淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4家族新成员基因克隆及序列分析

目的　获取淡色库蚊CYP4家族新基因。　方法　根据CYP4氨基酸保守序列设计一对简并引物 ,采用RT PCR的方法 ,从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系四龄幼虫总RNA中扩增出与设计相符的基因片段。利用T/A克隆方法 ,将获得的基因片段克隆入 pGEM Teasy载体 ,经PCR鉴定重组成功 ,测序并进行比对。　 结果　共克隆出 3 6个阳性克隆 ,将其中 9个随机挑取的阳性克隆测序及同源性分析 ,表明为CYP4家族中 9个新的cDNA序列 ,由GeneBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定 ,属CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。为进一步研究细胞色素P45 0的多样性及其与抗药性的关系打下基础。　结论　克隆 9个淡色库蚊基因部分序列 ,被鉴定属于CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。     

淡色库蚊细胞色素P450 CYP4E2r6基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆并表达鉴定淡色库蚊细胞色素P450(CYP4E2r6)基因。方法根据昆虫细胞色素P450氨基酸保守序列设计一对简并引物，采用RT—PCR，从淡色库蚊四龄幼虫mRNA中扩增出目的基因片段。产物经T—A克隆、测序、比对，在抗性品系高表达的CYP4E2r6亚克隆入原核表达载体pGEX-6P1，在大肠杆菌BL21中进行原核表达。将细菌总蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果14个阳性克隆中9个为CYP4新序列，由GenBank登录上网(GenBank／NCBI CB074944—51、CB270837，2003年)；经鉴定属CYP4家族CYP4H、CYP4E、CYP4J亚家族；CYP4E2r6基因已成功表达。结论获得的CYP4E2r6融合表达蛋白为进一步研究CYP4基因与抗药性之间的关系奠定基础。     

淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初步鉴定

[目的 ]探讨淡色库蚊细胞色素P45 0与溴氰菊酯抗药性的关系。 [方法 ]采用一对昆虫细胞色素P45 0简并引物 ,以反转录 聚合酶链反应从淡色库蚊扩增特异片段 ,T/A直接克隆法筛选阳性克隆 ,对新序列进行cDNA芯片和逆Northern分析。 [结果 ]从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系获得 112个阳性克隆 ,其中 2 4个阳性克隆测序后显示为细胞色素P45 0新序列 ,由GenBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定分别属CYP4家族CYP4C、CYP4D、CYP4H和CYP4J等 4个亚家族 ;2 4个CYP4cDNA片段中 ,来自敏感品系的 2个片段(NYDS3和NYDS5 )和来自抗性品系的 4个片段 (NYDR6、NYDR9、NYDR15和NYDR17)在两品系间存在差别 ,cDNA芯片信号亮度值均是抗性品系大于敏感品系 ,倍数在 3 .1～ 9.7范围内 ;NYDR17仅与抗性探针杂交 ;逆Northern再鉴定 ,获得了与cDNA芯片一致的结果。 [结论 ]淡色库蚊CYP4与溴氰菊酯抗性相关 ;在淡色库蚊溴氰菊酯抗性机理中 ,可能存在P45 0基因点突变而导致的特异表达。     

淡色库蚊细胞色素P450基因的克隆、序列分析及表达差异的鉴定

目的克隆淡色库蚊细胞色素P450（CYP6F1）基因并进行表达差异的鉴定。方法采用RT—PCR技术和RACE策略，从淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系4龄幼虫中克隆细胞色素P450基因（CYP6F1），用相应的软件进行生物信息学分析，并用实时定量PCR和RT—PCR分析敏感、抗性品系蚊的CYP6F1表达水平及对蚊各期CYP6F1进行表达鉴定。结果成功克隆出CYP6F1基因，基因全长1639bp，开放阅读框为1527bp，编码508个氨基酸（GenBank登录号：AY662654）。序列分析显示该基因与已克隆的日本致倦库蚊细胞色素P450基因（AB001324）有99％的同源性，并具有所有的细胞色素P450基因的保守性特征，1个膜锚定信号、2个还原酶结合位点、1个典型的血红素蛋白结合位点和ETLR基序等。实时定量PCR和半定量RT—PCR结果表明，CYP6F1在淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系中表达水平高于敏感品系，且CYP6F1基因在淡色库蚊各个发育阶段有不同的表达。结论CYP6F1基因可能与杀虫剂抗药性相关，并且在淡色库蚊各个发育阶段有不同的表达。     

