肿瘤坏死因子-α转导的人难治性颞叶癫痫神经细胞凋亡的研究

目的研究人难治性颞叶癫痫(TLE)颞叶组织中是否存在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转导的神经细胞凋亡。方法采用免疫组化SP染色法检测30例难治性TLE(TLE组)与10例脑外伤患者的正常颞叶组织(对照组)脑组织神经元、胶质细胞中肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域蛋白(TRADD)、凋亡信号调节激酶1(ASK1)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8(caspase 8)的表达并分析其表达差异。透射电镜下观察TLE痫灶神经元、胶质细胞超微结构改变。结果TLE组神经元和胶质细胞caspase 8表达较对照组增加(分别P<0.05,P<0.01)。两组神经元与胶质细胞中均未见TRADD、ASK1明显阳性表达。透射电镜观察见TLE组神经元具有细胞体积变小、核固缩、异染色质增多及边缘化、细胞及核膜边缘皱缩不齐、核分裂像、凋亡小体形成等凋亡特征,而胶质细胞则出现水肿现象。结论人难治性TLE病颞叶组织的神经元及胶质细胞中可能存在TNF-α转导的细胞凋亡。     

下调miR-203靶向MEF2C/NF-κB抑制颞叶癫痫大鼠海马胶质细胞的活化和炎症反应

目的 探讨下调miR-203对颞叶癫痫大鼠海马胶质细胞活化和炎症反应的影响。方法 将46只成年SD大鼠随机分为假手术组（n=10）、模型组（n=12）、阴性对照组（n=12）和miR-203低表达组（n=12）。立体定向辅助下,将海人酸注入大鼠左侧海马CA3区建立颞叶癫痫模型,miR-203低表达组和阴性对照组大鼠左侧海马CA3区分别注射携带miR-203 inhibitor的腺相关病毒和空腺病毒载体,7 d后取左侧海马组织,PCR法检测miR-203水平,ELISA法检测炎症因子[白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）]水平,免疫印迹法检测肌细胞增强因子2c（MEF2C）、核因子-κB（NF-κB）p65蛋白表达,TUNEL法检测神经元凋亡,GFAP/CD11b/c免疫荧光染色分析胶质细胞活化。结果 模型组大鼠海马组织miR-203、NF-κB p65蛋白表达量、炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平明显增高（P<0.05）,MEF2C蛋白表达量明显降低（P<0.05）,活化的胶质细胞数量、神经元凋亡数量明显增多（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验显示,MEF2C是miR-203的靶基因。miR-203表达低表达组大鼠海马组织miR-203表达量、NF-κB p65蛋白表达量、炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平明显降低（P<0.05）,MEF2C蛋白表达量明显增高（P<0.05）,活化的胶质细胞数量、神经元凋亡数量明显减少（P<0.05）。结论 下调miR-203,靶向调控MEF2C/NF-κB信号通路,抑制颞叶癫痫大鼠海马胶质细胞的活化、神经元凋亡和炎症反应。     

海马硬化型癫痫颞叶的病理学及c-fos、c-jun表达研究

目的研究海马硬化型颞叶癫痫（TLE）患者颞叶皮层神经元的变性凋亡以及c—fos、c-jun表达，并与海马的相应变化进行比较。方法14例颞叶和海马标本制成脑片后，用尼氏染色和TUNEL染色观察神经细胞变性和凋亡，并计数神经细胞数量；同时，研究c—fos和c-jun表达以反映癫痫发作对神经元损伤的程度和范围。结果颞叶皮层的神经细胞数量明显减少且形态异常，并有较多的凋亡细胞，伴有胶质细胞增生，而且有c—fos和c-jun的大量表达；其表现与海马的相应变化相似，但颞叶的胶质细胞增生更为明显。与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01或P〈0．05）。结论除海马外，颞叶神经细胞和胶质细胞的病理改变可能参与海马硬化型TLE的发生和传播过程。     

Bcl-2、fas蛋白在颞叶癫痫病灶内的表达与神经元凋亡

海马硬化是颞叶癫痫最常见的病理类型，其主要表现为神经元脱失和胶质细胞增生。以往研究认为，神经元坏死是导致海马硬化的主要原因；近年来一些的动物实验表明，神经元凋亡可能参与了这一病理过程。但目前尚有争议，有学者在动物实验中研究发现癫痫发作导致神经细胞坏死而非凋亡。为进一步探讨海马硬化与神经元凋亡的关系，本文采用颞叶癫痫病人手术切除的颞叶病灶，联合应用光镜、电镜及原位末端标记（TUNEL）方法检测神经细胞凋亡，同时应用免疫组化的方法检测凋亡相关基因bcl-2及fas蛋白的表达。     

