我国鸡源H9N2亚型禽流感病毒NS基因的分子进化分析

目的为了明确国内鸡群中H9N2亚型AIV中非结构蛋白(NS)基因系统进化情况,对1998-2008年间分离自发病鸡群中的14株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)进行了非结构蛋白(NS)基因的克隆和序列测定,得到了NS1和NS2蛋白的完整编码序列。将NS核甘酸序列及推定的氨基酸序列与GenBank中已有的参考序列作比对,结果14株AIV的NS基因同源性在92.9%～99.9%,在系统进化上均属于NS基因A等位基因群中的A/Chicken/Beijing/1/1994分支。综合已有的研究结果,表明尽管A/Quail/Hongkong/G1/1997分支和A/Duck/Hongkong/Y439/1997分支的NS基因曾偶尔传入鸡群,但并未在我国鸡群中建立稳定的亚系。国内的H9亚型AIV的NS基因仅稳定存在着A/Chicken/Beijing/1/1994分支。     

石蜡切片研究H9N2亚型禽流感病毒的免疫原性

目的 用石蜡切片评估龠流感病毒A／Chicken／Guangdong／SS／94(H9N2)株的免疫原性，以获得免疫原性良好的疫苗候选株。方法 以A／CKcken／Guangdong／SS／94(H9N2)株为抗原制备油乳剂灭活疫苗免疫1Od龄SPF鸡，免疫21d后，以该毒株静脉注射免疫组与非免疫对照组，定期剖杀试验鸡并取脑、心肌、肺、胰腺、肝、肾、脾、气管和法氏囊等组织用石蜡切片进行病理组织学检查。结果 两组试验鸡的的病理组织学变化有明显差异，免疫组试验鸡获得保护，而对照组病变明显。结论 A／CKcken／Guangdong／SS／94(H9N2)株的免疫原性良好，可作为制备油乳剂灭活疫苗的候选株。     

2014-2019年中山市H9亚型禽流感监测及病例特征分析

目的 分析中山市H9亚型禽流感病毒外环境监测情况及人感染H9N2禽流感病例特征,指导H9N2禽流感防控工作.方法 2014-2019年采集监测镇区内的禽类批发市场、活禽销售市场和生鲜禽销售市场3类交易场所的外环境标本进行禽流感病毒核酸检测,并对人感染H9N2禽流感报告病例进行流行病学分析.结果 共采集和检测外环境标本9...     

H9N2亚型禽流感病毒纤突蛋白基因的分析

目的　克隆禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ / 99(H9N2 )纤突蛋白血凝素基因和神经氨酸酶基因 ,并与同一亚型不同毒株的病毒进行比较。方法　本研究以自行设计的引物 ,一次性成功地扩增出KMⅢ毒株HA和NA全长基因cD NA ,并将它们克隆和测序。以获得的核苷酸序列和氨基酸序列与其它毒株的HA蛋白和NA蛋白比较。结果　HA基因由16 83bp组成 ,编码 5 6 0个氨基酸 ;NA全基因为 14 0 7bp、编码 4 6 9个氨基酸残基 ;HA1羧基端的氨基酸组成是 :R -S -S -R ,符合低致病力毒株的分子特征。它们的氨基酸组成虽有差异 ,但与血凝素和神经氨酸酶功能关系密切的氨基酸残基却高度保守。联机检索表明 ,KMⅢ的HA基因cDNA与其它H9N2亚型HA基因最大同源性在 82 %～ 96 %之间。NA基因cDNA与其它H9N2亚型NA基因的最大同源性在 88%～ 97%之间。结论　我们首次克隆和测序了KMⅢ毒株的HA基因和NA基因 ,并对它们进行了分析     

2007--2008年上海市H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化

目的对分离自上海活禽批发市场的11株H9N2亚型AIV（2007年5株、2008年6株）进行了PB2,PBl,HA,NP和NA的测序,以阐明2007年至2008年上海地区H9N2亚型禽流感病毒分离株的遗传变异及分子特征。方法采集鸡气管和泄殖腔样品,将H9亚型荧光RT—PCR试剂盒检测的阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定HA亚型,通过RT-PCR方法分别扩增了这11个毒株的PB2,PBl,HA,NP和NA并进行了序列测定。结果对HA基因进行遗传发生关系分析,这11株分离株均属于Ck／Bei／1／94系。这11个毒株的5个片段的组成有两种方式。结论上海活禽批发市场的1l株H9N2亚型AIV毒株中已包含了H5的片段,所以在今后的工作中加强H9N2亚型禽流感流行病学监测是非常必要的。     