嗜人按蚊溴氰菊酯抗性分子机理研究Ⅱ嗜人按蚊CYP4基因cDNA片段的克隆与序列分析

目的　获得嗜人按蚊CYP4基因家族成员的c DNA片段。方法　采用简并引物对嗜人按蚊溴氰菊酯敏感和抗性品系总RNA进行RT- PCR扩增,得到的特异性片段采用T/ A克隆法克隆并进行序列测定和分析。结果　敏感品系和抗性品系嗜人按蚊均能扩增得到4 5 0 bp和5 30 bp左右的2个片段。经克隆测序后,得到6个基因序列,其中4个来自敏感品系,2个来自抗性品系。其中1个来自敏感品系的序列和1个来自抗性品系的序列完全相同。所得的5个不同基因序列已被Gen Bank收录(登录号:AY2 0 814 1～AY2 0 814 5 ) ,并递交国际细胞色素P4 5 0命名委员会,经鉴定确认均为细胞色素P4 5 0超家族中的CYP4家族成员,其中4个为新基因,另1个为等位基因,分别属于CYP4家族的CYP4 C、CYP4 H和CYP4 J3个亚家族。结论　得到的5个c DNA新序列为CYP4家族新成员的基因片段。     

淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初 …

「目的」探讨淡色库蚊细胞色素Ｐ４５０与溴氰菊酯抗药性的关系。「方法」采用一对昆虫细胞色素Ｐ４５０简并引物，以反转录－聚合酶链反应从淡色库蚊扩增特异片段、Ｔ／Ａ直接克隆法筛选阳性克隆，对新序列进行ｃＤＮＡ芯片和逆Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析。「结果」从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系获得１１２个阳性克隆，其中２４个阳性克隆测序后显示为细胞色素Ｐ４５０新序列，由ＧｅｎＢａｎｋ登录上网；经国际细胞色素Ｐ４５     

嗜人按蚊溴氰菊酯抗性分子机理研究Ⅰ嗜人按蚊CYP6基因cDNA片段的克隆与序列分析

目的获得嗜人按蚊CYP6基因家族成员的cDNA片断。方法采用简并引物对嗜人按蚊溴氰菊酯敏感和抗性品系总RNA进行RT-PCR扩增,得到的特异性片断采用T/A克隆法克隆并进行序列测定和分析。结果敏感品系和抗性品系中均扩增得到250bp左右的片断。进行克隆测序,得到10个CYP6新基因,2个来自敏感品系,8个来自抗性品系,被GenBank收录(登录号AY273927～AY273936)。递交国际细胞色素P450命名委员会,被鉴定为是细胞色素P450超家族中CYP6家族的7个新基因及其3个等位基因,分别属于CYP6Z、CYP6P、CYP6N和CYP6M等4个亚家族。结论得到的10个cDNA新序列为CYP6家族新成员的基因片断。     