难治性癫痫患者致痫灶细胞凋亡现象的研究

目的观察难治性癫痫患者手术切除癫痫灶中细胞凋亡现象,探讨神经元凋亡在癫痫发病机制中的意义,为临床治疗提供新的理论依据.方法收集16例经手术治疗的难治性癫痫患者致痫灶标本,在对临床资料全面分析的基础上,应用光镜、电镜及凋亡细胞DNA原位末端标记法（TUNEL）观察标本中存在的细胞凋亡现象.结果致痫灶周围神经元普遍固缩、减少,反应性胶质细胞增生.TUNEL阳性细胞数量较对照组显著增高（P＜0.01）,且绝大部分为神经元.结论难治性癫痫患者致痫灶周围存在细胞凋亡现象,神经元凋亡可能参与癫痫的发病过程.     

难治性颞叶癫痫患者颞叶皮层GRP78、caspase4的表达

目的观察难治性颞叶癫痫患者脑组织内质网应激相关分子GRP78、caspase4的表达,探讨内质网应激在难治性颞叶癫痫脑损伤中的作用。方法应用免疫组化、Western blot方法检测32例难治性颞叶癫痫患者手术切除的颞叶皮层脑组织GRP78、caspase4的表达,并与性别、年龄相匹配的对照组进行比较。结果与对照组相比,GRP78、caspase4在癫痫组表达明显上调(P0.05)。结论癫痫诱发了内质网应激,caspase4可能参与了癫痫后脑损伤,很可能为癫痫脑损伤的治疗提供新的靶点。     

MDR-1和GFAP蛋白在难治性癫痫脑组织的表达

目的：观察不同病因的难治性癫痫手术切除脑组织中多药耐药基因蛋白（MDR-1）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。方法：在对22例难治性癫痫临床病理资料分析的基础上，应用免疫组化和免疫组化双标技术观察脑组织中MDR-1和GFAP蛋白的表达情况。结果：反应性胶质细胞增生是难治性癫痫共同的病理学特征。MDR-1蛋白的表达主要在一些增生性星形胶质细胞和毛细血管壁周围结构，而寡突胶质细胞、小胶质细胞及正常的神经元内无MDR-1蛋白的表达；增生性星形胶质细胞内MDR-1与GFAP具有共存现象。结论：在难治性癫痫的反应必脑胶质细胞内同时具有GFAP和MDR-1蛋白的高表达和共存。     

颞叶癫癎主穹窿蛋白表达及其作用研究

目的探讨主穹窿蛋白（major vault protein，MVP）在颞叶癫癎大鼠模型脑组织的表达及其与难治性癫癎耐药是否相关。方法用氯化锂-匹鲁卡品制作颞叶癫癎模型，并将它分为药物有效组和耐药组；用免疫组化和Westernblot法检测MVP表达。结果MVP主要表达在海马和皮质区的小胶质细胞，血管内皮细胞，血管周围的星形胶质细胞也有表达，神经元中少见表达；耐药组MVP表达较药物有效组和对照组明显增高，具有统计学意义（P〈0．05）。结论耐药大鼠模型中MVP过量表达，提示MVP可能与难治性癫癎的耐药性有关。     

