组Beclin1-Promoter及Beclin1-3′UTR相对荧光单位呈倍数增高,差别有统计学意义(P<0.01)。结论营养剥夺可以诱导3T3-L1脂肪细胞发生自噬;营养剥夺诱导的自噬与Beclin1相关,可同时影响Beclin1基因的转录与mRNA稳定性。     

铅暴露时间对大脑皮质ATG5、Beclin1、 LC3B 表达的影响

目的 通过复制成年动物铅暴露模型,研究铅暴露时间长短对大脑皮质自噬蛋白ATG5、 Beclin1、LC3B 表达的变化。方法 选取18 只豚鼠随机分为4 组：对照组（3 只）,以及铅暴露15、60 和 90 d 组（每组5 只）。用0.2% 醋酸铅饮用水复制动物铅暴露模型,对照组给予等量的生理盐水喂养;免疫组 织化学法检测ATG5、Beclin1 和LC3B 的表达。结果 与对照组相比,不同时间铅暴露组自噬蛋白ATG5、 Beclin1 和LC3B 的阳性表达升高（P <0.05）。铅暴露90 d 组的ATG5 表达水平与各暴露组比较,差异有统 计学意义（P <0.05）。铅暴露15 d 组与60 d 组的ATG5 表达水平比较,差异无统计学意义（P >0.05）。各暴 露组Beclin1 和LC3B 蛋白水平比较,差异无统计学意义（P >0.05）。结论 环境铅饮用水可通过自噬蛋白 ATG5、Beclin1 及LC3B 引起大脑皮质区的自噬反应,推测铅暴露激活的早期自噬反应可能对大脑皮质发挥 神经毒性作用,对成年豚鼠大脑造成不可逆转的损害。     

miR-424通过调控ATG14的表达抑制肝癌细胞的自噬和增殖

目的 研究miR-424通过调控ATG14表达影响自噬和肝癌细胞增殖。方法 收集肝癌患者因手术切除的肝癌组织及其癌旁组织,采用 qRT-PCR 法检测肝癌组织中 miR-424-5p,ATG14 的表达。培养人肝癌细胞系 HepG2、SMMC-7721、Huh-7、MHCC97H、HCCLM3和人正常肝细胞LO2,qRT-PCR法检测上述各细胞系的miR-424-5p表达,选取表达量较高的Huh-7和表达量较低的HCCLM3肝癌细胞为研究对象,Huh-7细胞实验分组（n=3）：干扰miR-424-5p表达阴性对照组（in-NC组）,干扰miR-424-5p表达组（in-miR-424-5p组）;HCCLM3细胞实验分组（n=3）：过表达miR-424-5p组（mi-miR-424-5p组）,另设过表达miR-424-5p阴性对照组（mi-NC组）;过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14阴性对照组（mi-NC+NC组）;过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14组（mi-NC+ ATG14组）;过表达miR-424-5p +过表达ATG14阴性对照组（mi-miR-424-5p+NC组）;过表达miR-424-5p +过表达ATG14组（mi-miR-424-5p +ATG14组）。qRT-PCR法及Western blot法验证各组miR-424-5p和ATG14的转染情况。采用MTT法检测各组细胞的细胞增殖,流式细胞术检测各组细胞的细胞凋亡水平,Western blot检测各组细胞的ATG14和自噬相关蛋白LC3、Beclin1和P62的表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测miR-424-5p和ATG14之间的相互作用。结果 在肝癌组织和细胞中ATG14高表达,miR-424-5p低表达。与相应对照组相比,过表达miR-424-5p抑制肝癌细胞增殖和促进凋亡（P<0.05）;干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14促进肝癌细胞增殖和抑制凋亡（P<0.05）;miR-424可能通过靶向ATG14发挥抑癌的作用。干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14均能提高肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P<0.05）,降低自噬受体蛋白P62的表达水平（P<0.05）;过表达miR-424-5p则降低肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P<0.05）,提高自噬受体蛋白P62的表达水平（P<0.05）。结论 miR-424调控ATG14表达影响自噬,从而抑制肝癌细胞增殖。     

红景天苷对3T3-L1脂肪细胞糖代谢及细胞分化的影响

目的:观察红景天苷对脂肪细胞糖代谢和细胞分化的影响,分析其改善糖代谢的可能机制.方法:检测红景天苷干预的脂肪细胞对 3H-葡萄糖的摄取,对红景天苷干预分化的细胞进行油红O染色后通过比色法分析脂肪细胞分化程度.逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)检测脂肪细胞分化相关基因过氧化物体增殖剂活化受体-γ(PPAR-γ)、CAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBP-α) mRNA的表达. 结果:红景天苷组葡萄糖摄取率为110.4%,明显高于正常对照组 (P<0.01);红景天苷明显抑制细胞分化及PPAR-γ、C/EBP-α mRNA表达,与对照组比较,P<0.01.结论:红景天苷促进3H-葡萄糖摄取,可抑制脂肪细胞分化,下调分化相关基因的表达.