慢性乙型肝炎患者应用拉米夫定治疗发生HBV YMDD变异的研究

目的 探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者应用拉米夫定治疗发生HBV YMDD变异后与患者血清HBVDNA载量关系的临床意义.方法 选择46例应用拉米夫定治疗并发生HBV YMDD变异的CHB患者,另选择未发生HBV YMDD变异的CHB患者作对照组.探讨血清HBVDNA载量与HBV YMDD变异类型、变异发生时间的关系.结果 CHB患者接受拉米夫定治疗前,HBV YMDD变异组HBVDNA载量明显高于HBV YMDD未变异组（P〈0.01）.HBV YMDD变异类型（YVDD、YIDD、YVDD/YIDD）的分布与血清HBVDNA载量无相关性.HBVDNA载量与发生HBV YMDD变异的时间有相关性.随着HBVDNA载量的升高,发生HBV YMDD变异的时间越来越早.结论 应用荧光定量PCR方法检测血清HBVDNA载量和HBV YMDD变异,可动态观察CHB患者拉米夫定治疗后发生HBV YMDD变异的情况,对临床治疗和观察预后具有重要的临床意义.     

90例HBV基因型与拉米夫定疗效的研究

目的 :探讨乙肝病毒 (HBV)基因型与拉米夫定疗效的关系。方法 :选用 90例慢性乙肝病人 ,采用口服拉米夫定 10 0mg/d治疗 2 4个月。根据HBV前C区保守序列作为通用包被探针 ,HBV不同基因型的序列作为基因分型显色探针 ;另外拉米夫定YMDD及耐药突变的两种形式 (YIDD/YVDD)分别作为显色探针。采用PCR微板双探针杂交ELISA技术进行HBVDNA定量、HBV基因分型、YMDD及突变耐药株 (YIDD/YVDD)的检测。结果 :90例乙肝病人C基因型占 4 3% ,B基因型 30 % ,D基因型 16 % ,混合基因型为 10 %。其中有 1例出现YIDD耐药株(称为先天性耐药 )。口服拉米夫定 12个月后 ,5 14 6 /90 )的病人HBVDNA转阴 (<0 .1pg/ml血清 ) ;YMDD耐药株发生率为 16 % (14 /90 ) ,其中C基因型 6例 ,D基因型 6例 ,混合基因型 2例 ,先天性耐药株对拉米夫定无反应。口服拉米夫定 2 4个月后 ,HBVDNA转阴率为 5 2 % (47/90 ) ,YMDD耐药株的发生率为 2 7% (2 4 /90 ) ,其中D基因型 10例 ,C基因型 9例 ,B基因型 1例 ,混合基因型 4例。结论 :本研究中乙肝病人HBV基因型主要为C型 ,其次为B型及D型。口服拉米夫定后大多数病人可以明显降低DNA水平 ;其YMDD突变耐药株的发生与HBV基因型有关 ,以D型及C型YMDD突变耐药株发生率较高。PCR微板双探针杂交技术不但     

湘潭地区乙型肝炎病毒基因型与YMDD基因区序列突变及BCP区突变关系探讨

【目的】对湘潭地区HBV感染者的基因型、YMDD基因区序列突变及BCP区突变情况及关系进行探讨。【方法】对952例不同类型的HBV感染者的样本同时进行基因型、YMDD基因区序列突变及BCP区突变检测和分析。【结果】湘潭地区HBV各种基因型分布比例为：B型占73．32％,C型占12．08％,B、C型混合感染14．60％。YMDD基因区序列突变结果显示：YMDD野生型,占88．66％,其余为YMDD突变型。BCP区突变结果显示：1762A／1764G（野生型）占70．59％,1762T／1764A（突变型）占19．75％,其余为混合型。基因型、相关性分析显示：HBVB型和C型YMDD基因区序列突变率无显著性差异（P〉0．05）,序列突变类别存在显著性差异（P〈0．05）,HBVC型YVDD突变率要高于B型。C型BCP区突变率要高于B型（P〈0．01）。HBV YMDD野生型和突变型的BCP区突变率存在显著性差异（P〈0．01）,HBV YMDD突变型标本BCP区突变率与YMDD野生型相比无差异,但YVDDBCP区突变率要高于其他类别。【结论】①湘潭地区流行的HBV基因型主要为B型和C型,其中B型为优势基因型,具有南方地区的特点。②拉米夫定治疗前通过HBV基因型检测来预测抗病毒应答可能并无实际意义。③HBV基因分型、YMDD基因区序列突变、BCP区突变检测的应用,将有助于临床上对乙肝患者的预后和转归进行正确评价。     