白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N亚家族新成员5‘—及3’—非翻译区序列功能分析

目的 获得白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N亚家族新成员5‘－及3‘－非翻译区（untranslated region,UTR）核苷酸序列,并进行功能分析。方法 以本文作者已获得的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株－新的细胞色素P450 CYP6基因cDNA片段,设计1对特异性引物,以反向引物,进行5‘-cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）,以正向引物进行3‘-RACE。然后分别进行克隆、测序和鉴定。以获得5‘-UTR及3‘－UTR,并运用PC／GENE软件分析其功能。结果 获得CYP6N家族中两个新成员5‘－UTR及3‘－UTR;其结构特征包括：两个新成员前导序列均为46个核苷酸;起始密码子ATG两侧核苷酸－3位是A、＋4位是T;5‘－UTR区域无稳定性的发卡结构;终止密码子在CYP6N3为TZAA、在CYP6N4为TAG,紧挨其3‘端核苷酸分别为A和G,翻译产物羧基端均为亮氨酸。结论 成功地获得了白纹伊蚊细胞色素P450CYP6N亚家族两个新成员5‘－及3‘－非翻译区序列,进一步分析表明该两个新成员均能进行有效翻译,昆虫细胞色素P450基因翻译起始调控与翻译终止调控有部分类似于脊椎动物mRNA的翻译调控,但具有多态必性的特点。     

淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4E2r6基因的克隆与生物信息学分析

目的 从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫扩增并分析CYP4E2r6基因，为蚊虫抗药性的研究、检测和防治筛选靶标。方法 根据已扩增的CYP4E2r6基因片段（长470bp，GenBank登录号为CB074945）的序列设计2条特异引物，从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫提取RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，用5’-RACE和3＇-RACE方法，各获得722bp、617bp片段。进行序列拼接并对所得新基因进行登录和生物信息学分析。结果获得了1条3’端含polyA尾，长1025bp的CYP4E2r6基因大片段（GenBank登录号为AY309972），编码289个氨基酸，与果蝇细胞色素P450氨基酸的同源性为55％。编码蛋白的理论分子质量单位为32．9ku，等电点为5．8。结论 获得了CYP4E2r6基因大片段，为进一步获取全长基因并研究该基因的功能奠定了基础。     

白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N3基因的原核表达及鉴定

目的　对白纹伊蚊细胞色素P4 5 0CYP6N3基因进行原核表达 ,以获得高效表达蛋白。方法　根据CYP6N3基因的全长cRNA为模板进行RT -PCR。产物经T -A克隆测序鉴定后 ,亚克隆入原核融合表达载体 pGEX - 4T - 1(含有编码 2 6KDaGST的基因序列 )中 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行原核表达。将细菌总蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 ,通过Westernblot分析鉴定目的蛋白的位置 ,并运用核酸蛋白分析仪扫描凝胶以确定表达产物的含量。结果　获得了高效表达的融合蛋白GST -CYP6N3,表达量占菌体总蛋白的 37 4 9%。结论　本实验成功地异源表达了白纹伊蚊CYP6N3基因 ,为体外重建细胞色素P4 5 0CYP6N3单加氧酶系 ,了解CYP6N3基因结构功能关系奠定基础     

小鼠巨噬细胞Ipr1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠Ipr1(intracellular pathogen resistance 1)基因真核表达载体。方法从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pMD19-Tsimple载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复后将Ipr1基因亚克隆于原核真核双系统表达质粒pQE-TriSystem中得到pQE-TriSystem-Ipr1,用脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,RT-PCR鉴定Ipr1基因的表达。结果从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变,经点突变修复后与GenBank报道的Ipr1基因序列一致。亚克隆获得重组质粒pQE-TriSystem-Ipr1,转染RAW264.7细胞经RT-PCR扩增出Ipr1基因相应大小的DNA片段。结论成功调取小鼠Ipr1基因并成功构建含Ipr1基因的真核表达载体,为进一步研究Ipr1基因的功能奠定基础。     

CYP3A4、CYP3A5多态性与肿瘤的关系

<正>CYP3A家族(cytochrome P450,subfamilyⅢA)是细胞色素酶CYP450(cytochrome P450 enzyme system)重要成员,其含量丰富,底物覆盖广泛,主要功能是参与许多内、外源性物质的代谢,是药物代谢反应中最主要的限速酶~([1-2])。CYP3A亚家族包含4个成员:CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。CYP3A4主要分布在肝脏和小肠,是肝内最常见最丰富的细胞色素亚家族;CYP3A5主要分布于一些肝外组织如肠壁、     

