PKA对跨膜型和分泌TNF—α胞毒效应的影响

目的：研究ＰＫＡ对跨膜型ＴＮＦα（ｍＴＮＦ－α）杀瘤效应的影响。方法：用ＴＮＦ生物活性检测方法在体外观察ＰＫＡ激活剂和抑制剂对一型ＴＮＦ－α杀伤不同肿瘤细胞的影响。结果：ＰＫＡ激活剂Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（１０μｍｏｌ／Ｌ）和抑制剂Ｈ８（１５μｍｏｌ／Ｌ）可分别增强和抑制ｓＴＮＦ－α对其第三靶细胞的胞毒活性,对其余４株耐受细胞却无逆转使用,而且对ｍＴＮＦ－α的胞毒效应无任何影响。此外,ＰＫＡ活性增强,     

R31L TNF-α突变体重组质粒的构建、真核表达及其产物的胞毒效应

目的：研究膜型、分泌型TNF-α的31位氨基酸在其生物学效应中的作用,进一步探讨TNF-α结构与生物学效应的关系。方法：采用重叠PCR方法将wt TNF-α31位精氨酸（R）密码子（CGC）定点突变替换成亮氨酸（L）密码子（CTC）,构建R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,采用脂质体转染法将其瞬时转染COS-7细胞进行表达,通过MTT法检测R31LTNF-α突变体的胞毒效应。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实目的基因R31LTNF-α正确连接到pcDNA3.0的多克隆位点；TNF-α31位突变可增强sTNF-α的胞毒效应,突变体的CC50值是野生型的1/10,而对mTNF-α的生物学效应无明显影响。结论：本实验成功地构建了R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,且在真核细胞COS-7中获得表达；TNF-α31位置换成亮氨酸后,主要增强其分泌型分子的胞毒效应,而对其膜分子无作用。     

两类金属蛋白酶在炎性细胞模型中的变化及中药RDQ的天然抑制效应

目的探讨金属蛋白酶(MPs)家族的MMPs和ADAMs两亚类成分在前体TNF-α(mTNF-α)向成熟型TNF-α(sTNF-α)转化过程所起的作用,MMPs在炎症过程中活性的变化和中药RDQ抗炎保护功效的分子机制,为人工干预炎症过程提供依据和手段。方法以LPS刺激HL-60细胞为天然模型,用细胞学和分子生物学技术在蛋白质和mRNA水平上研究MMPs、ADAM17、TNF-α在炎症过程中的表达和活性变化。结果①LPS刺激后,HL60细胞上清中MMPs的活性随刺激时间延长逐渐减弱,胞浆裂解物中的MMPs则随刺激时间延长活性增加但LPS刺激对MMPs mRNA的表达影响不大;②LPS刺激能使HL-60细胞中ADAM17mRNA和TNF-αmRNA表达在6h同时达高峰;③RDQ能明显降低LPS诱导的ADAM17 mR- NA的增加,并能抑制sTNF-α的分泌。结论①ADAM17对sTNF-α的产生起主导作用;②纯中药注射液热毒清(RDQ)能调节TACE的表达,最终抑制TNF-α的分泌。     

跨膜型TNF-α介导的反向信号对NK细胞杀伤功能的影响

目的：观察跨膜型TNF-α介导的反向信号对NK细胞杀伤功能的影响.方法：用sTNFRI激活NK92细胞的TM-TNF-α反向信号;MTT比色法检测NK92细胞对靶细胞的杀伤作用;β-己糖氨酶释放实验检测NK92细胞在杀伤靶细胞时的胞吐作用;ELISA实验检测NK92细胞sTNF-α的分泌;流式细胞术检测NK92细胞FasL的表达.结果：预先激活TM-TNF-α反向信号,可以促进NK92细胞对靶细胞的杀伤功能;增强NK92细胞的胞吐;促进FasL的表达和sTNF-α的分泌.结论：TM-TNF-α反向信号可能通过促进NK92细胞胞吐、sTNF-α分泌及FasL的表达而促进NK92细胞对靶细胞的杀伤.     

Wee1-GFP在CTL介导的细胞毒效应中的作用研究

目的: 研究Wee1-GFP融合蛋白对胞毒T细胞介导的胞毒效应的影响.方法: 采用脂质体将融合基因Wee1-GFP导入鼠胰岛瘤细胞(NIT-1)并检测其表达.以转染pWee1-GFP和空载体的NIT-1为靶细胞, 采用ELISA凋亡试剂盒和乳酸脱氢酶法检测胞毒T细胞介导的细胞毒效应.结果: Western blot检出Wee1-GFP融合蛋白的表达.转染Wee1-GFP的靶细胞发生凋亡及损伤的细胞数比转染空载体的靶细胞少.结论: Wee1-GFP基因转染靶细胞具有一定的抵抗CTL介导的胞毒效应的能力.     

