OmpR对伤寒沙门菌侵袭上皮细胞能力的影响

目的: 研究OmpR对伤寒沙门菌侵袭力的影响及相关分子机制。方法: 利用空载体对照株(WT pBAD33)、ompR缺陷株(ΔompR pBAD33)和ompR回补株(C ΔompR)进行HeLa细胞侵袭实验,探究伤寒沙门菌OmpR对于HeLa细胞侵袭力的影响。进一步用荧光实时定量PCR(qRT PCR)、凝胶阻滞实验(EMSA)分析伤寒沙门菌OmpR对侵袭相关基因iagA、invF、prgH的调控作用。结果： 成功制备伤寒沙门菌C ΔompR。在HeLa细胞侵袭实验中,ΔompR pBAD33侵袭力显著低于WT pBAD33(P<0.01),而C ΔompR侵袭能力较ΔompR pBAD33明显升高（P<0.01）;qRT PCR结果显示,ΔompR pBAD33中侵袭相关基因iagA、invF、prgH的转录水平较WT pBAD33明显下降(P<0.01);EMSA结果表明,OmpR可直接与prgH基因启动子区域结合,与iagA和invF基因启动子区域未有结合。 结论： OmpR通过直接调节prgH和间接调节iagA、invF增加侵袭相关基因的表达,从而增强伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力。     

非编码 RNA AsrC 对巨噬细胞中伤寒沙门菌生存能力的影响

目的:研究伤寒沙门菌非编码RNA Asr C对其在巨噬细胞中生存能力的影响及机制。方法:用Asr C高表达菌株和空质粒对照株分别感染巨噬细胞12,24 h,检测伤寒沙门菌在感染细胞中的生存能力;qRT-PCR检测asr C、rse C、rpo E mRNA的表达水平;蛋白质印迹检测自噬标志蛋白LC3的表达。结果:与空质粒对照株相比,Asr C高表达菌株感染巨噬细胞12,24 h后在巨噬细胞中的生存能力明显下降(P均<0.01),asr C mRNA表达水平增加(P均<0.05),对侧靶基因rse C mRNA的表达水平增高(P均<0.05),而rpo E mRNA的表达水平无明显变化(P>0.05);Asr C高表达菌株自噬标志蛋白LC3的表达与空质粒对照株间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:伤寒沙门菌非编码RNA Asr C高表达可降低其在巨噬细胞中的生存能力,可能与自噬无直接关系。     

氯喹对鼠伤寒沙门菌诱导巨噬细胞自噬的影响

目的:研究氯喹对鼠伤寒沙门菌诱导巨噬细胞(macrophage,MΦ)自噬的影响。方法:确定氯喹干预感染模型的工作浓度,应用该浓度下的氯喹分别干预携带毒力质粒的野生株χ3306和消除了毒力质粒的突变株χ3337与小鼠腹腔MΦJ774A.1的感染模型,探讨氯喹影响细菌与MΦJ774A.1自噬的机制。结果:20μmol/L氯喹单独作用6 h对细胞和细菌无显著影响;但干预感染模型后,却能阻断自噬。结论:鼠伤寒沙门菌毒力质粒参与了自噬早期过程。     

伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株制备与分泌蛋白初析

目的观察伤寒沙门菌调节蛋白OmpR的调节作用,制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株,并比较分析野生株和OmpR缺陷变异株在不同渗透压环境培养下的分泌蛋白。方法用自杀质粒pGMB151介导同源性重组方法制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株,用PCR方法观察重组现象,变异株经测序和外膜蛋白的SDS—PAG电泳鉴定,用SDS—PAG电泳结合Western blot比较分析野生株和OmpR缺陷变异株在高、低渗透压环境培养下的SipC等分泌蛋白。结果成功制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株,并发现变异株中,包括SipC、鞭毛素蛋白在内的多种蛋白的表达分泌有明显差异。结论伤寒沙门菌OmpR在不同的渗透压下分别影响SipC、鞭毛素蛋白等多种蛋白的表达分泌。     

短链脂肪酸作用下伤寒沙门菌对巨噬细胞凋亡的影响

目的:了解伤寒沙门菌及其短链脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA)作用菌诱导人巨噬细胞凋亡的差异.方法:使用流式细胞术检测SCFA作用菌及原菌诱导巨噬细胞2、4、8、12及24 h的细胞凋亡率.结果:SCFA作用菌及原菌均能诱导巨噬细胞发生凋亡,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01);SCFA作用组不同时间诱导细胞凋亡率均高于原菌组(P<0.01).结论:SCFA可促进伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡.     