应用rDNA-ITS2诊断性序列现场对3种重要蚊媒的鉴定

目的 建立利用核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)诊断性序列鉴别蚊媒的分子生物学方法. 方法 根据淡色库蚊、白纹伊蚊、嗜人按蚊rDNA-ITS2基因两侧的5.8S和28S保守区设计诊断性引物,进行3种蚊虫的rDNA-ITS2克隆鉴定,并利用其rDNA-ITS2特征进行现场蚊虫的鉴别. 结果 诊断性引物对于淡色库蚊、白纹伊蚊、嗜人按蚊DNA模板的扩增产物分别为440、514和558 bp,3种蚊虫阳性克隆的测序结果与GenBank-blast相应蚊种rDNA-ITS2序列的同源性均为99%.用Biosept、DNAstar等软件分别分析发现各蚊虫克隆的个体间存在一定程度的单核苷酸多态性(SNP).将现场采集的蚊虫诊断性引物扩增产物进行阳性克隆进行序列测定和分析,显示与淡色库蚊阳性对照的一致性为99%;与GenBank中淡色库蚊rDNA-ITS2基因的同源性为99%. 结论 通过对淡色库蚊、白纹伊蚊、嗜人按蚊核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)基因的序列分析,表明3种蚊媒的rDNA-ITS2基因具有可鉴别的种属特异性.利用同一体系的共享引物扩增,可以建立适用于3种蚊媒的现场鉴定方法.     

猪囊尾蚴一种蛋白抗原的cDNA分子克隆

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中克隆某种编码蛋白抗原的基因.方法用脑囊尾蚴病人血清筛选猪囊尾蚴cDNA文库,获得阳性克隆后,经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的cDNA片段,并将其亚克隆入pUC18质粒载体中,用双脱氧核苷酸末端终止法测定插入片段的核苷酸序列.测序后与GenBank中的核苷酸序列进行同源性分析.结果经3次筛选,从cDNA文库中克隆出一个阳性克隆,测序后其长度为546 bp,含有一个开放读码框,编码158个氨基酸.同源序列分析结果表明此基因片段与编码猪囊尾蚴的一种免疫原性蛋白基因(NC-9)同源性高达99%.结论本研究克隆出一种编码猪囊尾蚴蛋白抗原的基因.     

淡色库蚊rDNA-ITS2基因的克隆分析

目的克隆并鉴定淡色库蚊核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)基因并应用于现场孽生蚊媒的种属鉴定,从而为孽生现场的蚊媒预警提供分子生物学依据。方法设计淡色库蚊诊断性引物分别对淡色库蚊实验室标准株及从现场采集的蚊虫的rDNA-ITS2序列进行PCR扩增,PCR产物纯化后连接到pGEM-Teasy载体上并转化到DH5α菌中,然后对其进行DNA序列测定及分析。结果成功克隆了淡色库蚊的rDNA-ITS2基因。序列分析结果表明,实验中所克隆到的淡色库蚊的rDNA-ITS2序列与GenBank所登录的淡色库蚊的rDNA-ITS2序列同源性均为98%以上,同时发现孽生现场存在淡色库蚊。结论rDNA-ITS2序列在淡色库蚊中具有种属特异性,可为孽生现场的蚊媒预警提供分子生物学依据。     

细胞色素P450 3A4及谷胱甘肽S转移酶A1重组质粒的构建及表达

目的构建重组质粒pBudCE4.1-细胞色素P450 3A4(CYP3A4)-谷胱甘肽S转移酶A1(GSTA1),使CYP3A4和GSTA1可在真核细胞C3A中表达,并且增加其表达量。方法从含有GSTA1和CYP3A4的开放阅读框(ORF)克隆中扩增GSTA1和CYP3A4基因;将片段GSTA1以及载体pBuDCE4.1双酶切后连接并转化,质粒命名为pBuDCE4.1-GSTA1;将片段CYP3A4以及质粒pBuDCE4.1-GSTA1双酶切后连接并转化,所得重组质粒命名为pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1;测序验证重组克隆中目的基因片段的序列信息;构建稳定细胞系,测定CYP3A4活性及GSTA1的表达情况。结果酶切及测序验证双表达重组质粒pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1构建成功,CYP3A4及GSTA1在转染细胞系中的表达量增多。结论构建成的双表达重组质粒pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1符合应用要求。     

