MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的：构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法：PCR克隆人MDR1基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3-5倍。结论：成功构建含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的:构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法:PCR克隆人MDRl基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果:PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3~5倍。结论:成功构建含MDRl启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

hTERT启动子的克隆及hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的转录活性

目的 克隆hTERT启动子核心序列,研究hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的联合转录活性。 方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增hTERT启动子核心片段;将其分别插入荧光素酶基因报告质粒pGL3-Basic和pGL3-Enhancer中,构建hTERT启动子调控的表达载体pGL3-hTERTp和由hTERT启动子/SV40增强子联合调控的表达载体pGL3-hTERTp-SV40en,将上述重组质粒分别瞬时转染食管癌细胞Eca-109、EC1和人胚肺成纤维细胞MRC-5,用荧光素酶检测试剂盒检测转染细胞中荧光素酶基因的表达水平并以此计算hTERT启动子和hTERT启动子/SV40增强子在各种细胞中的转录活性。结果 克隆出长213 bp的hTETR启动子核心片段,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子的碱基序列完全一致;成功构建真核表达载体pGL3-hTERTp和pGL3-hTERTp-SV40en;hTETR启动子在食管癌细胞Eca-109和EC1中均有转录活性,在MRC-5细胞中无明显转录活性;hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞Eca-109和EC1中的转录活性显著高于hTETR启动子的单独转录活性。结论 hTERT启动子在食管癌细胞中具有靶向性转录活性,SV40增强子能显著增强hTERT启动子在食管癌细胞中的转录活性,有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的转录调控元件。     

转录因子KLF4与miR-106a的调控关系及其对人胃癌细胞迁移的影响

目的：探讨转录因子Krüppel样因子4（KLF4）与miR-106a表达的调控关系及其对人胃癌细胞迁移的影响。方法：使用基因组数据库UCSC预测miR-106a启动子,插入pGL3-Basic报告载体,构建野生型报告质粒pmiR-106a-WT-luc和点突变报告质粒pmiR-106a-MUT-luc。使用转录因子数据库JASPAR预测并筛选调控miR-106a的转录因子KLF4,克隆至pcDNA3.0载体,构建KLF4过表达质粒KLF4-pcDNA3.0。将KLF4^+/--pcDNA3.0与pmiR-106a-WT/MUT-luc共同转染HEK293T细胞,双荧光素酶系统检测荧光值。收集30对胃癌和癌旁组织标本,采用实时定量PCR（qPCR）检测miR-106a、KLF4 mRNA表达水平。Transwell法检测人胃癌SGC-7901细胞的迁移能力。结果：miR-106a报告质粒及KLF4过表达质粒经双酶切、PCR扩增、测序及Blast比对提示构建正确。KLF4-pcDNA3.0显著抑制pmiR-106a-WT-luc荧光素酶活性（P=0.000）,但对pmiR-106a-MUT-luc影响较小（P=0.553）。胃癌组织中KLF4 mRNA平均相对表达量为0.716±0.624,miR-106a为3.367±2.165。KLF4-pcDNA3.0部分阻遏miR-106a对胃癌SGC-7901细胞迁移的促进作用（P=0.038）。结论：转录因子KLF4与miR-106a启动子区存在直接结合位点,KLF4可能在上游转录水平负调控miR-106a成熟体表达,以此发挥部分阻遏miR-106a促胃癌细胞迁移的作用。     

LCRGl基因5’端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的：LCRGl基因的调控机制至今不清楚，本研究拟克隆LCRGl基因的转录起始区上游序列，寻找与其表达有关的调控序列。方法：利用生物信息学技术预测LCRGl基因5’端调控区域的启动子活性区域，采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp-＋585 bp）片段，并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3 basic载体中。与内参照质粒PhRL—SV40共转染COS7细胞，通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果：成功扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp- ＋585bp）片段，测序正确；pGL3—1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0．16倍，为阴性组pGL3basic的35倍。结论：成功克隆LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191 bp- ＋585bp），该片段具有启动子活性。     

