间充质干细胞来源的胞外囊泡的研究进展

胞外囊泡(EVs),曾经被误认为是细胞垃圾碎片,近年来越来越多的研究发现它在细胞间信号传递中起着至关重要的作用,它通过介导配体-受体反应或传递胞质成分(蛋白、mRNA和microRNA)等方式与靶细胞发生联系而引起越来越多的关注。近年来研究发现间充质干细胞(MSCs)来源的EVs在多种疾病中发挥着重要的生物学作用,有可能成为替代干细胞治疗的新型物质。随着对EVs研究的深入,将来有望利用其特有的作用方式阐述疾病的发生、发展并研发新型的药物载体,达到诊断和治疗更多疾病的目的。现就EVs的生物学特性、与靶细胞的作用方式及MSCs来源的EVs在多种疾病中的治疗作用的研究进展做一综述。     

人脐带间充质干细胞源胞外囊泡对屋尘螨诱导的哮喘小鼠气道炎症的影响

目的:探讨人脐带间充质干细胞源胞外囊泡(human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles, hUCMSC-EVs)对屋尘螨(house dust mite, HDM)诱导的哮喘小鼠气道炎症的影响。方法:超高速离心法提取hUCMSC-EVs;透射电镜观察hUCMSC-EVs形态;蛋白质印迹法检测胞外囊泡标志物肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)和热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)表达。将15只雌性BALB/C小鼠随机均分为3组,每组5只,分别为对照组(不做任何处理)、HDM组(HDM处理)和HDM+EVs组(HDM+hUCMSC-EVs处理);苏木精-伊红(HE)和过碘酸-雪夫(PAS)染色法分别观察各组小鼠肺脏气道炎性细胞浸润和杯状细胞化生;收集各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)并对总细胞和嗜酸性粒细胞进行计数;ELISA法检测BALF中IL-4和IL-13含量;蛋白质印迹法检测肺脏中E-钙...     

间充质干细胞来源的胞外囊泡在肺纤维化治疗中研究进展

肺纤维化是各种不同病因的间质性肺疾病的共同结局,严重影响肺功能,可导致低氧血症,呼吸困难,甚至呼吸衰竭及死亡。其高发生率和病死率加重了卫生经济负担。目前临床药物治疗存在选择少、费用高、部分患者疗效差等情况。间充质干细胞治疗在肺纤维化中具有很好的疗效,由于移植率低、易堵塞和致癌的危险等,它们面临着许多临床争议。间充质干细胞来源的的胞外囊泡(MSC-EVs)是一种天然、高效的运输载体,具有促血管生成、抗凋亡、抗纤维化、免疫调节和一定的增殖再生功能。而且作为一种膜结构,MSC-EVs具有免疫原性低、半衰期长、体内稳定性好、传递效率高等优点,是一种比干细胞治疗更安全、更有效的新型非细胞生物治疗方法。本文将主要介绍MSC-EVs治疗肺纤维化的相关作用机制,此综述结果将为肺纤维化的治疗提供新的研究方向。     

中性粒细胞上清液对人脐带间充质干细胞迁移的影响

目的:探讨中性粒细胞上清液和人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养后,对MSCs迁移的影响,为MSCs更好地应用于炎症性疾病的治疗提供理论依据.方法:分离脐血中性粒细胞,UC-MSCs和中性粒细胞按不同比例共培养后,提取中性粒细胞上清液,UC-MSCs单独培养的为对照组(1:0),UC-MSCs在不同浓度的中性粒细胞上清液中进行培养的为实验组,选择18 h和40 h作为培养时间,根据四甲基偶氮唑盐(MTT)的实验结果,选择具有统计学意义的1:0、1:1、1:50分组和18 h作为实验对象,采用划痕的方法观察24 h内不同时间点MSCs的迁移情况.结果:划痕实验观察到1︰50实验组细胞的迁移较1:0和1:1实验组明显增快.结论:高浓度的中性粒细胞的上清液促进人脐带MSCs的迁移.     

