SNHG1在胆管癌组织及细胞中的表达及意义

目的:探讨长链非编码RNA核仁小分子RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1,SNHG1)在胆管癌组织和细胞中的表达及临床意义.方法:RT-PCR检测64例胆管癌组织及其配对的癌旁组织、胆管癌细胞(RBE和QBC939)和正常肝内胆管上皮细胞(HIBE)中SNHG1的相对表达水平...     

缺氧诱导因子-1α与着丝粒蛋白W在人胶质瘤组织及细胞中表达的相关性

目的 :探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)与着丝粒蛋白W(centromere protein W,CENP-W)在人胶质瘤中表达的相关性。方法 :采用免疫组织化学法分别检测高级别胶质瘤、低级别胶质瘤及瘤旁正常脑组织中HIF-1α和CENP-W的表达水平,并统计学分析蛋白表达水平与胶质瘤临床病理特征的关系,以及两蛋白表达之间的相关性。用氯化钴抑制胶质瘤U251细胞中HIF-1α的分解,然后分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法检测CENP-W蛋白及m RNA表达的变化。应用特异性小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)技术下调U251细胞的HIF-1α表达后,采用蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法检测CENP-W蛋白及m RNA表达的变化。应用特异性si RNA下调U251细胞中CENP-W表达后,采用蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法检测HIF-1α蛋白及m RNA表达的变化。结果:胶质瘤组织中HIF-1α和CENP-W的表达水平明显高于癌旁正常组织(P<0.05),并且与胶质瘤的病理级别明显相关(P<0.05);两蛋白表达水平之间也呈正相关性(r=0.709,P<0.05)。氯化钴作用U251细胞后,HIF-1a和CENP-W蛋白及m RNA的表达水平均明显升高(P<0.01)。si RNA干扰HIF-1α表达后,CENP-W蛋白及m RNA表达水平均明显降低(P<0.01);而si RNA干扰CENP-W表达后,HIF-1α蛋白及m RNA表达水平无明显变化(P>0.05)。结论:HIF-1α和CENP-W表达均与胶质瘤的病理级别呈正相关性。HIF-1α可以调节CENP-W的表达。     

RNA干扰真核翻译延长因子1A1抑制肝癌Hep3B细胞的增殖

目的 :探讨RNA干扰真核翻译延长因子1A1(eukaryotic translation elongation factor 1A1,e EF1A1)的表达对肝癌Hep3B细胞增殖能力的影响及其可能的作用机制。方法 :构建靶向e EF1A1的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)重组载体p GPU6/GFP/Neo-e EF1A1-sh RNA,并将其转染至肝癌Hep3B细胞中,随后应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测e EF1A1 m RNA和蛋白的表达,CCK-8(cell counting kit 8)法检测细胞的增殖能力,平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力,FCM法检测细胞周期的变化,蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)的表达。结果 :成功构建重组载体p GPU6/GFP/Neo-e EF1A1-sh RNA,并获得稳定低表达e EF1A1的肝癌Hep3B细胞。p GPU6/GFP/Neo-e EF1A1-sh RNA转染组Hep3B细胞中e EF1A1 m RNA和蛋白的表达水平明显低于阴性对照组(转染阴性对照载体p GPU6/GFP/Neo-NC的Hep3B细胞)和空白对照组(未转染的Hep3B细胞)(P<0.01,P<0.05)。与阴性对照组比较,p GPU6/GFP/Neo-e EF1A1-sh RNA转染组Hep3B细胞的体外增殖能力和克隆形成能力明显下降(P<0.05,P<0.01),G1期细胞所占比例明显上升(P<0.01),S期细胞所占比例明显下降(P<0.05),cyclin D1和CDK4蛋白的表达水平明显下调(P<0.05)。结论 :下调e EF1A1的表达可以抑制肝癌Hep3B细胞的增殖能力。     

长链非编码RNA MAFG-AS1通过靶向miR-143-3p/AKT2轴促进胃癌的进展

目的:探讨长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA) MAFG-AS1在胃癌(gastric cancer,GC)的发生和发展中的生物学功能及可能的作用机制.方法: 分别用GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis)和Kap...     

