二甲双胍下调ROS-PKCβ2通路对高糖波动加重的人内皮细胞损伤的干预作用

目的观察波动性高糖与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)mRNA表达的影响,探讨活性氧(ROS)和蛋白激酶Cβ2(PKCβ2)在其中的作用及二甲双胍的干预作用。方法将培养的HUVECs分为7组:①正常糖(NG,5mmol/L D-葡萄糖)组,②正常糖空载体转染组(NN,NG+Ad5-null)组,③持续性高糖(SHG,15mmol/L D-葡萄糖)组,④波动性高糖(I HG,5mmol/L D-葡萄糖与25mmol/L D-葡萄糖每24h更换一次)组,⑤波动性高糖+PKCβ2转染(I HGB,I HG+Ad5-PKCβ2)组,⑥波动性高糖+二甲双胍(I HGM,I HG+20μmol/L二甲双胍)组,⑦波动性高糖+选择性的PKCβ2抑制剂CGP53353(I HGI,I HG+10μmol/L CGP53353)组或波动高糖+α-硫辛酸(ALA)(I HGA,I HG+62.5μmol/L ALA)组。RT-PCR法检测细胞VEGF、VCAM-1 mRNA表达水平,荧光酶标仪测定细胞ROS水平,激光共聚焦显微镜下检测PKCβ2蛋白表达和转位情况。结果与NG组比较,NN组的空载体转染对细胞无明显生物学意义(P>0.05)。SHG组和I HG组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平增加,分别为NG组的2.16倍、2.30倍、1.75倍和2.57倍、3.32倍、3.20倍,且I HG组增加更明显(P<0.05)。SHG组和I HG组PKCβ2核转位激活,定量分析显示胞质/胞核荧光强度比值较NG组分别下降了21%和26%,且I HG组下降更加明显(P<0.05);I HGB组PKCβ2核转位较I HG组更显著,胞质/胞核荧光强度比值为I HG组的75%,同时I HGB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达以及ROS水平亦显著增高,分别为I HG组的1.38倍、1.45倍和1.25倍(P<0.05)。I HGM组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平均较I HG组明显降低,为I HG组的44%、53%和39%;I HGM组PKCβ2核转位亦较I HG组减少,胞质/胞核荧光强度比值为I HG组的1.20倍(P<0.05)。结论波动高糖较持续高糖更易损伤HUVECs,该作用与ROS-PKCβ2活化密切相关;二甲双胍可通过抑制PKCβ2激活,减轻波动性高糖诱导的HUVECs损伤。     

转录共激活子p300及表观修饰在高糖致人系膜细胞代谢记忆中的汇聚作用

目的 以人系膜细胞(HMCs)作为体外模拟代谢记忆的研究对象,观察转录共激活子p300及组蛋白乙酰化蛋白H3(Ac-H3)、Ac-H4的表达规律,并探讨p300在其中的潜在汇集点作用.方法 将培养的HMCs按以下分组处理:①高糖诱导代谢记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d)、渗透压组(LG,NG+20mmol/L L-葡萄糖×2d),高糖组(HG,25mmol/L D-葡萄糖×2d)、记忆组(M1、M2、M3组,25mmol/L D-葡萄糖×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3、6、9d)、持续正糖组(NC,5.5mmol/L D-葡萄糖×9d).②糖其化终产物记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d);正糖+AGEs组(AGEs,5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d);AGEs记忆组(AGEs-M,5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);BSA组(NG+BSA,给予同浓度BSA对照).③H2O2模拟氧化应激记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×30min);正糖+H2O2组(H2O2,5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min); H2O2记忆组(H2O2-M,5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);正糖对照组(NG3,5.5mmol/L D-葡萄糖×3d).④蛋白激酶C(PKC)β2激活记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d);高糖组(HG,25mmol/L D-葡萄糖×2d);记忆组(M,25mmol/L D-葡萄糖×2d +5.5mmol/LD-葡萄糖×3d);空载体记忆组(HN,25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-null×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d); PKCβ2激活记忆组(PO,25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-PKCβ2×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);PKCβ2抑制剂记忆组(PI,25mmol/L D-葡萄糖×2d+10μmol/L CGP53353+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d).采用二氢二氯荧光素(DCFDA)及酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)的表达.Western blotting检测各组细胞p300、Ac-H3和Ac-H4及PKCβ2蛋白的表达水平.结果 HG组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达增加,分别较NG组增加了1.15倍、0.93倍和0.87倍(P＜0.05),同时伴有PKCβ2蛋白及胞内ROS水平上调;M1、M2、M3组p300、Ac-H3、Ac-H4、PKCβ2蛋白水平及ROS表达水平与NG组比较仍显著升高,即使M3组亦较NG组分别增加75％、49％、47％、98％和48％(P＜0.05).AGEs组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达上调,较对照组分别升高了1.73倍、1.08倍和1.05倍(P＜0.05),AGE-M组各蛋白较对照组分别增加了1.47倍、0.95倍和1.03倍(P＜0.05).H2O2组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达均升高,较对照组分别升高了1.03倍、0.85倍和0.79倍(P＜0.05),而H2O2-M组各蛋白表达较对照组的差异无统计学意义.与M组比较,PO组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达进一步上调,分别为M组的1.25倍、1.06倍和1.10倍(P＜0.05),选择性PKCβ2抑制剂CGP53353可以显著降低上述蛋白表达.结论 HMCs存在转录共激活子p300及表观修饰持续活化的记忆效应,p300可能系高糖致生化代谢及表观遗传记忆刺激的汇聚点.     