拉米夫定耐药性变异与乙型肝炎病毒基因型间的关系

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）基因型与拉米夫定耐药性变异类型间的关系。方法选取95例来自本院肝炎门诊和病房的YMDD变异阳性血清样品，应用限制性内切酶MboⅠ和EarⅠ对PCR产物进行酶切分析及分型，并作遗传进化树图分析验证。结果95例样品中检出C型75例，占79％；B型20例，占21％，进化树图分析证明酶切分型法确切可靠；B型病毒的YVDD变异、YIDD变异及YMDD＋YVDD＋YIDD联合变异的例数分别为11例、5例和4例，而C型中则分别为35例、27例和13例，对B、C基因型与YMDD变异类型间作卡方检验，得出差异无统计学意义（χ^2=0．856，P=0．710）。结论使用MboⅠ和EarⅠ酶切分型操作简单，结果可靠。HBVB型和C型病毒感染对发生不同YMDD变异类型无影响。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎疗效观察及YMDD变异分析

探讨拉米夫定（3TC）对慢性乙型肝炎（CHB）的治疗效果,以及乙型肝炎病毒（HBV）聚合酶酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸（YMDD）基序变异对3TC疗效的影响。【方法】检测分析58例接受3TC治疗的CHB患者治疗前后血清标志物HBVDNA、ALT、HBVM的变化,以及治疗后HBVYMDD变异情况。【结果】3TC治疗HBeAg阴转率为40．38％,eAg／抗-e血清转换率为28．85％,HBVDNA阴转率为74．14％,ALT复常率为77．59％。随着疗程的延长,有65．12％病例出现反跣。检测出23例患者发生YMDD变异,变异发生率为39．66％,且以YVDD型变异为主要形式。YMDD变异与3TC治疗疗程相关;治疗前HBV病毒载量与治疗后YMDD变异的发生可能无相关性（P〉0．05）;HBeAg阳性与HBeAg阴性者YMDD变异发生率可能无明显差异（P〉0．05）。【结论】3TC治疗CHB的短期疗效好,但随着疗程的延长,会出现病毒耐药,3TC耐药与YMDD变异密切相关。YMDD变异耐药株的产生可能与肝炎复发以及肝脏损害加重相关。在3TC治疗过程中,可能还存在HBV基因其他位点的变异而引起耐药。     

应用型特异性引物巢式PCR分析温州地区乙型肝炎病毒基因型及其临床意义

目的了解温州地区乙型肝炎病毒（HBV）基因型的分布及其与临床的相关性。方法选取温州地区HBVDNA阳性的慢性HBV感染者202例,其中慢性无症状乙型肝炎表面抗原携带者52例,慢性乙型肝炎103例,肝硬化27例,肝细胞癌20例,应用型特异性引物巢式PCR检测HBV的基因型。结果202例HBVDNA阳性血清标本中,B型37例（18．3％）,C型123例（60．9％）,B／C混合型41例（20．3％）,D型1例（0．5％）,未发现A、E、F和G型;与B基因型、B／C混合型相比,C基因型在慢性乙型肝炎和肝细胞癌中明显升高,分别为56．1％和14．6％（P〈0．05）;C基因型感染者血清丙氨酸氨基转移酶水平（226±268）U／L高于B基因型的（114±183）U／L和B／C混合型的（130±222）U／L,差异有统计学意义（P〈0．05）;C基因型感染者HBeAg阳性率和HBVDNA含量明显高于B基因型和BC混合型感染者相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论温州地区存在HBV的B、C、D和B／C混合基因型,C型为本地区的优势基因型．并且C型HBV感染易引起较重肝脏损伤。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎YMDD变异的产生与病毒载量的关系