沉默或抑制TAK1表达能够通过NF-κB信号通路改善卵巢癌细胞的紫杉醇耐药性

目的:探究利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)或转化生长因子 β活化激酶1[transfor-ming growth factor-β(TGF-β)-activated kinase 1,TAK1]抑制剂5 Z-7-oxozeaenol进行靶向沉默或抑制TAK1表达对卵巢癌细胞紫杉...     

lncRNA AFAP1-AS1在视网膜母细胞瘤组织中的表达及其临床意义

目的:探讨长链非编码RNA (lncRNA)肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1(AFAP1-AS1)在视网膜母细胞瘤(RB)组织中表达的临床意义及相关机制.方法:收集2015年12月至2019年12月于本院行眼球摘除术的RB患儿36例,取患儿RB组织以及癌旁组织作为研究样本,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测...     

LINC00519通过miR-876-3p/HMGA1轴调控胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭

目的:探讨长基因间非编码RNA 00519(long intergene non-coding RNA 00519,LINC00519)调控miR-876-3p/高迁移率家族蛋白A1(high mobility group protein A1,HMGA1)轴在胃癌HGC-27细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭中的作用.方法...     

RNAi抑制ALK1对人胃腺癌SGC-7901细胞增殖的影响

背景与目的:人活化素受体样激酶-1(activin receptor-like kinase-1,ALK1)可促进内皮细胞增殖,与肿瘤内血管生成密切相关.本研究采用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)抑制ALK1表达,观察抑制效果以及抑制ALK1表达后对人胃癌细胞增殖的影响.方法:设计3条靶向ALK1基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),克隆到真核表达质粒pGenesil-1,转染人胃癌细胞株SGC-7901.分别采用Real-time PCR和Western blot技术检测胃癌细胞ALK1 mRNA及其蛋白表达的变化,并检测细胞周期及生长曲线.结果:与阴性对照相比,第3条ALK1干扰RNA在mRNA及蛋白水平均可明显下调ALK1基因表达,并抑制SGC-7901细胞增殖.结论:RNAi技术导致的ALK1表达下调并抑制胃癌细胞增殖,ALK1可作为胃癌抗肿瘤治疗的理想靶点.     

BRAFV600E突变基因沉默可抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖

目的 :通过RNA干扰技术使v-raf鼠类肉瘤滤过性病毒致癌基因同源体B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)的突变基因BRAFV600E表达沉默,探讨该基因沉默在甲状腺乳头状癌细胞体外增殖中的作用。方法:将携带靶向BRAFV600E基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)的质粒载体(命名为BRAFV600E-sh RNA)转染甲状腺乳头状癌CGTHW3细胞株,然后采用半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测BRAFV600E-sh RNA转染对BRAFV600E突变基因表达的抑制作用,以及丝裂原细胞外激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen extracellular kinase/extracellular signal-regulated kinase,MEK/ERK)信号通路相关蛋白表达水平的变化;采用MTT法检测BRAFV600E突变基因沉默后甲状腺乳头状癌细胞体外增殖能力的变化;采用FCM法检测细胞周期分布的变化。结果 :特异性BRAFV600E-sh RNA转染可明显抑制甲状腺乳头状癌细胞中BRAFV600E突变基因的m RNA和蛋白表达,且使MEK/ERK信号通路中Ras、磷酸化MEK(phospho-MEK,p-MEK)和p-ERK蛋白的表达量明显减少(P值均<0.05)。与未转染的空白对照组相比,BRAFV600E-sh RNA转染后72 h时CGTHW3细胞的增殖活性明显降低(P<0.05);转染组中G0/G1期细胞所占比例明显高于空白对照组,而S期细胞所占比例明显降低(P值均<0.05)。结论 :BRAFV600E突变基因沉默可能通过阻断MEK/ERK信号通路,有效抑制甲状腺乳头状癌细胞的体外增殖。     