α-硫辛酸对高糖作用下血管内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的 观察α-硫辛酸对高糖作用下血管内皮细胞的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响.方法 实验分3组:正常对照组(NG,5.5mmol/L葡萄糖);高糖组(HG,30mmol/L葡萄糖);药物干预组[30mmol/L葡萄糖+不同浓度α-硫辛酸(50、100、200μmol/L)].脐静脉内皮细胞株在不同条件下孵育48h,采用黄嘌呤氧化酶法测定各组内皮细胞SOD活性,以硫代巴比妥酸为底物检测MDA含量,ELISA法测定各组内皮细胞ICAM-1蛋白浓度,RT-PCR法检测内皮细胞ICAM-1 mRNA表达水平.结果 与NG组相比,HG组内皮细胞SOD活性明显降低(P<0.01),MDA含量、ICAM-1蛋白及mRNA表达水平明显上升(P<0.01);与HG组相比,药物干预组内皮细胞SOD活性明显升高(P<0.01),MDA含量、ICAM-1蛋白及mRNA表达水平明显降低(P<0.05).结论 α-硫辛酸可改善高糖作用下血管内皮细胞的氧化应激,抑制内皮细胞ICAM-1的表达水平.     

过表达的p27kip1对肝癌细胞的抑制作用

目的探讨过表达的p27kip1对肝癌细胞(HHCC)的抑制作用.方法利用脂质体介导法将真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)C-p27kip1基因导入HHCC中,用Western blot检测p27kip1是否导入到HHCC中;用平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验检测过表达的p27kip1对HHCC的抑制作用;应用流式细胞仪、电子显微镜探讨过表达的p27kip1抑制HHCC生长的可能机制.结果Western blot检测表明,转染p27kip1的HHCC 100%表达p27kip1蛋白.过表达的p27kip1对HHCC有明显的抑制作用,抑制率为49.09%～56.00%;过表达的p27kip1可以封闭G1期的进程和诱导HHCC发生凋亡,凋亡百分比为12.3%.结论过表达的p27kip1可以通过诱导凋亡抑制肝癌细胞生长.     

甘草酸对高糖诱导的肾小球系膜细胞炎性因子及纤维化因子的影响

目的 探讨甘草酸(GA)对高糖诱导的肾小球系膜细胞(SV40 MES13)炎性因子及纤维化因子的影响。方法 将培养的小鼠肾小球系膜细胞(SV40 MES13)分为对照(NG)组(5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖(HG)组(30 mmol/L葡萄糖)及HG+GA组(30 mmol/L葡萄糖+200μmol/L GA)。采用Western blotting检测各组细胞炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-8及纤维化因子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平,免疫荧光检测各组IL-1β、TNF-α、α-SMA在细胞内的荧光表达强度,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组细胞培养上清中IL-1β、TNF-α、IL-6及IL-8的表达水平。结果 Western blotting检测结果显示,与NG组比较,HG组IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8及α-SMA蛋白的表达水平明显升高(P<0.01);与HG组比较,HG+GA组IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和α-SMA蛋白表达量降低(P<0.05)。细胞免疫荧光结...     