人类生存蛋白启动子的克隆及其在淋巴瘤细胞中的转录活性研究

  目的　克隆人类生存蛋白（Survivin）核心启动子,研究Survivin启动子在人类淋巴瘤细胞Ramos和健康人肝脏细胞Chang Liver中的转录活性。方法　以人类肠基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子987 bp片段,将其通过酶切位点连入pGL3-Basic载体构建pGL3-Survivin荧光素酶报告基因载体,通过脂质体转染法转染Ramos和Chang Liver 细胞,通过检测荧光素酶表达水平,比较Survivin启动子在这两种细胞中的转录活性。结果　成功克隆出987 bp的Survivin启动子;双酶切、PCR检测和DNA测序证实pGL3-Survivin载体构建成功;荧光素酶活性检查显示：Survivin启动子在Ramos细胞中的转录活性为阳性对照CMV启动子活性的4.5 %,明显高于在Chang Liver细胞中的0.19 %,在淋巴瘤细胞中具有较高特异性,且在淋巴瘤细胞中的活性明显高于阴性对照pGL3-Basic的0.086 %。结论　Survivin启动子在淋巴瘤细胞中具有较高的特异性,可以作为淋巴瘤细胞基因转染的肿瘤特异性启动子使用。     

LCRG1基因5''端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚, 本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列, 寻找与其表达有关的调控序列.方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776 kb(-1 191 bp～ 585 bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3 basic载体中.与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性.结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776 kb(-1 191 bp～ 585 bp)片段,测序正确; pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3 basic 的35倍.结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191 bp～ 585 bp),该片段具有启动子活性.     

LCRG1基因5′端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚,本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列,寻找与其表达有关的调控序列。方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3basic载体中。与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,测序正确;pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3basic的35倍。结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp),该片段具有启动子活性。     

Rs10993994对前列腺癌细胞MSMB基因转录的影响

背景与目的：全基因组相关联研究发现了染色体10q11区域的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs10993994与前列腺癌的遗传易感性相关,本研究探讨rs10993994影响前列腺癌发病风险的可能机制,即研究rs10993994对前列腺癌细胞微精液蛋白β(microseminoprotein beta,MSMB)基因转录活性的影响。方法：化学合成MSMB基因的启动子序列,由于位于序列中间的SNP位点rs10993994有2种等位基因(T/C)可能,合成2条启动子MSMB promoter-T和MSMB promoter-C。将2条启动子通过酶切的方法导入荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic vectors)中,筛选阳性克隆后,将携带启动子的质粒转染入前列腺癌细胞PC-3和LNCaP中,最后通过荧光检测仪检测重组质粒中启动子的转录活性。结果：成功合成2条启动子序列：MSMB promoter-T和MSMB promoter-C;分别将启动子序列与荧光素酶报告基因载体重组,形成重组质粒pGL3-MSMB promoter-T和pGL3-MSMB promoter-C。在前列腺癌细胞PC-3中,重组质粒MSMB promoter-C组的相对荧光度为2.27±0.39,显著高于重组质粒MSMB promoter-T组(0.57±0.13),差异有统计学意义(P＜0.05);在前列腺癌细胞LNCaP中,重组质粒MSMB promoter-C组的相对荧光度为1.70±0.32,显著高于重组质粒MSMB promoter-T组(0.37±0.09),差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：重组质粒pGL3-MSMBpromoter-C的转录活性强于重组质粒pGL3-MSMB promoter-T的转录活性;rs10993994可以影响到MSMB基因启动子的启动转录活性,rs10993994位点上等位基因胞嘧啶(C)较胸腺嘧啶(T)更能促使MSMB基因转录。     

hTERT启动子的克隆及在MCF7乳腺癌细胞中的特异转录活性

背景与目的：利用肿瘤特异性启动子增强肿瘤细胞中治疗基因的转录选择性是达到基因治疗靶向性的有效途径。人端粒酶催化亚基（hTERT）在大部分肿瘤细胞中呈特异性高表达，有可能成为肿瘤特异性启动子。本文扩增了hTERT基因启动子并分别克隆于报告基因重组质粒pEGFP-1和pGL3-Basic，检测并证实hTERT启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性。方法：采用套式PCR法扩增hTERT启动子，将其分别克隆到含报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒pEGFP-1和含Luciferase的重组质粒pGL3-Basic，经脂质体分别转染人乳腺正常上皮细胞系HBL100和乳腺癌细胞MCF7，荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并测定两种细胞中荧光素酶转录表达差异。结果：与正常细胞HBL100相比，hTERT启动子在MCF7细胞呈现强的绿色荧光表达；荧光素酶活性检测与其一致，hTERT启动子在MCF7乳腺癌细胞的荧光素酶相对活性RLU／U值（33784）约相当于HBL100细胞中（2400）的15倍。结论：hTERT启动子在乳腺癌MCF7细胞中具有很强的特异性，为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定实验基础。     