目的 观察拉米夫定治疗慢性乙型肝炎（CHB）YMDD变异的产生与血清病毒载量的关系。方法 选择应用拉米夫定治疗并产生YMDD变异的CHB患者53例，分析血清病毒载量水平与YMDD变异类型、产生时间的关系。另选择具有可比性的应用拉米夫定治疗但并未产生YMDD变异的CHB患者53例（1：1配对）对比分析治疗前血清HBV-DNA定量水平。结果 YMDD变异组治疗前血清HBVDNA定量水平显著高于未产生YMDD变异组（P〈0．01）。YMDD变异类型与血清HBVDNA定量水平不相关（P〉0．05），但YMDD变异产生时间与血清HBV-DNA定量水平相关（P〈0．05）。结论 CHB患者血清病毒载量水平越高，应用拉米夫定治疗越容易产生YMDD变异，且产生时间越早。血清病毒载量可作为应用拉米夫定治疗YMDD变异产生的早期预测指标。YMDD变异类型与病毒载量不相关。     

慢性乙型肝炎患者的乙型肝炎病毒基因型与细胞免疫功能的关系

目的探讨慢性乙型肝炎（cHB）患者的乙型肝炎病毒（HBV）基因型与细胞免疫功能的关系及其临床意义。方法对108例CHB患者用聚合酶链反应（PCR）微板核酸杂交-酶联免疫吸附测定（ELISA）技术进行HBV基因分型,用流式细胞仪检测T细胞亚群、非特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、辅助性T细胞（Th）1、Th2、自然杀伤（NK）细胞,对其中55例人白细胞抗原（HLA）-A2阳性CHB患者检测HBV特异性CTL。结果108例CHB患者中,B基因型59例（54．6％）,C基因型48例（44．4％）,B、C混合型1例（0．9％）,HLA—A2阳性55例（51．4％）中,C基因型感染者27例,B基因型感染者28例;乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）阳性率高于B基因型感染者（75．0％VS49．2％）（P〈0．01）,C基因型的HBVDNA水平高于B基因型感染者（6．12±0．81）log10copies／mlvs（5．02±0．61）log10 copies／ml（P〈0．01）,HBV特异性CTL低于B基因型感染者（0．21±0．06）％vs（0．39士o．12）％（P〈0．01）。非特异性CTL高于B基因型感染者（19．84±6．17）％vs（16．81±3．56）％（P〈0．01）,丙氨酸转氨酶（ATL）高于B基因型感染者（505．12±312．91）U／Lvs（222．11±205．16）U／L（P〈0．01）,血清总胆红素（TBIL）高于B基因型感染者（45．71±41．12）μmol／Lvs（28．18±15．12）μmol／L（P〈0．05）。结论与CHBB基因型感染者相比,C基因型感染者的HBV特异性CTL较低,导致HBVDNA水平高于B基因型感染者,HBeAg阳性率也高于B基因型感染者,因此C基因型感染者的肝功能损害比B基因型感染者重,C基因型感染者的肝功能损害比B基因型感染者重,可能也与C基因型感染者的非特异性CTL比B基因型感染者高有关。     

逆向斑点杂交检测乙型肝炎病毒基因型及YMDD变异

目的 应用逆向斑点杂交技术检测乙型肝炎病毒（HBV）基因型及YMDD变异。方法 合成有生物素标记的引物，PCR扩增两种DNA片段，与尼龙膜上的探针同时杂交，BCIP／NBT显色。结果 检测21例拉米夫啶治疗中的慢性乙型肝炎患者，11例HBV为基因型B，10例为基因型C；YMDD基序有47．6％（10／21）为YMDD，28．6％（6／21）为YVDD，23．8％（5／21）为YIDD。结论 在同一张尼龙膜上检测HBV基因型及YMDD变异，经济实惠、准确快捷，且易于开展。     