脂联素对高糖环境下人肾小管上皮细胞凋亡及氧化应激水平的影响

目的探讨脂联素对体外高糖环境下培养的人近曲肾小管上皮细胞(HK-2细胞)凋亡及氧化应激水平的影响。方法将人近曲肾小管上皮细胞分为3组:正常对照组(5.5mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(30.0mmol/L D-葡萄糖)、高糖+脂联素组(30.0mmol/L D-葡萄糖+2.5μg/ml脂联素),各组细胞分别培养24、48、72h后,采用流式细胞仪测定细胞凋亡率,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量,实时荧光定量PCR测定细胞血红素加氧酶-1(HO-1)及衔接蛋白p66Shc mRNA表达水平。结果与正常对照组相比,高糖组细胞凋亡率增高,细胞培养液内SOD活性下降,MDA含量增高,同时诱导细胞HO-1及p66Shc mRNA表达上调,且呈时间依赖性(P<0.05)。与高糖组相比,高糖+脂联素组细胞凋亡受到抑制,细胞培养液内SOD活性增高,MDA含量降低,细胞HO-1 mRNA表达进一步增强,而p66Shc mRNA表达降低,呈时间依赖性(P<0.05)。结论随时间延长,高糖环境可引起HK-2细胞过度凋亡和高水平氧化应激;脂联素可通过延缓细胞凋亡和抑制氧化应激来发挥对肾脏的保护作用。     

YAP对高糖培养大鼠心脏成纤维细胞活化作用的影响及其机制

目的 探究Yes相关蛋白(YAP)对高糖诱导的大鼠心脏成纤维细胞(CFs)增殖和转分化的影响及其作用机制。方法 分离培养1～3日龄SD大鼠CFs,用40.0 mmol/L葡萄糖诱导CFs,构建糖尿病心肌病(DCM)细胞模型,24 h后检测细胞YAP、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(collagenⅢ)、结缔组织生长因子(CTGF)的表达水平。取原代大鼠CFs,分别设置正常糖(5.5 mmol/L D-Glucose,NG)组、高糖(40.0 mmol/LD-Glucose,HG)组、NG+维替泊芬(NG+VP)组、HG+VP组。VP为YAP抑制剂,剂量为0.5μmol/L。各组处理CFs24 h后,采用波形蛋白免疫荧光法鉴定CFs,Ki-67免疫荧光染色检测各组细胞增殖情况,Westernblotting检测各组YAP、α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ、CTGF蛋白表达水平。结果 免疫荧光法鉴定波形蛋白阳性,提示原代培养的细胞为大鼠CFs。Ki-67免疫荧光检测结果显示,与NG组比较,HG组CFs的Ki-67阳性率(%...     

BMP-7对高糖诱导近端肾小管上皮细胞外基质及NF-κΒ表达的影响

目的探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)对高糖诱导近端肾小管上皮细胞(HKc)表达细胞外基质及核转录因子-κΒ(NF-κΒ)的干预作用。方法采用人近端肾小管HKc细胞株,将细胞分为正常对照组(NG,5·5mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,25mmol/L葡萄糖)、HG 100ng/mlBMP-7组、NG 100ng/mlBMP-7组、高渗组(HM,25mmol/L甘露醇)。应用免疫细胞化学和ELISA技术检测细胞Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤维连接蛋白(FN)表达,用凝胶电泳迁移率竞争试验(EMSA)检测NF-κΒ的表达。结果高糖作用下NF-κΒ活性和Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白表达显著增高,加入100ng/mlBMP-7后可显著抑制NF-κΒ活性及Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结论BMP-7可能通过抑制NF-κΒ活性而从转录水平抑制高糖诱导的近端小管细胞细胞外基质的过度表达。     