细胞色素酶CYP2C9与临床合理用药

CYP2C是细胞色素F450（CYP450）酶系中最大的亚家族,而CYP2C9是CYP2C亚家族中主要成员之一。CYP2C9酶存在于人类肝脏中,主要参与一些重要的内源性物质及前致癌物的代谢,并可活化代谢多种药物。     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列2的克隆与表达

目的 构建SARS冠状病毒棘突蛋白部分序列2(S2)的原核表达质粒，分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法 采用逆转录聚合酶链式反应技术从SARS冠状病毒基因组中扩增出编码S蛋白的第2170到2814位碱基的基因片段，克隆至pMD18-T载体，PCR筛选阳性克隆并测序。用限制性内切酶消化后，目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌．JM109，PCR和双酶切鉴定转化菌落。将阳性菌落经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达。结果 RT—PCR扩增出S2特异片段，经测序与GenBank比对存在1处碱基突变。S2基因片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2构建成重组表达质粒，并在JM109中表达了S2融合蛋白。结论 成功构建了SARS冠状病毒S2的重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达了S2融合蛋白。     

淡色库蚊β-肌动蛋白基因克隆与序列分析

目的 获取淡色库蚊β-肌动蛋白全长基因。方法 采用RACE法筛选淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系cDNA表达文库，获得β-肌动蛋白基因的5′和3′RACE序列，然后通过T／A克隆插入pGEM-T质粒载体，经过测序、拼接获取全长序列。用BLASTp软件将该基因推导的氨基酸序列与蛋白质公共数据库Swissprot比对、分析。结果获得淡色库蚊β-肌动蛋白基因全长序列，总长度为1290bp，开放阅读框为1132bp，编码377个氨基酸(GenBank／NCBIAYl00005)。推导的氨基酸序列与公共数据库比对，发现与冈比亚按蚊和黑腹果蝇的β-肌动蛋白的同源性均为91％。蛋白质的理论分子质量为41．7ku，等电点(PI)为5．4。结论 获得了淡色库蚊β-肌动蛋白基因全长序列，为蚊虫分子生物学的进一步研究奠定了基础。     

基于mtDNA?COⅠ基因的山东省蚊种群遗传多样性分析

目的　探讨山东省不同地理株及实验室不同抗性品系淡色库蚊及5种常见蚊种的线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（mtDNA?COⅠ）基因序列特征,分析其遗传多样性。方法　采用山东省济南、济宁、青岛等地现场采集及实验室选育的淡色库蚊成蚊,以济宁市现场采集的5种蚊（淡色库蚊、三带喙库蚊、中华按蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊）作为样本,PCR扩增mtDNA?COⅠ基因并测序,分析序列特征并构建系统进化树。结果　PCR特异扩增8个不同地理株及4个实验室抗性品系的淡色库蚊mtDNA?COⅠ区域,获得长度均为528 bp的扩增片段,A+T含量为67.4%,存在两个变异位点。不同地理株淡色库蚊mtDNA?COⅠ基因同源性为99.95%,不同抗性品系淡色库蚊基因序列相同,所有蚊虫COⅠ基因具有高度保守性。5种常见蚊虫的mtDNA?COⅠ基因片段长度均为528 bp,有408个保守位点,120个变异位点,42个简约信息位点,78个单态位点,A+T含量为65.7%～68.0%,同源性分析发现蚊种间基因同源性为86.17%～92.05%,所有蚊虫的COⅠ基因分子鉴定与其形态学相吻合。系统进化关系显示,同种和同属之间呈明显的聚集,但阿蚊属成单独的分支,与其他蚊种亲缘关系较远。结论　线粒体COⅠ作为不同地理株及实验室不同品系淡色库蚊的遗传进化分子标记不够理想,但该基因具有种间和属间特异性,可用于蚊虫属和种的区分。