2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型禽流感病毒分子特征和遗传进化分析

目的 分析2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型禽流感病毒的分子特征和遗传进化特点,为禽流感防控提供参考依据。方法 对2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型单阳性标本进行复核,筛选出Ct值小于30的标本,对HA和NA基因进行靶向扩增和二代测序,从NCBI和GISAID数据库下载参考序列,使用生物信息学软件分别对HA和NA基因进行分子突变位点和遗传进化分析。结果 共完成12株H5亚型HA和NA全基因测序。序列比对结果显示,HA基因最高一致性在98.59%～99.89%,NA基因最高一致性在98.19%～99.85%。遗传进化分析显示,HA基因归属于Clade 2.3.4.4h分支,NA基因归属于欧亚谱系H5N6和H6N6分支。12株毒株的裂解位点均为高致病性禽流感病毒分子特征,受体结合位点为禽源受体,但S123P、S133A、I151T、T156A突变可增强病毒与人源受体的亲和力。HA基因糖基化位点分析显示,常见154位糖基化位点缺失,在124位(-NHTS)新增潜在糖基化位点。结论 2018-2019年福建省禽类外环境中存在Clade 2.3.4.4h进化分支H5N6高致病...     

黑龙江省活禽市场6株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析北大核心CSCD

目的了解2018年黑龙江省活禽市场H9N2亚型禽流感病毒变异特点和进化规律。方法采集黑龙江省禽流感监测点活禽市场的环境标本进行H9N2亚型的核酸检测,阳性标本进行病毒分离,对分离的禽流感病毒毒株进行全基因组序列测定,应用生物信息学软件分析其基因特征。结果 6株H9N2亚型禽流感病毒HA基因裂解位点附近氨基酸序列均为PSRSSRGLF,符合典型低致病性禽流感病毒基因的特征,HA蛋白受体结合位点第226位Q→L,具有与α-2,6唾液酸受体亲和力增强的特性,第183位突变为天冬酰氨;NA蛋白中63-65位茎部全部缺失,使病毒的生长受到抑制,在3个可能的血凝素结合位点中,6株病毒发生变异(368N,369G,402D);另外,HA和NA基因潜在糖基化位点也存在增加或缺失的现象;与参考序列相比,PB1、PB2蛋白有3处发生突变,增强了病毒的致病性;M2蛋白发生V27G和S31N突变,对金刚烷类药物产生耐药;NP和NS基因在几个关键位点上均未发生变异。遗传进化分析显示,6株H9N2亚型禽流感病毒在NA、M和NP基因中相似度更高,HA、NA基因位于Y280/97-like分支,PB2、M基因位于G1/97-like分支,PB1、PA、NP和NS基因均位于F/98-like分支。结论 6株H9N2亚型禽流感病毒发生了3配体重组,可能成为高致病性禽流感病毒H5、H7亚型部分基因的供体。因此,应加强对H9N2亚型禽流感病毒的监测,密切关注其变异情况及重组趋势。     

微载体规模化培养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研究

目的探索H9N2亚型禽流感病毒株(A/Chiken/NX/9/99)在微载体大规模培养的MDCK细胞中的增殖规律,确定最佳增殖条件。方法将H9N2亚型禽流感病毒株接种到生长在24孔培养板上的MDCK细胞中进行增殖试验,检测接种不同感染剂量病毒、添加不同浓度TPCK-胰酶、在不同pH值的培养液中培养,接毒后不同时间的病毒血凝素滴度(HA)。根据最佳增殖条件将病毒接种至生长在微载体上的MDCK细胞中,利用250 mL和5L转瓶逐级进行大规模增殖。结果最佳病毒增殖条件为TPCK-胰酶终浓度为10μg/mL,接毒剂量为MOI=0.025,培养液pH值为7.4,在此条件下,H9N2亚型禽流感病毒株(A/Chiken/NX/9/99)适应在250 mL和5L转瓶中微载体培养的MDCK细胞内大量增殖,病毒的最高血凝价均可达到9log2(1∶512)。结论本研究为以哺乳动物细胞为基质规模化生产禽流感疫苗奠定了基础。     