降低B7-H3蛋白对受照肺癌细胞A549细胞周期和凋亡的影响

目的观察用小干扰RNA（siRNA）敲降B7-H3蛋白的表达对人肺癌细胞A549的细胞周期和凋亡的影响。 方法培养人肺癌A549细胞,将B7-H3蛋白siRNA瞬时转染于A549细胞（称为siB7-H3转染组）。实验分为4组,即对照组、siB7-H3转染组、照射组、照射+siB7-H3转染组。采用137Cs γ射线一次性照射,照射剂量为4 Gy;用Western blotting法和实时定量PCR分别检测B7-H3蛋白和mRNA的表达;流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的改变。 结果与对照组相比,siB7-H3转染组的B7-H3蛋白水平明显降低,mRNA表达量也明显低于对照组且差异有统计学意义（t=-4.222,P=0.013）。siB7-H3转染组细胞的G0/G1期细胞阻滞,S和G2/M期细胞数量减少;与对照组相比,照射组出现轻微的G0/G1期阻滞和明显的G2/M期细胞阻滞,照射+siB7-H3转染组的G0/G1、G2/M期均有明显的阻滞。照射后48 h,与对照组相比,照射组细胞的坏死率和凋亡率明显升高,siB7-H3转染组和照射+siB7-H3转染组的坏死率和凋亡率均无明显改变。 结论降低肺癌A549细胞中B7-H3蛋白表达水平可明显增加辐射诱导的G0/G1期阻滞,从而提示B7-H3表达水平的改变可能通过调节G0/G1细胞周期检查点而对肺癌细胞放射敏感性产生重要的调节功能。     

替米沙坦对心肌细胞脂联素受体1表达的影响及其可能机制研究

目的探讨替米沙坦调节糖尿病心肌细胞脂联素受体1表达的作用机制。方法取H9C2心肌细胞作为研究对象,分两个部分进行实验。第一部分检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)抑制的影响:以不同浓度(0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)AngⅡ作用48h以及AngⅡ(10-7mol/L)作用不同时间(0、12、24、36、48h)后检测心肌细胞内脂联素受体1 m RNA和蛋白的表达;以10-5mol/L替米沙坦孵育1h,然后用10-7mol/L AngⅡ培养24h后检测前述指标的表达。第二部分检测过氧化物酶体增殖物活化受体-γ(PPAR-γ)激活的影响:将H9C2心肌细胞分5组:1对照组(NG组);2高糖组(HG组);3高糖+替米沙坦组(HG+T组);4高糖+替米沙坦+PPAR-γ抑制剂GW9662组(HG+T+GW组);5低糖+甘露醇组(NG+M组)。按分组处理24h后检测心肌细胞脂联素受体1 m RNA和蛋白的表达。采用实时荧光定量聚合酶链反应法和免疫印迹法测定心肌细胞脂联素受体1 m RNA和蛋白的表达。结果在AngⅡ浓度为10-8、10-7、10-6、10-5mol/L时心肌细胞脂联素受体1 m RNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05),尤以10-7mol/L时下降最显著(P<0.01)。10-7mol/L AngⅡ作用12、24、36、48h后心肌细胞脂联素受体1 m RNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05),尤以24h下降最显著(P<0.01)。替米沙坦可显著上调AngⅡ作用后的心肌细胞脂联素受体1 m RNA和蛋白表达(P<0.05)。与NG组比较,HG组心肌细胞脂联素受体1 m RNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),而NG+M组表达无显著变化(P>0.05)。与HG组比较,HG+T组心肌细胞脂联素受体1m RNA和蛋白表达显著升高(P<0.05);与HG+T组比较,HG+T+GW组心肌细胞脂联素受体1 m RNA和蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论高糖和AngⅡ可显著降低心肌细胞脂联素受体1的表达。替米沙坦通过激活PPAR-γ、抑制AngⅡ而上调高糖培养的心肌细胞脂联素受体1的表达。     

外源表达miR-34a对H1299细胞辐射敏感性的影响

目的 研究miR-34a对H1299细胞辐射敏感性的影响.方法 采用pre-miR-34a瞬时转染H1299细胞,接受不同剂量(0、2、4、6和8 Gy)γ射线照射后,利用CCK-8试剂盒检测细胞活性.流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,real-time PCR检测miR-34a靶基因bcl-2、bax、CDK4、CDK6及cyclinD1的表达水平.结果 不同剂量(0、2、4、6和8 Gy)γ射线照射后,与阴性对照转染组相比,pre-miR-34a转染组各剂量点细胞活力明显降低(t=-2.39、-3.12、-4.98、-4.03、-3.06,P＜0.05),并与阴性对照转染组的差值呈剂量依赖性的增加.6 Gyγ射线照射后,与阴性对照转染组相比,pre-miR-34a转染组细胞凋亡率明显增加(t=7.06,P＜0.05),细胞G0/G1期阻滞(t =3.94,P＜0.05),S期细胞减少(t=6.23,P＜0.05),bcl-2、CDK4及CDK6明显下调(t=3.39、12.88、6.21,P＜0.05),cyclinD1有下降趋势,但差异无统计学意义,而bax明显上调(t=-4.35,P＜0.05),是阴性对照转染组的1.94倍,bcl-2/bax比值下降.结论 miR-34促进H1299细胞凋亡,诱导细胞G0/G1期阻滞,抑制细胞活性,进而提高H1299细胞的辐射敏感性.     