苯的代谢产物氢醌改变细胞氧化还原状态诱导TNF-α表达

目的:研究苯的代谢产物氢醌(HQ)对HL-60细胞TNF-α产生和细胞活性的影响,并探讨这种影响是否通过氧化还原调节来实现.方法:HL-60细胞用不同浓度HQ刺激24 h后,收集细胞及培养液上清,检测细胞内活性氧、氧化型/还原型谷胱甘肽含量,CCK8检测细胞增殖,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡,ELISA法检测TNF-α含量.结果:5 μmol/L HQ即可诱导GSH水平增高,抑制HL-60细胞增殖,但对GSH/GSSG比例,TNF-α表达及细胞凋亡无显著影响.50、 100 μmol/L HQ可破坏细胞内氧化还原状态,GSH/GSSG比例下降,TNF-α表达增高,显著抑制HL-60细胞增殖,诱导细胞凋亡,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸能拮抗HQ诱导的TNF-α表达、增殖抑制及细胞凋亡.结论:HQ可通过改变HL-60细胞内氧化还原状态诱导TNF-α表达,导致细胞凋亡.     

PTK 对跨膜型与分泌型TNF-α诱导中性粒细胞功能的调节作用

目的:研究酪氨酸磷酸化激酶（PTK）对跨膜型〔TM-TNFα）与分泌型TNF-α（S-TNF-α）诱导中性粒细胞呼吸爆发和NO释放的影响。方法:用化学发光法检测呼吸爆发,用硝酸还原酶法定量检测释放的NO,在体外观察PTK抑制剂对两型TNF-α诱导中性粒细胞以上功能的影响,并用Western印迹比较两型TNF-α诱导中性粒细胞蛋白酪氨酸磷酸化的异同。结果:PTK抑制剂Genistein（50 μmol/L）不仅可明显抑制S-TNF-α诱导的中性粒细胞呼吸爆发（P<0.005）,也可明显抑制TM-TNF-α诱导的中性粒细胞产生NO（P<0.001）。Western印迹显示大约17KD处,S-TNF-α介导的酪氨酸磷酸化条带比对照略强,而TM-TNF-α介导的酪氨酸磷酸化条带则明显增强;约于31 kD处,出现由TM-TNF-α介导的酪氨酸磷酸化的特异性条带,而在其它处理组则均未发现。结论:两型TNF-α对中性粒细胞功能的影响均依赖于PFK的激活;但二者诱导酪氨酸磷酸化的程度及酪氨酸磷酸化的靶分子则存在差异。     

Zacopride增强心肌内向整流钾电流(IK1)效应的受体和信号转导通路

目的:探讨5-HT4受体激动剂兼5-HT3受体阻断剂zacopride增强心肌内向整流钾电流(IK1)效应的受体和细胞信号转导机制.方法:应用全细胞膜片钳技术记录大鼠心室肌细胞膜IK1电流,分别观察10 μmol/L 5-HT4受体阻断剂 RS23597-190、10 μmol/L 5-HT3受体激动剂间氯苯双胍(m-CPBG)、5 μmol/L PKA 抑制剂 KT5720、5 μmol/L PKC 抑制剂GF109203x 和 5 μmol/L PKG抑制剂 KT5823对zacopride 增强IK1的影响.结果:10 μmol/L 5-HT4受体阻断剂RS23597-190本身可抑制IK1电流,在预先应用RS23597-190的基础上,1 μmol/L zacopride仍可明显激动IK1通道,使其内向电流(-100 mV)增强32.5% (P< 0.05).10 μmol/L 5-HT3受体激动剂m-CPBG对IK1电流无明显影响,也不能逆转1 μmol/L zacopride对IK1的增强效应(P> 0.05).此外,5 μmol/L PKA 阻断剂 KT5720能显著抑制1 μmol/L zacopride对IK1的增强效应(P< 0.05),而PKC 阻断剂GF109203x和PKG阻断剂KT5823则对1 μmol/L zacopride的效应无明显影响(P> 0.05).结论:Zacopride对 IK1的增强作用可能经由PKA介导的信号转导通路,而不依赖于5-HT3和5-HT4受体.     