不同基因型乙型肝炎病毒患者拉米夫定治疗期间YMDD突变株的变化分析

目的研究不同基因型乙型肝炎病毒（HBV）患者拉米夫定治疗期间酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸（YMDD）突变株的变化。方法采用实时荧光聚合酶链反应（PCR）技术和基因测序法分别对115例接受拉米夫定治疗的乙型肝炎患者血清进行乙型肝炎病毒基因（HBV DNA）水平、YMDD突变株及基因型检测。结果拉米夫定治疗时间〈12个月、12~24个月及〉24个月患者的HBV DNA阳性率分别为75%、35%、16%,YMDD变异率分别为22%、54%、100%。对115例乙型肝炎患者进行HBV基因分型发现,B型占17%,C型占75%,B、C混合型占8%;其中,B型、C型患者中YMDD变异率分别为21%、19.5%,B、C混合型患者中未发现YMDD变异。HBV DNA与HBV的YMDD变异率无明显相关性（P〉0.05）。结论拉米夫定治疗期间,HBV的YMDD变异不受病毒基因型的影响。     

乙型肝炎病毒基因型与YMDD基因区序列突变及BCP突变关系探讨

目的 对湘潭地区HBV感染者的基因型、YMDD基因区序列突变及BCP区突变情况进行研究,并对三者之间的关系进行探讨.方法 针对湘潭地区952例不同类型的HBV感染者的样本同时进行基因型、YMDD基因区序列突变及BCP区突变检测,并对检测结果进行统计分析.结果 湘潭地区HBV各种基因型分布比例为:B型698例、占73.32%,C型115例、占12.08%,B、C型混合感染139例、占14.60%.YMDD基因区序列突变结果显示:YMDD野生型844例、占88.66%,其余为YMDD突变型,其中YVDD 54例、占5.67%,YIDD 53例、占5.57%,1例为YMDD与YVDD混合感染.BCP区突变结果显示:1762A/1764G(野生型)672例、占70.59%,1762T/1764A(突变型)188例、占19.75%,其余92例为1762T/1764A和1762A/1764G混合型、占9.66%.基因型、YMDD基因区序列突变及BCP区突变三者相关性分析显示:HBV B型和C型YMDD基因区序列突变率分别为10.04%、10.43%,差异无统计学意义(χ2=0.017,P＞0.05),HBV B型和C型YMDD基因区序列突变类别差异有统计学意义(χ2=4.836,P＜0.05),HBV C型YVDD突变率(9.57%)要高于B型(5.88%).HBV B型和C型BCP区突变率分别为27.36%、46.09%,差异有统计学意义(χ2=16.478,P＜0.01),C型BCP区突变率要高于B型.HBV YMDD野生型和突变型的BCP区突变率分别为2 8.67%、35.51%,差异无统计学意义(χ2=2.139,P＞0.05),但YVDD BCP区突变率(61.11%)要高于其他类别.结论 (1)湘潭地区流行的HBV基因型主要为B型和C型,其中B型为优势基因型,具有南方地区的特点.(2)拉米夫定治疗前通过HBV基因型检测来预测抗病毒应答可能并无实际意义.(3)HBV基因分型、YMDD基因区序列突变、BCP区突变检测的应用,将有助于临床上对乙肝患者的预后和转归进行正确评价,为及时合理的实施干预措施提供了重要依据.