长沙市首例人感染H9N2禽流感病毒的HA基因序列特征分析

目的对长沙市首例人源H9N2禽流感病毒进行病毒分离与HA基因特征序列分析。方法用细胞培养法在可疑病例标本中分离H9N2禽流感病毒毒株,RT-PCR方法扩增禽流感病毒HA基因全长并测序,对所得结果进行氨基酸同源性与进化树分析。结果分离的毒株命名为A/Hunan/44558/2015,GenBank登录号为KX595338。毒株存在2处新发突变位点,HAT197D、HAD483N,第313位出现与湖南省人源H9N2毒株A/Lengshuitan/11197/2013相同的糖基化位点NCS。与A/Wild Chicken/Shanghai/C1/2014和A/Environment/Hunan/28028/2014的同源性分别为97.9%和97.6%。进化树分析分离的毒株处于Y280分支。结论发现病毒2处新的基因突变位点,与2014年湖南省环境源毒株同源性较高,存在基因交换重组,从分子水平揭示病毒HA基因的进化趋势。     

2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA及NS基因进化分析

目的 分析2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)及非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进化特征.方法 从2014年长沙市活禽市场采集501份环境标本,利用Real-time PCR方法进行A型、H5、H7和H9亚型流感病毒核酸检测,并对单一H5阳性标本进行核苷酸测序,病毒HA、NA和NS基因测序结果进行在线BLAST分析,利用Mega5和Bioedit软件构建核苷酸进化树和氨基酸(Amino acids,aa)比对.结果 从501份环境标本中检出A型H5亚型病毒阳性标本177份(检出率35.33％),其中8份标本经核苷酸测序鉴定为H5N1亚型病毒,进化分析表明大部分H5N1病毒HA基因位于2.3.2分支内,聚集形成一个新亚分支,NA及NS基因位于2.3.2.lb亚分支.HA蛋白受体结合位点aa为QSG,表现为禽流感病毒受体特征;NA蛋白未出现H275Y及N295S aa替换,对神经氨酸酶抑制剂敏感;HA、NA及NS蛋白关键分子位点表现为高致病性的分子特征.结论 2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA和NS基因表现为高致病性的分子特征,但不具有对人易感的受体特征,需要进一步监测.     

活禽交易市场短期休市措施对控制市场H7N9病毒污染效果的评价

目的评估活禽交易市场短期休市措施对降低市场H7N9禽流感病毒污染及人感染H7N9发病的成效。方法收集整理2014年2月至2017年5月,中山市活禽交易市场短期休市信息、市场环境H7RT-PCR检测数据,及人感染H7N9发病数据。RRX=休市后第X周市场环境H7样本阳性率/休市前1周阳性率×100%。结果共实施3轮短期休市。第一轮:2014年2月10日至23日,期间周边地市未同步休市。恢复交易后,环境阳性率持续上升,RR1=0.40(95%CI:0.28-0.59),RR3=0.63(95%CI:0.32-1.24),RR4=0.83(95%CI:0.48-1.46),2015年5月份报告2例人感染H7N9病例。第二轮:2015年2月19日至28日,全省统一部署,周边地市同步休市。恢复交易后,环境阳性率持续维持在10%以下,RR1=0.15(95%CI:0.07-0.34),RR2=0.21(95%CI:0.10-0.41),RR3=0.03(95%CI:0.00-0.18),RR4=0.10(95%CI:0.04-0.27),该流行季未再报告病例。第三轮:2017年1月8日至21日,期间周边地市未同步休市。恢复交易后,环境阳性率持续上升,RR1=0.25(95%CI:0.09-0.68),RR3=0.37(95%CI:0.14-1.00),RR4=1.07(95%CI:0.54-2.11),2017年2月报告2例人感染H7N9病例。结论单个城市的短期休市,即使时间长达2周,一旦恢复交易,市场环境阳性率迅速上升,人感染发病的风险再次增加;区域性多个城市同步休市,市场环境阳性率能持续维持在低水平,极大地减少人感染发病的风险。     

2014-2016年广东省肇庆市人感染H7N9禽流感病毒基因组特征分析

目的 了解广东省肇庆市2014-2016年人感染H7N9禽流感病毒基因进化特征.方法 对肇庆市17例H7N9患者咽拭核酸直接进行8节段基因序列扩增与测定,用BioEdit5.0、MEGA6.0进行同源性和重要氨基酸位点分析,采用Neighbor-Joining法构建进化树,参比序列从GenBank下载.结果 7份H7N9病例标本获得8节段全基因序列,HA与A/chicken/Dongguan/695/2014 (H7N9)相似度最高,NA与A/ chicken/Dongguan/1075/2014 (H7N9)相似度最高;内部基因与2013-2014年广东东莞、深圳禽源H7N9及H9N2相似度较高.HA和NA基因与广东省东莞、广州、深圳等地市的H7N9序列同处于珠三角进化分支,与安徽、浙江、江苏等长三角分支的序列相似性低.HA蛋白受体结合位点发生G186V、Q226L变异,裂解位点序列均为PEIPKGR↓ GLF,含有2个碱性氨基酸;M2蛋白上发现耐药位点S31N,PB2蛋白上发现E627K突变,NA蛋白上未发现耐神经氨酸酶的位点变异.结论 肇庆市人感染H7N9病毒株可能来源于2013 2014年广东省珠三角地区禽源H7N9和H9N2,G186V、Q226L和E627K位点变异增强了对人的易感性.     