t（6；11）染色体易位肾细胞癌中Alpha基因片段的克隆及启动子活性分析

  目的   构建包含不同Alpha基因片段的重组报告质粒和Alpha1-TFEB融合基因表达质粒，并评价Alpha基因启动子活性。   方法   利用软件对Alpha基因进行启动子预测；采用PCR技术扩增出5种不同长度的Alpha基因片段和正常TFEB基因启动子序列pTFEB，构建含Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒；采用脂质体转染法将其分别转染至人胚肾293T细胞；通过荧光素酶活性检测确定Alpha基因的启动子活性。同时构建含Alpha1-TFEB融合基因表达质粒，转染293T细胞后，采用Western blot法检测转染前后TFEB蛋白的表达水平。   结果   成功构建含不同Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒。与pGL3-Basic质粒转染组进行比较，Alpha1、Alpha2、Alpha3、Alpha4、Alpha5质粒转染组的荧光素酶活性显著增高（P＜0.01）；与正常TFEB基因启动子进行比较，Alpha1、Alpha2、Alpha5的荧光素酶活性明显增高（P＜0.01）；与pGL3-Enhancer质粒转染组进行比较，pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB表达质粒组TFEB蛋白的表达明显升高。   结论   t（6；11）染色体易位肾细胞癌中Alpha基因具有启动子活性，可促进TFEB表达，Alpha5片段最强活性区域位于643~693位碱基序列。      

人脂肪酸合成酶FAS启动子的克隆及其在几种肿瘤细胞中的转录活性分析

目的:克隆人脂肪酸合成酶基因FAS启动子的序列,构建重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS,并分析其在几种肿瘤细胞中的转录活性,为其作为肿瘤靶向基因治疗的工具提供依据。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增FAS启动子区680bp活性序列,经测序鉴定正确后,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-enhancer中,构建成重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS。将pGL3-FAS通过脂质体转染胃癌细胞系SGC-7901、人宫颈癌细胞系Hela、人乳腺癌细胞系SKBR3、人肝癌细胞系HepG2以及NIH3T3成纤维细胞系中,应用荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性,通过内参校正得到相对转录活性。结果:成功扩增出大小约为680bp的FAS启动子序列,经测序鉴定与Genebank报道的一致。经酶切鉴定,成功构建重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS。瞬时转染pGL3-FAS,发现其在SGC-7901、Hela、SKBR3、HepG2细胞中均具有较强的荧光素酶活性,且荧光素酶活性高于强启动子SV40驱动的pGL3-control载体;而在正常成纤维细胞中,转录活性较低。结论:FAS启动子在肿瘤细胞中具有强转录活性,而在正常细胞中转录活性很低,具有良好的肿瘤靶向性,为肿瘤靶向基因治疗提供理论依据。     

Puma荧光素酶报告基因的构建和鉴定

目的为研究p53家族调控细胞凋亡的机制,构建并鉴定插入人Puma基因的启动子片段的荧光素酶报告基因载体。方法采用PCR技术从人类HepG2细胞中扩增Puma启动子的含p53反应元件的180bpDNA片段,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。经测序确定所扩增的DNA序列;将其转染人人类肺腺癌141299细胞中,双报告基因实验检测荧光素酶活力。结果测序结果表明扩增的Puma启动子序列正确,活性检测显示构建的报告基因具有启动子活性。结论克隆了含p53反应元件的Puma启动子,成功构建了人类Puma启动子报告基因,为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料。     