人脐带间充质干细胞裂解液在体外对食管癌EC9706细胞增殖与迁移的抑制作用

目的探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)裂解液在体外对食管癌EC9706细胞增殖、迁移的抑制作用。方法用组织块培养法体外培养hUCMSCs,流式细胞仪检测细胞表型;收集hUCMSCs,并用反复冻融法制备hUCMSCs裂解液;不同浓度hUCMSCs裂解液作用于食管癌EC9706细胞一定时间,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖状况,倒置显微镜观察细胞形态。通过Tranwell迁移实验观察hUCMSCs裂解液对食管癌EC9706细胞迁移能力的影响。结果人脐带组织块培养7¹2 d后可见贴壁的成纤维样细胞,流式细胞仪分析显示第5代细胞均表达CD29、CD90和CD166,不表达CD34、CD45和人类白细胞抗原-DR。MTT法显示加入hUCMSCs数等于或大于食管癌细胞数的裂解液时,与对照组比较明显抑制食管癌细胞的生长(P<0.05),且实验组各组抑制食管癌细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05)。Tranwell迁移实验显示,实验组EC9706细胞的迁移较对照组明显受到抑制(P<0.05)。结论 hUCMSCs裂解液对食管癌细胞EC9706的增殖和迁移均有抑制作用。     

间充质干细胞及其来源的细胞外囊泡在类风湿关节炎中的研究进展

类风湿关节炎(RA)为一种常见的自身免疫性疾病,严重时会导致关节畸变甚至致残,其对生活造成的不便常使患者产生巨大的精神压力。目前,关于RA的治疗主要基于相关药物及理疗以缓解症状,但其花费大且不良反应明显。细胞外囊泡(EVs)是细胞间交流的重要媒介,可表达多种表面受体,并携带生物活性蛋白、信使RNAs、微RNAs和脂质等。所有细胞均可分泌EVs,其参与各种生物学过程,包括组织稳态平衡的调节和疾病的病理生理过程等。而间充质干细胞来源的EVs重现了亲代细胞的主要功能,其通过免疫调节、促进组织细胞修复及再生作用等发挥治疗作用,可能成为治疗RA的重要手段,但目前其在RA的研究还基于动物模型,未来需进一步的临床试验证实。     

人脐带间充质干细胞对肝癌细胞增殖性及凋亡的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchyma cell, MSC)对肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)癌细胞增殖和凋亡的影响,为HCC的治疗提供新的思路。 方法 取50%覆盖率的MSC培养皿,换上新鲜的DMEM/F-12培养基,待其培养至100%的覆盖率后收集培养基备用,即为MSC条件培养基。用新鲜DMEM/F-12培养基加上等量的MSC条件培养基的混合培养基培养HepG₂人类肝癌细胞株24、48和72h,使用MTT法测定HepG₂细胞的增殖活性、通过Hoechest33342和PI双染色后在荧光倒置显微镜下观察计数以测定HepG₂细胞的凋亡、用Transwell侵袭实验和黏附实验测定HepG₂细胞侵袭能力以及通过Western blot法检测凋亡相关信号通路蛋白的表达。 结果 混合培养基培养HepG₂细胞24h后,对其生长和凋亡及侵袭黏附能力没有显著影响(P>0.05)。但是培养延长到48h和72h后,HepG₂细胞的活性、增殖能力、侵袭能力和黏附能力都受到显著的抑制,这些变化伴随着细胞分裂相关因子Ki-67、PCNA和组蛋白H3磷酸化水平下调,以及细胞凋亡执行者caspase-3的激活和抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制。 结论 体外间接共培养实验表明,人脐带间充质干细胞具有抑制肝脏肿瘤细胞增殖及促进其凋亡的作用。     

脐带间充质干细胞对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)抑制人卵巢癌SKOV3细胞增 殖及促进其凋亡的作用。方法：采用Transwell共培养观察UC-MSCs向卵巢癌细胞靶向归巢的作用;MTT 实验检测UCMSCs 条件培养基抑制SKOV3细胞增殖情况;Annexin V-FITC/PI双染法检测其凋亡率;实时PCR检测与SKOV3细胞增殖 和凋亡相关基因Ki-67,Bax,Bcl-2的表达。结果：UC-MSCs体外向SKOV3细胞靶向归巢。MTT 结果显示UC-MSCs条件 培养基明显抑制SKOV3细胞的增殖(P<0.01)。Annexin V-FITC/PI双染法提示75%条件培养基组的凋亡率明显高于对照 组(P<0.05)。实时PCR发现增殖相关基因Ki-67的表达明显下降(P<0.01),凋亡相关基因Bcl-2的表达明显降低(P<0.01), Bax的表达明显增加(P<0.01)。结论：UC-MSCs体外能向卵巢癌细胞靶向归巢,通过调节增殖相关基因Ki-67的表达, 抑制SKOV3细胞增殖;通过调节凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达,促进SKOV3细胞凋亡。     

人脐带间充质干细胞过敏性试验

目的：观察人脐带间充质干细胞对豚鼠的过敏性反应,为临床使用人脐带间充质干细胞的安全性提供参考。方法：培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液。将30只豚鼠分成3组,分别是模型1组、模型2组和对照组。2个模型组隔日肌注细胞生理盐水混悬液3次,实验1组于首次注射后第14天,实验2组于首次注射后第21天分别静脉注射混悬液进行攻击。观察动物有无过敏反应症状。结果：动物无明显过敏反应症状,反应级数为0级。结论：人脐带间充质干细胞免疫原性低,不易导致过敏反应。     