醛固酮自分泌环在高糖致人系膜细胞损伤中的作用

目的研究高糖环境下人系膜细胞(HMC)中醛固酮自分泌环及活性氧(ROS)、癌胚纤连蛋白(FN)表达水平的变化,进一步探讨醛固酮自分泌环与ROS、癌胚FN mRNA表达的关系。方法常规培养HMC,取对数生长期细胞分为5组:正糖组(5mmol/L D-葡萄糖),渗透压对照组(5mmol/L D-葡萄糖+20mmol/L L-葡萄糖),正糖+依普利酮组(5mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L依普利酮),高糖组(25mmol/L D-葡萄糖),高糖+依普利酮组(25mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L依普利酮)。采用RT-PCR法检测醛固酮合酶(CYP11B2)、11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅱ(11βHSD2)、癌胚FN mRNA表达水平,Western blotting检测CYP11B2蛋白表达水平,放射免疫法分析细胞培养液中醛固酮水平,通过激光共聚焦显微镜观察盐皮质激素受体(MR)蛋白表达及转位情况,荧光显微镜和荧光酶标仪检测细胞内ROS水平。结果与正糖组比较,高糖组HMC细胞CYP11B2 mRNA及蛋白表达上调,ROS和癌胚FN mRNA表达亦上调,培养液中醛固酮浓度升高(P<0.05)。高糖可促进MR蛋白发生核转位,定量分析显示高糖组胞质/胞核荧光强度比值较正糖组降低30%(P<0.05)。与高糖组比较,高糖+依普利酮组ROS及癌胚FN mRNA表达下调(P<0.05)。结论高糖负荷可通过激活HMC局部醛固酮自分泌环而导致HMC损伤。     

miR-302a在胃癌中表达及其对胃癌细胞凋亡与细胞周期影响

目的研究微小RNA-302a(miRNA-302a)在胃癌标本中的表达水平与临床病理特征的关系,以及其对胃癌细胞的凋亡和细胞周期调控作用,以探讨将miR-302a用于胃癌生物靶向治疗的可能性。方法采用实时PCR(RT-PCR)方法检测胃癌组织和正常胃黏膜组织中miR-302a的相对表达水平,并分析其与对应患者的临床病理资料的相关性。同时,采用RTPCR方法检测miR-302a在胃癌细胞株SGC-7901、MGC-803和BGC-823及正常胃黏膜细胞GES-1中的表达情况;选取miR-302a表达水平最低者为癌细胞,并转染过表达miR-302a的真核重组质粒p CDNA3.1-miR-302a;转染后,采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法和PI单染法检测miR-302a对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果胃癌组织中miR-302a的相对表达水平显著低于癌旁正常胃癌黏膜组织(P<0.05),且其表达与临床分期、病理分级和转移均有密切关系(P<0.05)。同时,在胃癌细胞SGC-7901、MGC-803和BGC-823中miR-302a的相对表达水平显著低于正常细胞GES-1中的表达(P<0.05),且在BGC-823中表达水平最低。p CDNA3.1-miR-302a质粒转染组与空白组和p CDNA3.1质粒转染组比较,miR-302a质粒转染后48 h后细胞凋亡水平显著升高,且G2/M期细胞数显著增高(P<0.05)。结论在胃癌组织和细胞中miR-302a均呈现低水平表达,当miR-302a过表达后,能显著增高胃癌细胞的凋亡水平并使细胞出现G2/M期阻滞,可能成为胃癌治疗的新靶点。     