伤寒沙门菌质粒pR_(ST98)与巨噬细胞凋亡的关系

目的研究伤寒沙门菌质粒pRST98与小鼠巨噬细胞J774A.1凋亡之间的关系。方法用3株鼠伤寒沙门菌——标准毒株SR-11、低毒株RIA和将pRST98经接合转移导入RIA的接合子pRST98/RIA在体外分别与小鼠巨噬细胞J774A.1共培养,于0、2、4、6、12和24h用JC-1染色法和流式细胞术检测pRST98对J774A.1线粒体膜电位的影响;用AnnexinV-FITC试剂盒和TUNEL法检测J774A.1的凋亡情况;台盼蓝染色法和系列稀释法分别用于活细胞和胞内活菌计数。结果从感染后2h起,SR-11组、pRST98/RIA组和RIA组J774A.1线粒体膜电位下降的百分率依次降低,随着感染的时间延长,J774A.1通过线粒体途径而导致的细胞凋亡率呈上升趋势;各感染组J774A.1的凋亡率表现为SR-11组〉pRST98/RIA组〉RIA组,差异均有统计学意义（P〈0.05或〈0.01）;各时间段J774A.1的活细胞数和细胞内活菌计数均呈现SR-11组%@ 1673-0399     

小儿鼠伤寒沙门菌感染

目的小儿鼠伤寒沙门菌感染临床表现不典型，常易导致误诊及病程迁延，本文简要综述小儿鼠伤寒沙门菌感染的流行病学、临床表现、治疗及预防。     

新生儿非伤寒沙门菌感染的检验分析

非伤寒沙门菌引起的新生儿院内感染在我院已得到有效的控制。为杜绝此类感染再次发生 ,将我院产科婴儿室十余年前相继发生的 3起新生儿非伤寒沙门菌感染以致暴发流行的病例及细菌学特性介绍如下 ,以引起同行的注意。1　临床资料　　 1985年冬 ,我院产科婴儿室发生流行性腹泻。患儿发病年龄 1～ 10ｄ ,14例患儿粪便培养出斯坦利沙门菌 ,其中 5例同时在血液中培养出该菌。临床表现分为 :急性胃肠炎型 (9例 ) ,败血症型 (5例 )。发病急且重 ,12例痊愈 ,2例死亡 (均系败血症型 )。　　 1987年冬 ,又出现流行性腹泻。患儿发病年龄1～ 2 0ｄ。 13…     

伤寒沙门菌生化特性分析

目的：了解现在的伤寒沙门菌可能发生的变异。方法：用纯化的伤寒沙门菌检测其抗原性、生化反应性等特性。结果：①与标准菌株的反应模式相比较,现在的菌株的Ｈ２Ｓ、ＭＲ反应、枸橼酸盐、肌醇、山梨醇、阿拉伯糖的反应性发生了改变,其中ＭＲ反应的变异有高度显著性差异（Ｐ〈０．００５）;②Ｈｄ抗原可消失而不丧失动力且很易发生变异（５２．００％）,Ｏ９抗原性亦可消失或减弱;③ＳＳ平板培养时,其菌落可发生侏儒型变异,变     

OxyR蛋白对不同应激条件下伤寒沙门菌生存能力的影响

目的：研究OxyR蛋白对伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi, S.Typhi)在应激条件下生存能力的影响。方法：用λ-Red系统制备S.Typhi oxyR基因缺陷变异株;通过重组质粒pBAD/gⅢ将oxyR基因和pBAD/gⅢ空质粒分别导入oxyR基因缺陷变异株;构建oxyR缺陷回补株和oxyR缺陷回补空质粒株;制作生长曲线,观察野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回补株及oxyR缺陷回补空质粒株在不同应激条件下的生长状况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析OxyR对S.Typhi氧化调节相关基因表达的影响。结果：成功制备S.Typhi oxyR基因缺陷变异株、oxyR基因缺陷回补株和空质粒对照株;生长能力分析结果表明,与野生株相比,oxyR缺陷株在氧应激时生长缓慢(P<0.05),oxyR缺陷回补株的生长能力得到恢复;qRT-PCR结果显示,在氧应激时OxyR蛋白可以抑制hemH基因的表达,活化uxuA基因的表达。结论：OxyR蛋白参与S.Typhi对氧应激的调节,为进一步研究S.Typhi 的致病性奠定了基础。     

宿主整合因子对伤寒沙门菌动力的影响

目的: 探究宿主整合因子(integration host factor,IHF)对伤寒沙门菌动力的影响及其潜在机制。方法: 选用IHF两个亚基HimA和HimD的基因缺失株(△himA pBAD、△himD-pBAD）,并构建相应回补株(himA-C、himD-C),进行细菌动力实验,观察himA和himD对伤寒沙门菌动力的影响。通过实时荧光定量PCR比较野生株(WT-pBAD)与△himA-pBAD、野生株与△himD-pBAD中鞭毛相关基因flhD、fliA和fljB等mRNA表达差异,分析IHF对鞭毛基因的调控作用。结果： 与WT-pBAD相比,△himA-pBAD和△himD pBAD动力均明显减弱(P均<0.05),himA-C、himD-C动力则基本一致。与WT pBAD相比,△himA pBAD、△himD-pBAD中鞭毛相关基因flhD、fliA和fljB的mRNA表达均显著降低(P<0.01或<0.05)。结论： IHF可能通过正向调节鞭毛相关基因flhD、fliA和fljB等转录,增强伤寒沙门菌的动力。     