Omi/HtrA2在无镁外液致痫海马神经元凋亡中的作用机制及其特异性抑制剂UCF-101的神经元保护作用

目的观察线粒体丝氨酸蛋白酶Omi/Htra2在体外颞叶癫痫模型中神经元凋亡方面发挥的作用及其机制,以及其特异性抑制剂UCF-101对痫性损伤神经元的保护作用。方法原代培养新生24 h内的SD大鼠海马神经元至10 d,随机分成对照组、无镁细胞外液处理后3 h组、8 h组以及24 h组,观察细胞形态学特征,采用免疫蛋白印迹法观察海马神经元中Omi/Htra2蛋白的表达变化;再随机将神经元分为对照组、无镁细胞外液处理后24 h组、UCF-101处理组以及DMSO组,采用TUNEL法检测各组神经元凋亡,免疫蛋白印迹法观察神经元XIAP、caspase3、HAX-1蛋白的表达变化。结果随着无镁外液作用时间的延长,Omi/Htra2在线粒体中的含量逐渐减少,胞浆中含量逐渐增多。与正常对照组相比,致痫24 h后神经元凋亡数目以及caspase3蛋白表达显著增多(P<0.05),且HAX-1蛋白表达下降(P<0.05),而XIAP蛋白的表达正常对照组与模型组相比无统计学差异。与致痫24 h组相比,UCF-101处理组神经元凋亡细胞数和caspase3的表达均明显减少(P<0.05),XIAP及HAX-1蛋白表达增多(P<0.05),DMSO组神经元凋亡细胞数、上述蛋白表达方面与致痫24 h组无明显差异(P>0.05)。结论神经元遭到无镁细胞外液作用后,Omi/Htra2从线粒体移位到了胞浆,其特异性抑制剂UCF-101能有效抑制神经元凋亡,下调神经元caspase3蛋白的表达,上调XIAP、HAX-1蛋白的表达,发挥神经元保护作用。     

凋亡调控基因在难治性颞叶癫痫患者脑中表达的研究

目的:探讨神经元凋亡与难治性癫痫患者海马硬化关系。方法:16例颞叶癫痫患者手术标本,用光镜、电镜及原位末端标记(TUNEL)方法检测神经元凋亡;应用免疫组化方法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:对照组未发现凋亡神经元;癫痫组在电镜检查的3例标本中,1例有少量早期凋亡征象。对照组Bcl-2蛋白无表达,癫痫组Bcl-2蛋白表达明显增强(P<0.001);Bax蛋白在癫痫组与对照组中均微弱表达,两者差异无统计学意义(p>0.5)。结论:凋亡基因Bcl-2、Bax参与癫痫过程。     

内质网应激分子IRE1α、JNK在难治性颞叶癫痫患者脑组织中的表达

目的观察难治性颞叶癫痫患者颞叶皮层内质网应激相关分IRE1α、JNK的表达,探讨内质网应激在难治性颞叶癫痫脑损伤中的作用。方法应用免疫荧光、Western b lot方法检测25例难治性颞叶癫痫患者手术切除的颞叶皮层脑组织IRE1α、JNK的表达,并与性别、年龄相匹配的对照组进行比较。结果与对照组相比,IRE1α、JNK在癫痫组表达明显上调(P0.05)。结论内质网应激分子IRE1α、JNK可能参与了癫痫后脑损伤,从而为癫痫脑损伤的治疗提供新的靶点。     

干预癫痫大鼠自噬活性对小胶质细胞激活状态及肿瘤坏死因子-α分泌的影响及意义

目的观察干预癫痫大鼠自噬活性对小胶质细胞激活状态及分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平变化的影响,探讨其对神经元以及癫痫状态的影响。方法 Wistar大鼠随机分为正常对照组(6只)与癫痫组(24只);癫痫组大鼠采用戊四氮制作癫痫模型,造模成功后随机分为致痫对照组、3-甲基嘌呤(3-MA)组及雷帕霉素(RAPA)组,每组各6只。观察记录各组大鼠行为学及脑电图变化,采用HE及Nissl染色观察CA1区神经元损伤情况,免疫荧光染色及Western blot检测海马组织LC3、CD68及TNF-α的表达。结果致痫对照组显示癫痫可导致神经元损伤,LC3、CD68、TNF-α的表达较正常对照组显著增加(P0.05)。3-MA组与致痫对照组相比癫痫发作等级降低;神经元损伤数目减少;LC3、CD68、TNF-α的表达显著降低(P0.05)。RAPA组大鼠癫痫发作等级、CD68和TNF-α的表达较致痫对照组无明显变化(P0.05);但神经元损伤数目及LC3的表达进一步增加(P0.05)。结论癫痫过程中存在自噬现象,其可激活小胶质细胞,促进TNF-α分泌,导致神经元损伤;而抑制自噬活性可调控小胶质细胞,减少TNF-α的分泌,保护神经元,从而减轻癫痫发作状态。     