α-硫辛酸对高糖诱导的系膜细胞核因子-κB活性的抑制作用

目的探讨α-硫辛酸对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖及核因子-κB(NF-κB)活性的影响。方法在体外条件下采用正常糖(NG)、高糖(HG)及HG 不同浓度α-硫辛酸处理大鼠系膜细胞;噻唑蓝法(MTT)测定系膜细胞增殖;采用凝胶电泳迁移率改变法检测NF-κB的活性。结果50~300μmol/L的α-硫辛酸可抑制系膜细胞增殖。HG刺激系膜细胞1h可引起NF-κB活性增强2·2倍(P<0·01),高糖诱导的NF-κB的活化可被α-硫辛酸(200μmol/L)所抑制(0·6±0·3vs2·2±0·2,P<0·01)。结论一定浓度的α-硫辛酸可抑制高糖诱导的系膜细胞增殖,并可降低NF-κB的DNA结合活性。     

15-脱氧前列腺素J2和PTEN质粒体外转染对乳腺癌MCF-7细胞株生长的抑制作用

目的探讨15d-PGJ2和PTEN质粒转染对体外培养的人乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用。方法MCF-7细胞接种96孔板,按2&#215;2析因设计设置4个试验组。转染组用脂质体转染法将pcDNA3.0-PTEN质粒1μg转染MCF-7细胞；联合组给予pcDNA3.0-PTEN转染和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ天然激动剂15d-PGJ2 40μmol/L；干预组15d-PGJ2 40μmol/L处理细胞；对照组常规培养的MCF-7细胞不做任何处理。采用MTT法观察15d-PGJ2和质粒转染对MCF-7细胞的生长抑制作用；用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化。结果MTT法检测细胞吸光度（A）值结果显示,与对照组相比,转染组、干预组均能有效地抑制MCF-7细胞生长。在48、72、96h时点,联用组的效果较其他两组的抑制作用更明显（P〈0.05）。对照组细胞在各时间点均未显示出生长抑制；24h时点转染组、联合组、干预组的细胞抑制率分别为2%、0%、0%；在48h时点分别为28%、39%、26%；在72h时点分别为74%、84%、70%；在96h时点分别为85%、89%、80%。细胞周期检测结果显示,与对照组比较,转染组对G0、G1期细胞的阻滞作用较强（P〈0.05）,干预组作用较弱（P〈0.05）。联合组的G0、G1期阻滞效应较转染组弱（P〈0.05）,但较干预组强（P〈0.05）。细胞凋亡检测显示,与对照组相比,转染组、干预组和联合组均不能有效地诱导MCF-7细胞凋亡（P〈0.05）。结论PTEN基因转染和靶向药物15d-PGJ2联合作用于体外培养的乳腺癌细胞株MCF-7,能有效抑制细胞生长,但并不诱导细胞凋亡。     

干预FoxM1表达对食管癌细胞增殖、周期及凋亡的影响

 目的 探讨干预FoxM1表达对食管癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法 选择FoxM1高表达食管癌细胞株,构建FoxM1-shRNA干扰质粒转染食管癌细胞,观察干预FoxM1表达对食管癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果 成功转染后细胞中FoxM1蛋白水平表达明显降低(t=13.17, P<0.01),细胞增殖明显受抑并呈时间依赖性,72 h抑制效果最显著(68.0%±6.4%,P<0.05);干预组细胞增殖周期发生G₁期阻滞(59.14%±1.69% vs 40.51%±1.45%,t=14.23,P<0.01)、细胞凋亡增加(2.48%±0.49% vs 35.37%±0.56%,t=76.56,P<0.01)。结论 干预FoxM1表达使细胞周期发生G1期阻滞并能促进细胞凋亡,从而抑制TE1细胞增殖,FoxM1可能是食管癌基因治疗潜在的有效靶点。     

PTEN对糖尿病肾病肾间质纤维化的作用及其机制

目的 探讨同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）对糖尿病肾病肾间质纤维化的作用及其可能机制。方法 将体外培养的大鼠近端肾小管上皮（NRK52E）细胞分为正常糖（NG）组、高糖（HG）组及高渗（MA）组,采用Western blotting检测各组PTEN、LC3、P62、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达水平。另将NRK52E细胞分为正常糖对照（NG）组、高糖对照（HG）组和高糖过表达PTEN（HG+pPTEN）组,采用激光共聚焦显微镜观察PTEN对自噬的影响,并在荧光显微镜下观察PTEN对胶原表达的影响。结果 Western blotting检测结果显示,与NG组比较,HG组PTEN、LC3表达水平明显降低,而P62、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达水平明显升高,差异均有统计学意义（_P<0.01）,而MA组PTEN、LC3、P62、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达水平无明显变化。激光共聚焦显微镜观察结果显示,HG组红色斑点和黄色斑点数减少,表明存在明显的自噬抑制,而其余两组未见明显自噬抑制。细胞免疫荧光染色结果显示,HG组PTEN红色荧光减弱、表达降低,胶原荧光染色增强、表达升高,而其余两...     