非编码 RNA GlmY 对伤寒沙门菌生物膜形成的影响

目的: 探究非编码 RNA GlmY 对伤寒沙门菌生物膜形成的影响及其分子机制。方法: 用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法,制备 glmY 缺陷株;用96孔微量板结晶紫染色法检测各菌株生物膜形成情况;通过qRT PCR分析glmY 缺陷株及野生株中生物膜形成相关基因的mRNA表达水平。结果： 成功制备glmY缺陷株;细菌生物膜形成实验表明,与野生株相比,glmY缺陷株生物膜形成能力明显下降;qRT PCR分析结果显示,GlmY缺失后卷曲菌毛合成相关基因csgD和csgA的mRNA表达水平明显下调。结论： 伤寒沙门菌非编码 RNA GlmY可通过上调csgD和csgA的表达促进卷曲菌毛合成,进而促进生物膜的形成。     

Fis对伤寒沙门菌基因表达的系统调节作用

目的：探讨伤寒沙门菌调节因子fis对基因表达的系统调节作用。方法：用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株,用脉冲场凝胶电泳分析fis缺陷变异株的基因组结构。利用伤寒沙门菌全基因组DNA芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和fis基因缺陷变异株的基因表达谱差异。用重组载体pBADfis回补fis缺陷变异株,选择部分差异表达基因进行qRT—PCR验证,用半固体平板培养观察野生株、fis缺陷变异株和回补株的动力。结果：fis基因缺陷变异株含有二相鞭毛素编码基因的线性质粒缺失,且动力消失;基因表达谱比较分析结果表明,伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株在对数生长期94个基因出现表达差异;qRT—PCR分析所选基因表达的结果与芯片分析结果相符;fis缺陷变异株在回补fis基因后,动力及差异表达基因都获得明显恢复。结论：Fis在伤寒沙门菌中对动力、侵袭及多种代谢相关基因的表达发挥重要调节作用。     

鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株的制备

目的: 为进一步研究鼠伤寒沙门菌毒力基因spvC的功能,制备鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株。方法: 根据鼠伤寒沙门菌spvC基因序列,设计PCR特异性引物,制备spvC基因缺陷性同源性核苷酸片段,导入自杀质粒pCVD442后再导入鼠伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为spvC基因的缺陷变异株,并通过核苷酸序列分析加以确定。结果： PCR及序列分析证实,缺陷变异株的spvC基因缺失711个碱基。结论： 成功构建鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株,为进一步研究其在鼠伤寒沙门菌中的功能奠定了基础。     

伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能研究

目的:探讨伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能.方法:用载体pBAD介导回补uhpA至伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株,用qRT-PCR观察cysM和treB基因表达,用表达载体pET-22b原核表达UhpA蛋白,用凝胶阻滞试验观察UhpA蛋白与cysM和treB启动子区域DNA片段的结合.结果:成功构建pBADuhpA重组质粒,在uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因后,cysM和treB的表达明显恢复,但UhpA-His6蛋白与cysM和treB的启动子区域DNA片段无明显结合.结论:伤寒沙门菌UhpA在高渗应激条件下能促进硫代谢及海藻糖代谢相关基因表达,且可能为间接作用.     

非编码小RNA T64对伤寒沙门菌基因表达的影响

目的: 对由转录组测序获得的伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)非编码小RNA(small non-coding RNA,snRNA)T64的表达进行验证,并对其功能进行初步探讨。方法: 选取特异性引物采用反转录PCR(RT-PCR)和普通PCR确认T64在S.Typhi中的表达;将含有T64 snRNA序列的重组质粒导入S.Typhi野生株构建T64高表达株;结合应用S.Typhi全基因组芯片分析技术,比较S.Typhi T64高表达株和空载体对照株在对数期基因表达谱差异,并对部分基因芯片结果进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。结果：RT-PCR结果显示,snRNA T64在S. Typhi确有表达;基因芯片分析结果显示,与空载体对照株比,snRNA T64高表达株在对数期有20个基因表达上调,7个下调;4个被选基因表达的qRT-PCR结果与芯片分析结果相符。结论： snRNA T64在S. Typhi中表达,可能在基因的表达调节中发挥重要作用。     

伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株的制备

目的:为深入研究伤寒沙门菌调节因子phoP的功能,制备伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株.方法:根据伤寒沙门菌phoP基因序列,设计PCR特异性引物,并在5′末端加接酶Bgl Ⅱ位点,PCR扩增phoP基因上、下游片段后,用Bgl Ⅱ消化,再定向连接成phoP基因的缺损性同源性核苷酸片段.将此片段胶回收后并导入自杀质粒pGMB151的BamH Ⅰ位点,将阳性质粒用电转化导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组.用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为phoP基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定.结果:PCR及序列分析证实,缺陷变异株的phoP基因缺失297个碱基.结论:成功构建伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础.