海人酸致痫大鼠海马IL-1β、TNF-α仪的表达

目的立体定向手术建立海人酸（KA）颞叶癫痫大鼠模型，检测海马内IL-1β、TNF-α蛋白及其mRNA的表达。方法大鼠随机分为空白对照组、生理盐水对照组和模型组。模型组大鼠-侧海马CA3区注射KA（生理盐水组注射生理盐水），观察其行为学特征，HE染色和Nissl染色以及电镜观察其病理学改变，免疫组化法检测大鼠海马内IL-1β、TNF-α蛋白的表达，原位杂交法检测TNF-α mRNA的动态表达。结果大鼠注射KA后出现湿狗样抖动、头面部肌阵挛、肢体阵挛及全面强直阵挛发作等，病理结果显示海马神经元变性、缺失及胶质细胞增生，模型组IL-1β在致痫后3、6h表达水平明显增加并于12h达高峰，之后逐渐下降，7d后与对照组相比差异无统计学意义（P〉0.05）；TNF-α蛋白与mRNA表达时程基本一致，3h出现，12h达高峰，而后逐渐下降，7d后回归至对照组表达水平，15、30d又高于对照组（P％0.05）。结论（1）大鼠-侧海马注射KA是人类颞叶癫痫理想的动物模型；（2）内源性IL-1β、TNF-α参与了癫痫发病机制。     

胰岛素样生长因子对少枝胶质细胞生长及髓鞘再生的影响

目的：观察胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor-1,IGF-1)对离体培养的少枝胶质细胞、髓鞘生长及肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF－α）脱髓鞘后的髓鞘再生的影响，以期为临床治疗多发性硬化（Multiple scrosis,MS)提供实验依据。方法：采用体外器官型组织培养Wistar大鼠小脑组织的方法及免疫细胞化学方法，观察髓鞘形成率及表达2‘3‘-环核苷酸3‘-磷酸二酯酶（2‘3‘-cyclic nucleotide,3‘-phosphodiesterase,CNPase)阳性的少突胶质细胞数。结果：IGF－1组及IGF－1＋TNFα组髓鞘形成率明显高于TNF－α组（P＜0．01，P＜0．05），18天时髓鞘形成率分别为90％及75％。CNPase阳性细胞数IGF－1组及IGF－1＋TNF－α组明显高于TNF－α组（P＜0．01）。结论：IGF－1能促进少突胶质细胞及髓鞘生长，并能促进TNF－α脱髓鞘后的髓鞘再生。     

多药耐药相关蛋白-1在难治性颞叶癫痫患者脑组织中的表达及丙磺舒的干预作用

目的 观察难治性颞叶癫痫患者脑组织中多药耐药相关蛋白1( MRPl)及应用MRP1拮抗剂丙磺舒干预后的表达,探讨MRP1与难治性颞叶癫痫多药耐药的关系.方法 应用免疫组化检测难治性颞叶癫痫患者脑组织实验组和对照组MRP1的表达情况,同时应用免疫蛋白印记(Western blot)方法检测实验组、丙磺舒干预组和对照组MRP1的表达.结果 免疫组化结果显示MRP1在难治性颞叶癫痫患者脑组织中表达增强,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05).Western blot结果显示丙磺舒干预组MRP1蛋白水平较实验组明显较少,差异有显著性(P＜0.05).结论 脑内高表达的MRP1参与难治性颞叶癫痫的耐药机制,丙磺舒可以降低脑组织内MRP1的表达.     

发育及DNA损伤反应调节基因1mRNA在癫痫患者脑组织中的表达及临床意义

目的观察REDD1mRNA在癫痫患者脑组织中的表达及临床意义。方法将50例癫痫患者分成难治性(42例)和非难治性癫痫(8例)两组,用基因芯片和免疫荧光定量PCR分别检测脑组织中REDD1mRNA基因表达,并与对照组进行比较。结果基因芯片扫描提示REDD1mRNA在癫痫患者脑组织中与对照组比较表达明显增加,难治性癫痫组和非难治性癫痫组没有明显的表达差异,免疫荧光定量PCR的结果与基因芯片结果一致。结论 REDD1mRNA在癫痫患者脑部中存在高表达,这种高表达可能通过雷帕霉素哺乳动物靶标系统导致神经元坏死与凋亡。     

颞叶癫痫主穹窿蛋白表达及其作用研究

目的 探讨主穹窿蛋白(major vault protein,MVP)在颞叶癫痫大鼠模型脑组织的表达及其与难治性癫癎耐药是否相关.方法 用氯化锂-匹鲁卡品制作颞叶癫癎模型,并将它分为药物有效组和耐药组;用免疫组化和Western blot法检测MVP表达.结果 MVP主要表达在海马和皮质区的小胶质细胞,血管内皮细胞,血管周围的星形胶质细胞也有表达,神经元中少见表达;耐药组MVP表达较药物有效组和对照组明显增高,具有统计学意义(P<0.05).结论 耐药大鼠模型中MVP过量表达,提示MVP可能与难治性癫癎的耐药性有关.     