索拉非尼联合顺铂抑制肝癌HepG2细胞生长的体外研究

目的探讨索拉非尼联合顺铂(DDP)对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用及其可能的分子机制。方法实验细胞分为4组:空白对照组、索拉非尼单药组、顺铂单药组、索拉非尼联合顺铂组。索拉非尼和顺铂单独或联合作用于细胞,以MTT法检测24、48、72、96h时间点药物对HepG2细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测24、48h时间点的细胞周期与凋亡率。在药物作用后24h,用荧光染料罗丹明123(Rh123)染色细胞,流式细胞仪测定线粒体跨膜电位(ΔΨm),分光光度法检测caspase-3活性。结果索拉非尼及顺铂单独应用对HepG2生长均有抑制作用,且低剂量联合具有协同作用。联合用药可以使细胞周期阻滞于G0/G1期和G2期,且凋亡率明显高于单药组(P<0.05)。单独应用顺铂和索拉非尼均能使线粒体跨膜电位降低,而联合组作用强于单药组(P<0.05)。药物作用后caspase-3活性增高,联合组高于单药组(P<0.05)。结论索拉非尼联合顺铂能更好地抑制肝癌HepG2细胞增殖,并促进其凋亡,其机制可能与细胞周期阻滞、线粒体跨膜电位降低及caspase-3活性增加有关。     

Smac基因联合12C6+离子照射对膀胱癌EJ细胞的生物效应观察

目的观察smac基因能否提高膀胱癌EJ细胞12C6 离子照射的生物效应。方法实验分为3组:空白对照组、转染空载体组、转染smac基因组。利用免疫组化及流式细胞仪方法检测3组细胞内smac基因表达。转染24h后对3组分别进行0、2和4Gy12C6 离子照射,用克隆形成实验对3个组分别检测细胞的存活分数并利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果免疫组化结果表明转染pcDNA3.1/smac的细胞其smac基因表达量明显高于转染空载体pcDNA3.1的细胞和空白组细胞。流式细胞仪数据显示,smac基因转染细胞smac基因的荧光强度(3080)显著高于转染空载体组(2256)(P<0.05),而后者与空白对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。克隆形成实验结果表明,转染smac基因组细胞12C6 离子照射后的存活分数较转染空载体组细胞显著降低(P<0.05)。流式细胞仪测定结果表明,12C6 离子照射的转染smac基因组的细胞凋亡率明显高于转染空载体组(P<0.05)。结论外源smac基因转染膀胱癌细胞株能显示高表达,并能提高膀胱癌细胞的凋亡率,与12C6 离子照射结合后能显著降低细胞存活分数和进一步增高凋亡率。     

生长分化因子11对高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡的影响

 目的 探讨生长分化因子11(growth differentiation factor 11,GDF1)对高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡的影响。方法 将人甲状腺乳头状癌K1细胞分为3组:对照组(Vehicle)、高糖组(HG)和GDF11组(HG+GDF11;GDF11)。各组细胞培养3 d后,流式细胞术检测细胞凋亡率,western blot检测凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2的蛋白水平,实时荧光定量逆转录PCR检测核转录因子E2相关因子(nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)的转录表达,活性氧(ROS)试剂盒检测细胞内的ROS水平。结果 与对照组相比,高糖环境中K1细胞的凋亡率降低,Bcl-2/Bax蛋白表达比升高,Nrf2基因表达上调,细胞内ROS水平下降;而GDF11干预显著提高高糖环境中K1细胞的凋亡率,降低Bcl-2/Bax蛋白表达比,下调Nrf2基因转录表达,并提高细胞内的ROS水平。结论 GDF11可能通过提高高糖环境中K1细胞内的氧化应激反应促进细胞凋亡。