福建省人感染H5N6禽流感病毒与外环境禽流感病毒相关性分析

目的 分析福建省外环境H5亚型禽流感病毒分布情况及与人感染H5N6禽流感的关系,为人感染禽流感的科学防治提供依据。方法 收集2013-2017年福建省外环境常规监测标本信息,进行统计分析。从数据库下载相关禽流感病毒基因序列,进行基因同源性比对和系统进化分析。结果 外环境监测结果统计分析显示:2013-2017年共采集样本4 903份,H5亚型阳性率为4.24%,且不同的网络实验室(χ²=101.033)、监测场所(χ²=45.526)、标本类型(χ²=31.751)和季节(χ²=48.174)阳性率均存在统计学差异(P<0.05)。福建省首例人感染H5N6禽流感(A/Fujian-Sanyuan/21099/2017)病毒全基因序列与6株福建省外环境H5N6病毒的同源性在85.1%~98.5%,与病家院中采集的1株加强监测外环境标本的HA和NA基因同源性分别为100.0%和99.9%。系统进化分析显示:福建省人感染H5N6病毒HA基因与加强监测的外环境H5N6病毒的进化距离最近,与其余6株距离较远,处在不同的进化分枝中,其基因源于H5N8病毒;而NA基因则与7株外环境H5N6病毒的进化距离较近,源于H5N6病毒。结论 福建省冬春季外环境中禽流感活动较为活跃,应加强活禽交易市场的卫生管理工作。福建省发现的首例人感染H5N6禽流感与外环境禽流感病毒的重配可能存在一定的相关性。     

成都市首例人感染H9N2禽流感病例调查与分析

目的总结分析成都市首例人感染H9N2禽流感病例流行病学调查结果,为今后科学应对类似疾病提供参考。方法采用现场流行病学和实验室检测相结合的方法,收集病例临床和流行病学资料,采集并检测病例、相关环境等标本,分析可能的感染来源、流行病学特征和临床特征。结果病例发病前10天内有禽类接触史,其标本经检测为H9N2禽流感病毒阳性;病例长期患有慢性疾病,此次发病后进展较快,经积极治疗无效后死亡;其居住环境、家中剩余鸡肉和周边市场检出H9禽流感阳性。结论该病例感染来源为周边市场感染H9N2禽流感病毒的鸡;对严重基础疾病者,感染H9N2禽流感病毒可导致重症或诱发死亡。     

广州市人感染H7N9禽流感病毒高致病性变异株监测与基因进化分析

目的 通过对广州市人感染H7N9禽流感病毒高致病性变异株基因变异和进化特点进行分析,掌握本地区H7N9病毒病原学特点,为疾病防控提供参考。方法 选取2017年广州市人感染H7N9禽流感病毒阳性标本10份,提取核酸扩增HA、NA、M基因进行测序,通过生物信息学软件分析病毒重要蛋白突变情况和遗传进化特点。结果 广州地区H7N9禽流感病毒基因同源性差异较大,大部分毒株基因与广东毒株同源性最高,部分毒株基因与河南、内蒙古等地毒株同源性最高。监测到5株病毒为H7N9禽流感病毒高致病性变异株,部分病毒出现了HA蛋白Q226L的突变,提示对人呼吸道上皮细胞SAα-2, 6Gal受体结合能力增加。HA蛋白和NA蛋白上糖基化位点均有一定的增加和缺失突变。HA、NA和M1蛋白上毒力相关位点均突变增强。M2蛋白均呈现耐药突变,同时监测到2株高致病性突变株出现对神经氨酸酶抑制剂的耐药突变。遗传进化结果显示,HA基因和NA基因在华南和华东分支均有分布,M1基因进化特点相对复杂,分别与华南地区H9N2、H7N9病毒,及北方地区的H7N9病毒重组。结论 2017年广州地区发现2株对达菲耐药的人感染H7N9禽流感病毒高致病性变异株。H7N9禽流感病毒在广州地区不断发生进化重组,具有遗传多样性和复杂性,提示高致病性耐药株有向华南以外地区传播的风险。