难治性颞叶癫痫患者脑组织中Vav3的表达

目的研究难治性颞叶癫痫患者脑组织中Vav3的表达,探讨其在难治性颞叶癫痫形成中的意义。方法应用免疫组织化学法检测难治性颞叶癫痫患者脑组织和正常脑组织中Vav3蛋白的表达。光学显微镜下观察Vav3蛋白表达结果,并对免疫组织化学结果进行分析。结果免疫组化检测发现Vav3蛋白在难治性颞叶癫痫患者脑组织中阳性表达率明显高于正常脑组织,两组相比差异具有统计学意义（x^2=15．841,P〈0．015。实验组患者海马组中Vav3染色评分2分和3分占总体的76．93％（10／13）,而在颞叶组中Vav3染色评分1分和2分占总体的64．71％（11／17）,可见在难治性颞叶癫痫患者海马组织较颞叶组织神经元中Vav3的表达明显增强。结论Vav3在难治性颞叶癫痫患者的海马和颞叶脑组织中表达增强,提示其有可能参与了难治性颞叶癫痫的形成。     

Caspase 3 siRNA抑制关节软骨细胞的凋亡

背景：到目前为止，国内外对caspase 3抑制剂的研发大都集中在肽类或非肽类化合物的合成和发现上，而利用RNAi干扰技术直接沉默caspase 3基因，在基因水平抑制软骨细胞凋亡还未见报道。 目的：利用慢病毒载体，把Caspase 3 siRNA转入软骨细胞，使其caspase 3基因沉默，相对阻断凋亡效应的联级反应，期望达到抵抗软骨细胞凋亡的目的。 设计、时间及地点：单一样本观察，于2008-06/2009-06在暨南大学医学院附属广州市红十字会医院，广州市创伤外科研究所完成。 材料：软骨细胞从SPF级SD大鼠关节中提取，caspase 3 siRNA慢病毒载体为实验构建。 方法：构建大鼠pSIH1-H1-copGFP-Caspase 3 siRNA表达质粒，使用慢病毒包装系统，在293TN细胞中进行包装生产含caspase 3 siRNA的慢病毒颗粒，然后转导(transduce)入大鼠软骨细胞。 主要观察指标：实时荧光定量-聚合酶链反应和Western blot检测转导后软骨细胞caspase 3 基因沉默情况，再用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡，流式细胞技术Annexin V/ PI检测软骨细胞凋亡情况。 结果：Caspase 3 siRNA能顺利转入软骨细胞，转导率达90%；实时荧光定量-聚合酶链反应检测软骨细胞中Caspase 3 mRNA的表达量，实验组低于与对照组差异有显著性(P < 0.01)；Western blot检测软骨细胞的Caspase 3蛋白表达量，实验组低于与对照组差异有显著性意义(P < 0.01)；在使用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡时，caspase 3 siRNA转导组抑制细胞凋亡的能力是对照组的7倍。 结论：利用慢病毒载体把caspase 3 siRNA转入软骨细胞，使软骨细胞的caspase 3 基因沉默，可以达到相对拮抗软骨细胞凋亡的目的。     

京尼平对脂多糖诱导小胶质细胞炎症及凋亡的作用及机制研究

目的探讨京尼平(genipin)对脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞(BV-2)炎症及凋亡反应的作用及机制。方法采用LPS诱导BV-2小胶质细胞建立中枢神经系统炎症和凋亡反应模型。实验细胞分为4组:空白对照组、京尼平组、LPS组、LPS+京尼平组。通过ELISA、RT-PCR、Western Blot、细胞流式检测细胞的炎症及凋亡反应。结果与空白对照组比较,LPS可以诱导BV-2细胞上清培养基中IL-6、IL-1β和TNF-α释放和细胞内IL-6、IL-1β和TNF-α转录的增加;同时,LPS还可以激活凋亡蛋白Bax并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,导致细胞凋亡率的明显升高。京尼平预处理可以有效抑制小胶质细胞介导的炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)激活,并减少LPS诱导的小胶质细胞凋亡。结论 genipin干预可对LPS诱导的小胶质细胞炎症及凋亡反应起到保护作用。