LPS对寻常型银屑病患者外周血单核细胞合成和分泌TNF-α的影响

TNF-α主要由单核/巨噬细胞合成和分泌,分为分泌型TNF-α(secretory tumor necrosis factor-α,sTNF-α)和膜相关型TNF-α,其中sTNF-α可与MC膜受体结合而成为膜结合型TNF-α.本文对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激前、后寻常型银屑病患者外周血单核细胞(Monocytes,MCs)合成和分泌各型的变化进行了检测,进一步探讨它们在寻常型银屑病发病机制中的作用.     

跨膜型和分泌型TNF—α对TNF受体作用的比较

用可溶性ＴＮＦＲ预先与ｍＴＮＦα或ｓＴＮＦα温育可明显抑制两型ＴＮＦ随后的胞毒效应；用ｓＴＮＦ封闭靶细胞的ＴＮＦＲ可抑制随后ｓＴＮＦ对之的胞毒效应，却不能影响ｍＴＮＦ的作用。提示ｍＴＮＦ与ｓＴＮＦ一样是依赖ＴＮＦＲ发挥作用的，但二者与ＴＮＦＲ结合位点不同。比较两型ＴＮＦ对表达不同类型ＴＮＦＲ靶细胞的胞毒效应，对ｓＴＮＦ敏感的靶细胞主要表达ＴＮＦＲＩ，而ｍＴＮＦ则对表达Ⅰ型和／或Ⅱ型ＴＮＦＲ的靶细胞均有杀伤作用。抗ＴＮＦＲ抗体与ｍＴＮＦ相似，可杀伤对ｓＴＮＦ耐受肿瘤细胞系；将其预先与靶细胞作用并不能封闭ｍＴＮＦ的杀瘤效应，提示二者与ＴＮＦＲ结合位点不同，但可能有相似的信号传导     

TNF-α对兔软骨终板细胞增殖、凋亡及基质形成的影响

目的：探讨TNF-α对体外培养的兔软骨终板细胞增殖、凋亡及基质形成的影响。方法:分离培养并鉴定兔软骨终板细胞后，分别加入不同浓度的TNF-α，用 MTT测定不同时点软骨终板细胞增殖活性的变化；免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Fas、caspase-3 表达的变化；RT-PCR 检测培养过程中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原 mRNA 的表达变化。结果:50 μg/L、100 μg/L浓度TNF-α可抑制细胞增殖；50 μg/L浓度TNF-α可降低 Bcl-2的表达，10 μg/L、50 μg/L浓度TNF-α均可促进Bax、Fas、caspase-3 的表达；10 μg/L、50 μg/L浓度TNF-α可降低collagen IIa mRNA 的表达，TNF-α 为50 μg/L浓度时才可降低aggrecan mRNA 的表达。结论:TNF-α可抑制软骨终板细胞的增殖及基质合成，促进软骨终板细胞促凋亡因子的生成。     

Manumycin通过诱导细胞凋亡抑制人胰腺导管癌细胞Panc-1活性

目的：观察manumycin对人胰腺导管癌细胞Panc-1的抑制效应，并探讨其诱导细胞凋亡是否经p38MAPK介导。 方法： 用MTT法检测manumycin对Panc-1细胞的抑癌作用。用caspase-3活性检测试剂盒定量检测manumycin诱导细胞凋亡的水平及评估特异性的p38MAPK抑制剂SB203580对它的影响。 结果： 经manumycin(6 μmol/L、18 μmol/L、54 μmol/L)处理Panc-1细胞24 h,对Panc-1细胞生长具有明显的抑制作用，其抑制率分别为8.9%、21.9%和67.0%，其中后二者的细胞活性与对照组相比有显著差异(P<0.01)，呈量效关系。用药24 h的IC50为34.7 μmol/L。同时，此药物可明显增加caspase-3的活性，且这一效应可部分地被p38抑制剂SB203580阻断。 结论： Manumycin可通过诱导Panc-1细胞凋亡而产生抑癌作用，p38MAPK是manumycin诱导细胞凋亡的通路之一。     

TNF—α的细胞毒效应及其信号传导

ＴＮＦ－α是一类具有多种生物学活性的细胞因子，其存在两型，即分泌型ＴＮＦ和跨膜型ＴＮＦ。ＴＮＦ－α自发现以来受到广泛重视，就其作用机制研究很多，但尚无定论。本文仅就ＴＮＦ介导的细胞毒作用的受体和胞内信号传递机制，靶细胞的死亡类型，不同靶细胞对ＴＮＦ反应差异的分子机制及两型ＴＮＦ介导的细胞毒效应差异等作一综述。     