Abstract：

Objective To investigate the relationship between HBV genotypes and YMDD motif mutations or BCP mutations in Xiangtan of Hunan Province. Methods HBV genotypes, YMDD motif mutations and BCP mutations were analyzed in 952 HBV infected patients. Results HBV genotyping showed that 698 HBV type B patients and 115 HBV type C patients accounted for 73.32% and 12.08% respectively of all the participants. The rest 139( 14.60% )were genotype B and C mixed infection( B + C ). The analysis of YMDD motif mutations showed that 844 YMDD wild-type which accounted for 88.66% of all the subjects and the remainder were YMDD mutation types, of which 54( 5.67% ) carried YVDD, 53( 5.57% ) YIDD,and 1 YVDD and YIDD mixed infection. Basic Core Promoter mutations showed that 1762A/1764G ( wild type )accounted for 70.59% and 1762T/1764A( mutant ) accounted for 19.75%. The rest 92 patients were 1762T/1764A and 1762A/1764G mixed infection. This study showed no significant difference in the rate of YMDD mutation( 10.04% vs 10.43% ,χ2 =0.017,P＞0.05 ) ,but a significant difference in the types of YMDD mutation(χ2 = 4.836, P ＜ 0.05 )between HBV types B and C. The YVDD mutation was more commonly seen in genotype C( 9.57% ) than in genotype B( 5.88% ). The BCP mutation rate showed a significant difference( 27.36% vs 46.09%, χ2 = 16.478, P ＜ 0.01 ). Genotype C was more frequent than genotype B. The BCP mutation rate showed no significant difference between YMDD Wild-type and YMDD mutation types( 28.67% vs 35.51%, χ2 = 2.139, P ＞ 0.05 ), but most of BCP mutations happened in YVDD mutant type( 61.11% ). Conclusions ( 1 ) The predominant HBV genotypes in Xiangtan were genotype B and genotype C, the major genotype was type B, which display the characteristics of epidemiology in Southern China. ( 2 ) Determination of HBV genotypes before lamivudine therapy was probably not an important pretreatment investigation to predict antiviral responses. ( 3 ) Detection of HBV genotypes, YMDD motif mutations and BCP mutations will contribute to the correct evaluation of prognosis and timely proper management of HBV patients.     

乙型肝炎病毒YMDD自然变异与抗病毒治疗后变异特点

目的了解未经拉米夫定抗病毒治疗的慢性乙型肝炎（CHB）患者和经拉米夫定治疗后的CHB患者乙型肝炎病毒基因组P区多聚酶YMDD变异情况，观察其特点。方法选择未接受过抗病毒治疗的CHB患者119例和经拉米夫定治疗后无明显效果的CHB患者30例，采用荧光标记杂交双探针聚合酶链反应熔解曲线法（FH—PCR—MC）对其血浆标本进行YMDD基因序列突变检测。结果119例未接受过抗病毒治疗的患者，变异检出率为19．3％（23／119），23例出现自然变异毒株的患者，其体内病毒均为变异株与野生株共生，且变异株为非优势株，变异株在总病毒量中所占的比例均在50％以下，变异类型以YVDD为主（20例）。30例经拉米夫定治疗的患者变异检出率为56．7％（17／30），17例阳性患者有11例患者体内病毒完全为变异毒株，仅6例患者为变异株与野生株共生，且变异株为优势株者占83．3％（5／6）；在变异类型上YVDD占8例，居多；YVDD与YIDD同时阳性占3例。结论未经抗病毒治疗的CHB患者存在YMDD自然变异毒株，且变异株皆与野生株共生，变异株为非优势株。经拉米夫定治疗后的变异多数为完全变异，少数为变异株与野生株共生，且变异株大多为优势株。     

3种检测乙型肝炎病毒YMDD变异方法的比较

目的通过多种方法比较分析找到一种高灵敏的检测乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的方法。方法收集抗病毒治疗1年的慢性乙肝患者样本166例(116例采用拉米夫定治疗、50例采用替比夫定治疗),比较高温连接酶检测反应(LDR)、实时荧光聚合酶链反应(Real-time PCR)和测序3种方法检测HBV YMDD变异灵敏性。结果 LDR、Real-time PCR、测序的阳性率分别为23.49%、21.68%、19.27%。3种方法的特异性均为100%。采用拉米夫定治疗的患者中有38例变异,其中YIDD12例、YVDD26例;替比夫定只有1例YIDD变异。结论 LDR方法检测YMDD变异是非常适合临床应用的方案。YVDD变异较YIDD变异更为普遍。     