人肺癌组织总RNA转染树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的研究

目的:探讨以人肺癌组织总RNA体外转染树突状细胞(dendritic cells,DCs)诱导细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymptocyte,CTL)发挥特异性抗肿瘤免疫的作用.方法:10例肿瘤组织经免疫组化测定为CEA、MUC1双阳性.一步法提取肿瘤组织总RNA和10例正常肺组织RNA.采集患者外周血单个核细胞体外诱导未成熟DCs,电穿孔法转染肿瘤和肺组织RNA,刺激DCs成熟后,部分行流式细胞仪检测,部分用于体外诱导CTL.以原代培养的肿瘤细胞和肺上皮细胞作为靶细胞,定量乳酸脱氢酶法测定杀伤率.结果:体外培养的DCs形态典型,高表达CD86、CD80、CD40、HLA-DR和CD83.转染肿瘤组织RNA DCs的CEA和MUC1表达量为(20.53±3.64)%和(65.39±9.33)%,明显高于转染肺组织RNA的DCs[(0.78±0.39)%和(18.32±4.24)%],P＜0.01.肿瘤组织RNA转染DCs诱导的CTL可产生针对肿瘤细胞的特异性杀伤;且用自身肿瘤组织RNA转染DCs诱导的CTL对自身肿瘤细胞杀伤活性最大.结论: 以人肺癌总RNA体外转染DCs诱导CTL可以产生特异性抗肿瘤免疫,此方法构建肺癌疫苗是可行的.     

长链非编码RNA AFAP1-AS1 在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)肌动蛋白纤维相关蛋白-1反义RNA1(actin filament-associated protein 1-antisense RNA1,AFAP1-AS1 RNA1)在胃癌组织中的表达情况及其临床意义.方法:采用Real-time PCR方法检测2010年1月至2014年12月宜昌市第二人民医院及三峡大学仁和医院手术切除的274例胃癌组织及相应癌旁正常胃组织中AFAP1-AS1的表达,并分析AFAP1-AS1表达量与临床及病理特征的关系.结果:AFAP1-AS1在胃癌组织比癌旁正常组织显著高表达(P＜0.01).AFAP1-AS1在早期胃癌组织中平均表达量明显低于进展期胃癌(P＜0.01).在不同病理类型胃癌中,AFAP1-AS1的表达量没有差异(P＞0.05).AFAP1-AS1表达量和胃癌淋巴侵袭或远处转移密切相关,在伴有淋巴结侵袭或远处转移的胃癌组织中,AFAP1-AS1明显高表达(P＜0.01).结论:AFAP1-AS1可能是胃癌发生发展的一个重要因素;有望成为新的胃癌预后标志物,用于胃癌的临床诊断和预后判断.     

survivin基因的RNA干涉抑制人乳腺癌SKBr-3细胞体外增殖的作用

目的:研究RNA干涉(RNAinterference,RNAi)抑制survivin基因表达后对人乳腺癌SKBr3细胞体外增殖能力的影响。方法:通过RTPCR和间接免疫荧光检测转染survivin靶向的小干涉RNA表达载体pSUPERS1后SKBr3细胞中survivin基因的表达;集落形成实验、MTT比色法检测细胞体外增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期。结果:转染pSUPERS1后,SKBr3细胞中survivin的mRNA和蛋白表达水平明显降低;克隆形成率(38±16.70)%比对照组(90.3±4.04)%显著降低;细胞增殖减慢,主要阻滞于G1期(74.03±8.91)%。结论:RNA干涉沉寂survivin基因表达后明显抑制了人乳腺癌SKBr3细胞的体外增殖能力。     

GAS6-AS1调节miR-370-3p/SPATA2轴对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和EMT的影响