人脐带间充质干细胞促进肝癌细胞的增殖和转移

目的:研究人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UC－MSCs)在体内?体外实验中对人肝癌细胞株HepG2的增殖和转移作用?方法:将UC－MSCs在无血清DMEM/F12培养基中培养48 h,收集上清液(MSCs－CM)?加入到HepG2的培养基中,使其在HepG2培养基的终浓度为25%?50%和75%作为实验组,DMEM/F12作为对照组,采用CCK－8法检测细胞增殖效应?其后使用Transwell法检测细胞的侵袭效应?建立裸鼠皮下肿瘤模型,健康雌性裸鼠12只随机分为A(HepG2细胞单/左侧皮下成瘤)?B(UC－MSCs+HepG2预混单/左侧皮下成瘤)?C(左侧HepG2?右侧UC－MSCs+HepG2皮下成瘤)3组(n = 4),每隔7 d监测成瘤体积变化,50 d后统一处死称量肿瘤湿重?结果:经各浓度MSCs－CM 处理后HepG2细胞增殖能力较对照组明显增高(P < 0.05);实验组侵袭能力明显高于对照组(P < 0.01)?50 d后皮下肿瘤湿重测得A组(0.054 2 ± 0.011 2)g?B组(0.292 0 ± 0.156 9)g?C组[左侧(0.089 4 ± 0.024 2)g?右侧(0.332 6 ± 0.102 9)g],并且从定期体积测量数据发现,两组体积的差异随着时间的推移逐渐增大(P < 0.05)?结论:UC－MSCs能促进HepG2的生长和转移,并且这种对肿瘤的增殖和侵袭促进作用可能与UC－MSCs分泌的一些因子有关?     

炎症微环境中脐带干细胞外泌体对牙周膜干细胞增殖和迁移的影响

背景 在炎症微环境中牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的生物活性受到抑制是牙周再生困难的重要原因.脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)来源外泌体(exosome,Exo)具有与UCMSCs相...     

Human umbilical cord mesenchymal stem cells and the treatment of spinal cord injury

Objective To review the recent studies about human umbilical cord mesenchymal stem cells （hUCMSCs） and advances in the treatment of spinal cord injury. Data sources Published articles （1983-2007） about hUCMSCs and spinal cord injury were selected using Medline. Study selection Articles selected were relevant to development of mesenchymal stem cells （MSCs） for transplantation in spinal cord injury therapy. Of 258 originally identified articles 51 were selected that specifically addressed the stated purpose. Results Recent work has revealed that hUCMSCs share most of the characteristics with MSCs derived from bone marrow and are more appropriate to transplantation for cell based therapies. Conclusions Human umbilical cord could be regarded as a source of MSCs for experimental and clinical needs. In addition, as a peculiar source of stem cells, hUCMSCs may play an important role in the treatment of spinal cord injury. Chin Med J 2009;122（2）：225-231     

脐带间充质干细胞对小胶质细胞增殖及活化的影响

目的 观察人脐带来源的间充质干细胞(hUC-MSCs)在正常环境和炎症环境下对小胶质细胞活化的调节作用,探讨hUC-MSCs对中枢神经系统炎症反应的免疫调节作用。 方法 将BV2细胞与人脐带间充质干细胞来源的条件培养基(hUC-MSCs-CM)和(或)脂多糖(LPS)共培养24或48 h后利用MTT比色法分析BV2增殖活力的变化,ELISA试剂盒分析BV2细胞上清中TNF-α和IL-6的变化,免疫印迹法检测精氨酸酶1(Arg1)的表达, Real-time PCR分析TNF-α、IL-6、ARG1基因的表达水平。 结果 (1)BV2在LPS长程刺激下表现出明显的增殖效应,而hUC-MSCs-CM可以抑制这种增殖反应;(2)炎症刺激诱导BV2表达TNF-α和IL-6明显增多,而在hUC-MSCs-CM和LPS共刺激时TNF-α和IL-6表达明显低于LPS单刺激组;(3)hUC-MSCs-CM共培养组BV2细胞高表达M2型小胶质细胞标志物Arg1。 结论 脐带间充质干细胞抑制炎症所致的小胶质细胞增殖;脐带间充质干细胞通过旁分泌机制调节小胶质细胞向M2型活化,降低促炎因子表达,这可能是其最终发挥神经保护作用的机制之一。     