Taqman MGB探针分型技术检测HBV YMDD 变异及临床应用研究

摘　要: 目的：建立一种快速准确的HBV YMDD变异检测方法，用于乙肝患者拉米夫定治疗中耐药性突变的监测。方法：采用三种特异性TaqmanMGB探针和一对共同引物，建立了检测HBV YMDD变异的荧光定量PCR方法。分别针对总HBV 、YIDD变异、YVDD变异的三管并行检测，可以确定YMDD变异的类型及其在病毒群中的比例。对YMDD野生株、YIDD变异株、YVDD变异株的病毒质粒经过梯度稀释进行检测验证。以序列直接测定法作为诊断YMDD 变异的金标准，对该方法YMDD变异检测的灵敏度、特异性和诊断符合率作评价。并对112例经拉米夫定治疗的血清HBV DNA持续阳性的乙型肝炎患者检测其YMDD变异情况。结果　该方法在105--108Copies/ml 的YMDD野生株、YIDD变异株、YVDD变异株检测中匀未出现非特异性扩增信号；相同浓度的YMDD、YIDD、YVDD在三种不同探针的反应管中的扩增效率基本一致；病毒野生株与YVDD变异株的实际混合比例与计算比例基本一致；该方法检测YIDD、YVDD的最低检测界限为1000 Copies/ml，能在106Copies/ml病毒群中检出0.1%的变异株的存在。以直接测序方法为金标准，该方法YMDD变异检测的灵敏度100%、特异性96%，诊断符合率97.5%。该方法检测112例经拉米夫定1--3年治疗血清HBV-DNA持续阳性的乙型肝炎患者37 例发生YMDD 变异,阳性率27.2%。结论：该方法能够直接检测HBV YMDD变异的类型及其在病毒群中的比例，具有快速、灵敏、准确、经济实用等优点，适合临床实验室开展拉米夫定耐药性突变的监测。     

拉米夫定抗HBV治疗过程中HBV-DNA的反弹规律及变异研究

目的　观察拉米夫定抗HBV治疗过程HBV DNA的反弹规律及变异情况。方法　单一采用拉米夫定 (1 0 0mg/d)治疗 83例有活动性病毒复制的慢性乙型肝炎患者 (CHB) ,应用荧光全定量PCR检测CHB治疗前和治疗 2、6、1 2、1 8个月后血清HBV DNA的含量 ,应用UniArray技术检测YMDD位点突变。结果　根据HBV DNA含量的下降、波动、反弹分 3种类型 :A类 2 8例 ,HBV DNA含量呈直线下降 ,无HBV基因突变 ;B类 2 3例 ,HBV DNA含量先下降、后反弹、波动、再下降 ,无HBV基因突变 ;C类 32例 ,HBV DNA含量先下降、后反弹、波动、再持续上升 ,有 2 7例HBV基因突变 ,其中YIDD突变 1 0例 ,YVDD突变 1 4例 ,YIDD和YVDD同时突变 3例。结论　拉米夫定抗HBV DNA治疗 2个月左右疗效十分显著 ;2至 6个月HBV DNA含量呈低水平波动 ;6至 1 2个月易出现反弹、波动 ;1 2个月后变异株形成趋势明显。     

基因芯片检测拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎患者YMDD变异的初步研究

目的 用基因芯片技术检测拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)DNAP区YMDD基序变异情况。探讨变异对临床的影响，为疗效预测及制定进一步治疗措施提供依据。方法 取40例，临床考虑拉米夫定耐药患者的血清，用基因芯片的方法检测血清样本YMDD基序变异情况。观察变异检测阳性患者反跳时的丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平及血清转换情况。结果 40例患者血清标本中，用基因芯片法检测HBV DNAP区YMDD变异，YMDD变异阳性标本27例，总变异检出率为67．5％(27/40)。单纯YMDD变异5例。YMDD变异株与野生株混合存在22例。在变异类型中，YIDD变异4例；YVDD变异16例；YIDD与YVDD混合变异7例。血清HBV DNA反跳时YMDD变异组ALT正常者有13例。40例患者中有3例发生血清转换，在YMDD变异检测阳性者中有1例发生血清转换。结论 在拉米夫定治疗过程中出现血清HBV DNA反跳时，多数患者血清中可以检出YMDD变异。反跳时变异株大多与YMDD野生株以共生形式存在，尤以YVDD变异为多，这可能是耐药变异出现后继续服用拉米夫定仍然有效的原因。用基因芯片技术能较好地检测YMDD变异情况，并能检测到患者体内变异株与野生株存在形式。