目的:探讨长链非编码RNA GAS6反义RNA1(long non-coding RNA GAS6 antisense RNA1, lncRNA GAS6-AS1)调节miR-370-3p/精子发生相关蛋白2 (spermatogenesis-associated protein 2, SPATA2)轴对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)的影响。方法:qRT-PCR、Western blot分别检测癌旁组织、卵巢癌组织、人正常卵巢上皮细胞IOSE80及卵巢癌细胞系HO-8910、SKOV3、A2780中GAS6-AS1、miR-370-3p及SPATA2蛋白表达。将SKOV3细胞分为：对照组(NC组)、 si-NC组、si-GAS6-AS1组、mimic NC组、miR-370-3p mimic组、si-GAS6-AS1+inhibitor NC组、si-GAS6-AS1+miR-370-3p inhibitor组,qRT-PCR检测细胞中GAS6-AS1、miR-370-3p表达;CC...     

RNA干扰沉默PPARγ对人胃癌细胞生长的影响

目的:采用RNA干扰技术探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ)表达在人胃癌中的作用.方法:根据人 PPARγ基因序列设计获得3个小干扰RNA(small interfering nRNA,siRNA)靶位点,并构建了3个针对靶位点的一个载体编码一个短发夹状RNA(shRNA)的质粒表达载体(Y1、Y2和Y3),同时合成了1个阴性对照质粒表达载体(HK),采用阳离子脂质体将质粒转染人胃癌MGC803细胞,FCM法观察转染效率.分别采用RT-PCR和Western印迹法检测PPARγ mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖,相差倒置显微镜、Hoechst33342染色和FCM检测细胞凋亡.结果:RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默PPARγ表达后抑制人胃癌MGC803细胞增殖并诱导其凋亡.结论:PPARγ高表达可能通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡促进人类胃癌的形成,PPARγ有望成为治疗胃癌的新靶点.     

淋巴网细胞瘤与其他肿瘤病人用“免疫”RNA传递细胞媒介的皮肤反应

以皮试反应阳性的正常人或病人的“免疫”RNA,对皮试阴性的44例淋巴网细胞瘤(何杰金氏病)与其他肿瘤病人作皮试反应传递作用的试验。用作皮试反应的为:链激酶与链道酶(streptokinase andstreptodornase 或称 Varidase),经纯化的蛋白衍生物(PPD),念珠菌提取物,腮腺炎病毒抗原,与 Trichophyton 提取物。“免疫”RNA(总 RNA)是分别从下述三个人的外周淋巴细胞或脾细胞取得的:(1)一个     

长链非编码RNA STMN1P2在乳腺癌中的作用及机制研究

背景与目的:长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在肿瘤进展中发挥重要调控作用,我们的前期研究通过lncRNA表达谱芯片筛选发现,微管不稳定蛋白1假基因2(stathmin 1 pseudogene 2,STMN1P2)在乳腺癌中高表达,但其生物学功能以及在乳腺癌中的作用尚未见报道.探...     