姜黄素对放线菌素D/TNF-α诱导的PC12细胞和大鼠海马神经元损伤的影响

目的: 探讨姜黄素对放线菌素D(ActD)/TNF-α诱导的PC12细胞和大鼠海马神经元凋亡的影响及其作用机制。方法: 将PC12细胞分为以下6组:对照组、TNF-α组、ActD组、姜黄素组、ActD/TNF-α组和姜黄素+ActD/TNF-α组。各组细胞培养24 h后进行下列处理:倒置荧光显微镜普通光观察各组细胞的形态变化;Annexin V/PI染色流式细胞术检测各组PC12细胞凋亡率; Fluo-3 AM染色流式细胞术测定细胞内Ca²⁺浓度。制备离体大鼠海马脑片,分组处理同PC12细胞,细胞外微电极记录技术观察各组海马脑片CA1区长时程增强(long-term potentiation,LTP)的变化情况。结果: 10 μg/L ActD和50 μg/L TNF-α协同处理可导致PC12细胞明显损伤,而5 μmol/L姜黄素则可以减轻这种损伤作用(P<0.05);ActD/TNF-α可诱导PC12细胞内Ca²⁺浓度升高,姜黄素可以通过降低胞内Ca²⁺浓度而减少ActD/TNF-α引起的细胞凋亡(P<0.05)。此外,LTP实验也证实ActD/TNF-α可以显著抑制大鼠海马脑片LTP的诱发,而姜黄素可以拮抗这种抑制作用,改善神经元突触可塑性(P<0.05)。结论: 姜黄素可以改善ActD/TNF-α引起的神经元损伤,其机制可能是通过降低细胞内Ca²⁺浓度,维持胞内钙稳态而发挥作用。     

跨膜型肿瘤坏死因子-α胞内段基序稳定表达细胞株的建立及功能研究

目的 建立高表达跨膜型肿瘤坏死因子-α胞内段(TNF-intracellular domain,TNF-ICD)基序的人乳腺癌MCF-7细胞株,为研究TM-TNF-α的反向信号提供工具.方法 采用脂质体介入法将含人TNF-ICD的pIRES2-EGFP病毒载体导入MCF-7中,经鉴定、筛选获得能稳定表达TNF-ICD细胞株.采用MTT法检测转染细胞对TNF-α的敏感度,比色法检测NO含量,ELISA方法 检测NF-κB的活性.结果 TNF-ICD基因转染入MCF-7细胞后表达在细胞膜上,并能提高该细胞NF-κB活性,抵抗TNF-α的杀伤,增加其NO产生;应用NF-κB抑制剂PDTC处理后能恢复该细胞对TNF的敏感性.结论 获得稳定表达TNF-ICD的MCF-7细胞株,TNF-ICD可能作为TM-TNF-α细胞内的一段活化基序参与TM-TNF-α的反向信号,并通过活化NF-κB,抵抗可溶性TNF-α介导的细胞毒作用,增加NO的产生.     

重组TACE前肽对自身TACE活性的抑制作用

目的 以脂多糖(LPS)刺激人单核细胞型淋巴瘤细胞株THP-1为模型,观察重组肿瘤坏死因子α转换酶(TACE)前肽结构域对催化TACE结构域的自身抑制作用,为人工干预炎症过程提供依据和手段.方法 首先利用DNA重组技术分别构造含前肽结构域和催化结构域的重组载体:用PCR方法 扩增出TACE的胞外结构域(T1300)和前肽结构域(T591),并克隆至载体pET-28a(+)中,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的 蛋白,两者均为包涵体,变性复活后经Ni2+-NTA亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化.对纯化后的蛋白进行Western blot分析.LPS分时相刺激THP-1细胞后,用细胞学技术观察纯化的T591在蛋白质水平上对TACE的表达和活性的影响.结果 TACE重组前肽蛋白能显著抑制TACE的活性,减少分泌型TNF-α(sTNF-α)分泌,抑制率达57%.结论 TACE重组前肽抑制了TACE的活性,降低了sTNF-α的分泌,为抗炎药物的设计和改造提供了新的依据和方法 .     