人脐带间充质干细胞来源外泌体促进小胶质细胞向M2极化

目的: 探讨人脐带间充质干细胞外泌体（human umbilical cord mesenchymal stem cells exosomes, hucMSC-Ex）在小胶质细胞极化态转化中的作用及机制,为临床治疗神经退行性疾病提供新的治疗策略。方法: 原代分离培养人脐带间充质干细胞,收集其条件培养基提取外泌体（exosomes）,电镜、纳米颗粒跟踪分析技术和蛋白质印迹法对其形态特征、粒径大小及表面标志物进行表征;分别用PBS、LPS（1 μg/mL）、LPS（1 μg/mL）+hucMSC-Ex（100 μg/mL）处理小胶质细胞12 h,免疫荧光检测小胶质细胞特异性标志物钙结合蛋白Iba1的表达;蛋白质印迹法检测小胶质细胞M1/M2极化态标志物变化;qRT-PCR检测小胶质细胞IL-1β mRNA和IL-10 mRNA的变化;ELISA检测细胞条件培养基中细胞因子IL-1β和IL-10的分泌量。结果： hucMSC-Ex电镜下呈现典型膜性“杯盘”状结构,纳米颗粒跟踪分析结果显示粒径大小为（119.7±47.9）nm,蛋白质印迹法证实其表达CD9、CD63和CD81特征表面分子;免疫荧光结果显示,活化组（LPS组和LPS+hucMSC Ex组）钙结合蛋白Iba1相比于静息组（PBS组）表达高,且LPS+hucMSC-Ex组高于LPS组;蛋白质印迹法结合qRT-PCR结果显示hucMSC-Ex可能通过抑制NF-κB活化减少M1极化态标志物iNOS、IL-1β表达,上调M2极化态标志物Arg1、IL-10表达;ELISA结果表明相比于LPS组,LPS+hucMSC-Ex组分泌的炎症因子IL-1β减少、抑炎因子IL-10增加。结论： hucMSC-Ex可能通过抑制NF κB活化,促进小胶质细胞向M2极化而减少炎症反应。     

血小板衍生生长因子对人脐带间充质干细胞胞外基质的影响

目的 探讨血小板衍生生长因子(PDGF)对人脐带间充质干细胞(UCMSCs)增殖和细胞外基质(ECM)表达的影响及其可能的作用机制。方法 体外传代培养UCMSCs,分为对照组和实验组,其中对照组不加PDGF,实验组分别加入不同质量浓度(2、5、10、20、50μg/L)的PDGF。加入PDGF 12h后,用qRT-PCR法检测ECM基因和凋亡相关基因(Bcl 2、Bax)的表达;加入PDGF 24h后,用四甲基偶氮唑(MTT)法检测细胞增殖。结果 与对照组比较,随着PDGF质量浓度的增加,反映细胞代谢活性的OD值逐渐增加,且PDGF质量浓度在20μg/L时达到最高值,但PDGF质量浓度为50μg/L时OD值反而降低;PDGF质量浓度为2μg/L时,ECM表达和Bcl 2/Bax比值较对照组有所降低,随着PDGF质量浓度的增加,ECM的表达和Bcl 2/Bax比值呈现先增高后降低的趋势,且在10μg/L时达到最高值。 结论 PDGF可以促进脐带间充质干细胞的增殖,同时能促进其ECM的表达,还能提高细胞耐受凋亡的能力,最佳作用质量浓度为10μg/L。     

脐血来源富血小板血浆对脐血间充质干细胞增殖的影响

目的:初步探讨脐血来源富血小板血浆促进脐血间充质干细胞增殖及增殖最佳浓度。方法:收集足月健康剖宫产新生儿脐带血,采用组织块培养法进行脐血间充质干细胞的分离培养;采用二次离心法提取脐血富血小板血浆。用ELISA方法检测富血小板血浆中转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1。富血小板血浆联合10%胎牛血清培养脐血间充质干细胞,根据富血小板血浆中的TGF-β1浓度将实验分为6组:2 000 pg/ml组、1 000pg/ml组、750 pg/ml组、500 pg/ml组、250 pg/ml组、10%胎牛血清组。脐血间充质干细胞接种在96孔板,连续培养7d,分别在1、3、5、7 d用CCK8试剂盒测定不同浓度富血小板血浆对脐血间充质干细胞的增殖影响,统计分析,选出最佳浓度。结果:不同浓度富血小板血浆联合10%胎牛血清培养脐血间充质干细胞呈现不同的增殖速度,500~1 000pg/ml组明显优于其他浓度组,第5天开始差异有统计学意义(P<0.05)。结论:富血小板血浆可提高脐血间充质干细胞的增殖活性,且呈剂量依赖性。     

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的...