EGFR-T790M突变所致吉非替尼耐药肺腺癌细胞化疗药物敏感性变化的研究

背景与目的:EGFR-TKI治疗NSCLC失败后,化疗仍可取得一定的治疗效果,是可选择的治疗方案之一。核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase,RR)、胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)、核苷酸切除修复交叉互补基因1(excision repair cross complementstion group 1,ERCC1)、3型β微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ,TUBB3)分别与吉西他滨、培美曲塞、铂类药物及微管类药物的化疗药物敏感性存在相关性,可以通过这些分子标志物的表达水平来预测化疗药物的敏感性。RRMI、TS、ERCC1和TUBB3高表达患者化疗药物的敏感性降低,低表达患者化疗药物敏感性增高。本研究拟探讨EGFR-T790M突变所致吉非替尼耐药肺腺癌细胞对顺铂、吉西他滨、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛和培美曲塞化疗药物敏感性的变化。方法:通过MTT法检测PC9及PC9/GR细胞对顺铂、吉西他滨、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛和培美曲塞的IC50,探讨其对上述药物的化疗敏感性。采用液相芯片法,检测PC9及PC9/GR细胞ERCC1 m RNA、RRM1 m RNA、TUBB3 m RNA和TS m RNA的表达水平。通过蛋白质印迹法(Western blot)检测PC9及PC9/GR细胞ERCC1、RRM1、TUBB3和TS蛋白的表达水平。结果:与PC9细胞株相比较,PC9/GR细胞株对吉非替尼、顺铂、吉西他滨和培美曲塞的IC50明显增高(P<0.05);对长春瑞滨、紫杉醇和多西他赛的IC50明显降低(P<0.05)。PC9/GR细胞对吉非替尼、顺铂、吉西他滨、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛和培美曲塞的耐药指数分别为70、1.56、1.61、0.34、0.39、0.14和1.71。与PC9细胞株m RNA的表达量相比较,PC9/GR细胞株ERCC1 m RNA、RRM1 m RNA和TS m RNA的表达量明显增高(P<0.05),TUBB3的m RNA的表达量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与PC9细胞株蛋白的表达量相比较,PC9/GR细胞株ERCC1、RRM1和TS的蛋白表达量明显增高,TUBB3蛋白的表达量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:肺腺癌细胞株发生EGFR-T790M突变后对化疗药物敏感性发生变化,对顺铂、吉西他滨和培美曲塞的敏感性降低,对长春瑞滨、紫杉醇和多西他赛的敏感性增高;其化疗药物敏感性发生变化的原因可能与肺腺癌细胞株发生EGFR-T790M突变后ERCC1 m RNA、RRM1 m RNA、TS m RNA及其蛋白表达量发生变化相关。     

CEA和MUC-1mRNA在大肠癌中的表达及临床意义

[目的]探讨大肠癌患者外周血中CEA、MUC-1 m RNA的表达及临床意义。[方法]应用巢式RT-PCR技术检测20名健康人、20例大肠腺瘤疾病患者和90例大肠癌患者外周血CEA m RNA和MUC-1 m RNA的表达。[结果]大肠癌患者CEA m RNA和MUC-1 m RNA表达的阳性率分别为53.3%(48/90)和52.2%(47/90);健康人外周血中无CEA m RNA,有12名MUC-1 m RNA表达,表达率为60.0%(12/20);大肠腺瘤疾病患者无CEA m RNA表达,有10例MUC-1 m RNA表达,表达率为50.0%(10/20)。大肠癌患者中CEA、MUC-1 m RNA表达与肿瘤分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。[结论]CEA作为检测大肠癌患者外周血微转移的分子标志物具有良好的灵敏度和特异性,同时检测CEA和MUC-1可作为判断大肠癌病情进展的指标。     

RNAi抑制肾癌细胞MDR1基因表达及对顺铂化疗耐药的逆转

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)对肾癌细胞多药耐药基因1(multidrug resistance,MDR1)表达的抑制作用,并分析干扰前后肾癌细胞对顺铂(cisplatin)敏感度的变化.方法:根据MDR1基因序列设计3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染肾癌A498细胞;RT-PCR法检测转染前后MDR1 mRNA表达水平的变化,筛选出干扰效率最高的siRNA序列;进而利用慢病毒包装siRNA重组质粒,感染A498细胞,RT-PCR法筛选沉默效果最好的细胞株进行克隆;Western印迹法检测MDR1蛋白表达水平;MTT法检测干扰前后顺铂对半数细胞抑制浓度(half inhibitory concentration,IC_(50))的变化.结果:3条siRNA序列均能不同程度地抑制细胞MDR1基因的表达,其中siRNA-1序列能更有效地封闭MDR1基因,使MDR1 mRNA表达水平下降67%;筛选得到稳定转染的细胞株与未干扰细胞株相比,MDR1蛋白表达量明显下降(P<0.01),并使顺铂对细胞的IC_(50)值降低约83.37%(P<0.01).结论:RNAi能有效抑制肾癌A498细胞MDR1基因的表达,并可显著增加其对顺铂的敏感度,从而使肾癌细胞化疗耐药逆转成为可能.