人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的克隆及其在人肺癌细胞中转录活性的研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子，并检测它在多种人肺癌细胞株和人胚肺成纤维细胞株中的转录活性，为肺癌靶向性基因治疗的研究奠定基础。方法以人胚肾293细胞基因组DNA为模板，应用PCR方法克隆hTERT 5’端上游旁侧序列长约1．1kh的启动子片段，经DNA测序无误后克隆人荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建pGL3-hTER Tp重组质粒，用脂质体法瞬时转染人肺癌细胞株A549、SPC-A-1、LTEPa-2、NCI—H446、YTMLC、GLC-82、A2，以及人胚肺成纤维细胞株MRC5，转染48h后检测hTERT启动子在各细胞株中的转录活性。结果琼脂糖凝胶电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1.1kb。DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，其5’端和3’端分别位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp和43bp，片段长度为1084bp。采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒，均显示构建成功。瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示，hTERT启动子在所检测的肺癌细胞株中均有高低不同的转录活性，而在MRC-5细胞株中无转录活性。结论该实验克隆的1084bp大小的hTERT启动子在多种肺癌细胞株中均有转录活性，在人胚肺成纤维细胞中无转录活性。hTERT启动子有可能作为调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗。     

survivin启动子的克隆及在HeLa细胞中的特异生物活性

目的: 构建带有survivin启动子的pGL3Basic真核表达载体，探讨survivin启动子在HeLa细胞中的特异表达活性。 方法: 采用PCR技术扩增survivin启动子，插入pGL3Basic载体，构建携带survivin启动子的pGL3Basic真核表达载体（pGL3Basic/ Surp）。纯化pGL3Basic/ Surp质粒，用脂质体法转染HeLa细胞和正常血管内皮细胞ECV304，48 h后收集转染细胞与荧光素酶底物反应，检测荧光素酶活性。 结果: 成功克隆1 kb survivin基因启动子，并构建了携带有survivin基因启动子的pGL3Basic真核表达载体，转染后的Hela细胞荧光素酶活性为2074.2±78.5，而ECV304荧光素酶活性为9.7±1.1。 结论： 成功克隆的survivin启动子在HeLa细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性，为进一步开发肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础     

雌激素受体α介导氧化磷酸化通路在肺癌发生中的作用

目的：通过生物信息学方法探讨雌激素受体α（ESRRA）在肺癌发生发展中的作用。方法：利用UALCAN在线平台对人肺癌组织（包括肺腺癌与肺鳞癌）和癌旁正常肺组织中ESRRA基因的表达变化进行分析,并利用Kaplan-Meier Plotter数据库对肺癌中ESRRA及其相关基因的表达进行生存分析。利用GEPIA2在线平台获得与ESRRA表达模式相似的前50个基因,在GeneMANIA在线平台上构建这50个基因编码的蛋白质-蛋白质的相互作用网络,并通过DAVID数据库对该50个基因群进行GO分析和KEGG通路富集。通过TIMER 2.0在线平台分析肺癌组织中ESRRA与富集在氧化磷酸化通路中核心基因表达水平的相关性。利用Western blot法验证ESRRA蛋白在肺癌细胞系中的表达水平。结果：与癌旁正常肺组织相比,ESRRA在肺癌组织中高表达（P<0.01）,ESRRA表达水平高的肺癌患者显示出较差的预后（P<0.01）。与ESRRA表达模式相似的前50个基因主要富集在氧化磷酸化通路,包括ATP5B、ATP5G3、COX5A、COX8A、SDHD、UQCRC1和UQCRC2。其中ATP5B、COX8A和UQCRC1在肺癌组织中的表达水平与ESRRA的表达呈正相关（P<0.05）。ATP5B、ATP5G3、COX5A、COX8A、SDHD、UQCRC1和UQCRC2在肺癌组织中均高表达,ATP5B、ATP5G3、COX5A、COX8A表达水平高和SDHD表达水平低的肺癌患者均显示出较差的预后（P<0.01）。Western blot验证结果显示,与正常人支气管上皮16HBE细胞相比,ESRRA蛋白的相对表达水平在肺腺癌NCI-H1975细胞和肺鳞癌SW900细胞中均高表达（P<0.01）。结论：ESRRA介导氧化磷酸化通路中ATP5B和COX8A的表达改变引起能量代谢紊乱可能是其促进肺癌发生和导致肺癌不良预后的原因之一。