TM-TNF-α介导的反向信号协同增强sTNF-α对U937细胞的激活作用

目的用sTNFRⅠ预先激活TM-TNF-α介导的反向信号，观测其对sTNF-α激活单核细胞系U937细胞的影响。方法预先用sTNFRⅠ与U937细胞作用30min，洗涤后加入sTNF-α作用不同时间，观测预激活反向信号对sTNF-α刺激U937产生活性氧、胞内促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8 mRNA的转录及IkB-α水平(Western blot)的影响。结果单独用sTNFRⅠ激活的反向信号并不影响U937细胞的功能，而预激活反向信号能协同增强sTNF-α刺激U937细胞产生活性氧，且呈sTNFRⅠ浓度、sTNF-α浓度依赖关系；预激活反向信号协同增强sTNF-α刺激U937炎性细胞因子mRNA(TNF-α、IL-1β、IL-8等)的转录水平；并促进U937细胞IkB-α的降解。结论预先激活TM-TNF-α介导的反向信号协同增强sTNF-α对U937的激活作用，提示反向信号可能参与机体对早期炎症反应的调节。     

沉默Bax基因对TNF-α诱导人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响

目的:运用RNA干扰(RNAi)技术沉默人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549的B细胞淋巴瘤-2相关基因(Bax),探讨Bax在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导A549细胞凋亡中的作用。方法:体外培养A549细胞,利用脂质体LipofectamineTM2000将化学合成的Bax小干扰RNA(siRNA)转染入A549细胞,给予10μg/LTNF-α刺激24h,RT-PCR检测bax mRNA的表达,Western blotting和免疫组化检测Bax蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化。结果:化学合成的Bax siRNA抑制了A549细胞Bax mRNA和蛋白的表达(P0.05),流式细胞术显示BaxsiRNA组的细胞凋亡率明显低于TNF-α组和阴性对照siRNA组(P0.05)。结论:体外实验证明Bax的高表达在TNF-α诱导A549细胞凋亡中发挥了重要的促凋亡作用,利用RNAi技术沉默Bax基因可以有效抑制由TNF-α介导的A549细胞凋亡。     

肿瘤坏死因子α致HUVECs内皮型一氧化氮合酶降解

目的研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是否可以通过细胞内蛋白质降解途径引起人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的蛋白量减少。方法建立原代HUVECs培养,选取TNF-α不同浓度(0.01、0.1、1和10 ng/m L)、不同时间(24、48和72 h)处理HUVECs;溶酶体抑制剂氯化铵(NH4Cl)、caspase抑制剂(caspase inhibitor)和泛素-蛋白酶体抑制剂(MG-132)预处理HUVECs 1.5 h后加入TNF-α(1 ng/m L)共处理24 h,Western blot方法检测HUVECs中eNOS蛋白表达。结果与对照组比较,1 ng/m L TNF-α处理细胞24 h,eNOS蛋白量明显减少(P0.01);MG-132与TNF-α共处理组,eNOS蛋白量明显增加(P0.01)。结论 TNF-α可以通过泛素-蛋白酶体途径引起eNOS蛋白降解。     

TNF-α对共育体系中成骨细胞凋亡的影响及益骨胶囊含药血清的保护作用

目的： 探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对成骨-破骨细胞共育体系中成骨细胞（OB）凋亡的影响及益骨胶囊含药血清的保护作用。方法: （1）将20只10月龄SD大鼠随机分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水灌胃组，制备含药血清与空白血清；（2）将分离的OB与破骨细胞（OC）分别接种到共育体系中，加培养液培养后， 同时添入20 μg/L、30 μg/L、40 μg/L、50 μg/L、60 μg/L TNF-α分别作用24 h、48 h、72 h诱导OB 凋亡，用DNA电泳法确定最佳诱导方案；(3）将细胞分为TNF-α组、TNF-α+含药血清组、TNF-α+空白血清组和正常对照组，分别加入DMEM培养液、含药血清培养液、空白血清培养液、DMEM培养液，除正常对照组加入PBS外，其它各组均同时加入60 μg/L TNF-α，培养72 h后，用荧光染色法、DNA电泳法、流式细胞仪观察各组OB凋亡情况。结果: (1）60 μg/L TNF-α作用72 h后，共育体系中OB DNA电泳呈较典型的梯形改变；(2）TNF-α+含药血清组中OB DNA电泳仅出现二个条带，荧光染色可见大多数细胞均匀染色，其凋亡率（9.60%±0.26%）明显低于TNF-α组(26.90%±0.06%)与TNF-α+空白血清组(18.10%±0.06%)，P＜0.01。结论: 60 μg/L TNF-α作用72h可诱导共育体系中OB凋亡；益骨胶囊含药血清对TNF-α诱导的OB凋亡具有抑制作用。