胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离及原代培养

目的:探讨胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial cell type Ⅱ,AECⅡ)的分离、纯化及原代培养方法,为有关胎儿肺发育及新生儿肺部疾病的研究奠定基础.方法:采用胰酶结合胶原酶的消化方法,分离肺组织细胞成份,然后经差速离心和差速贴壁的方法纯化AEC Ⅱ,进行原代培养;通过台盼蓝染色检测细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞生长特点及形态特征,透射电镜鉴定,改良巴氏染色检测细胞纯度以及免疫荧光技术检测表面蛋白C(Surfactant protein c,SPC)的表达.结果:每3～5只胎鼠可获得AEC Ⅱ(36 ± 5)× 106,活力98%±2%.镜下观察原代AECⅡ呈岛状生长,外观呈多边形或立方形.透射电镜可见特征性的板层小体,改良巴氏染色见胞质内有较多颗粒,纯度为96%±3%,呈现SPC绿色免疫荧光的细胞占96%以上.结论:利用胰酶和胶原酶消化,以及差速离心和差速贴壁的方法可成功分离出高产量、高纯度的胎鼠AEC Ⅱ,能满足体外进一步实验的需要.     

肝细胞生长因子对转化生长因子诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化的影响

目的:研究肝细胞生长因子(HGF)对转化生长因子β1(TGFβ-1)诱导肺泡上皮细胞转分化的影响。方法:应用TGF-β1诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化。将人肺腺癌A549细胞株培养液分为4组:①对照组;②HGF组;③TGFβ-1组;④HGF+TGFβ-1组,应用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;免疫细胞化学方法检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肺泡上皮细胞特异性标志物肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的表达。结果:①TGF-β1组肺泡上皮细胞从原来典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞样形态。②TGF-β1组的细胞α-SMA的表达明显增加,SP-A的表达明显减低。③HGF组的细胞形态学、α-SMA、SP-A的表达与对照组无明显差异。④HGF+TGFβ-1组,多数细胞保持原来肺泡上皮细胞的形态,α-SMA表达明显低于TGFβ-1组、SP-A表达明显高于TGFβ-1组。结论:HGF能够在一定程度上负性调控TGFβ-1诱导的肺泡上皮细胞的转分化。     

胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞生长状况及ABCA3表达变化的初步研究

目的:观察原代培养胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell,AECⅡ) 的生长状况及AECⅡ特异性蛋白ATP结合盒转运蛋白A3(ATP binding cassette transporter A3,ABCA3)的表达变化,为有关新生儿肺发育及肺部疾病的研究奠定一定基础?方法:采用胰酶联合胶原酶消化肺组织,差速离心及差速贴壁法纯化细胞;电子显微镜鉴定AECⅡ细胞;倒置相差显微镜观察不同时间点细胞生长状态;MTT法绘制细胞生长曲线;免疫荧光技术观察 ABCA3动态表达变化?结果:电镜下观察到AECⅡ特征性板层小体,大小及数量不等,胞膜外缘分布有刺状微绒毛;MTT法测得铺板后第24?36?48?72?96?120 h的吸光度值分别为0.177 ± 0.009,0.193 ± 0.011,0.212 ± 0.019,0.253 ± 0.019,0.243 ± 0.012,0.192 ± 0.011?光学显微镜下细胞形态逐渐拉长,变扁平,细胞内颗粒逐渐减少?免疫荧光示ABCA3表达逐渐下降?结论:原代培养的胎鼠AECⅡ在培养早期生长状况最佳,ABCA3表达最丰富,故在早期(即培养72 h以内)进行肺发育疾病相关机制的研究较为理想?     

不同体积分数氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞体外生长状态的影响

目的:探讨不同氧体积分数状态下,胎鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar typeⅡepithelial cell,AECⅡ)体外生长状态的变化.方法:原代培养胎鼠AECⅡ并用电镜鉴定;建立氧体积分数0.95组(95%O2)、氧体积分数0.4组(40%O2)和空气组(21%O2)3种氧化损伤性细胞模型,各自暴露12、...     

胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、原代培养与鉴定

 【目的】探讨胎鼠肺泡Ⅱ型细胞原代培养及鉴定方法，建立肺泡Ⅱ型细胞培养模型，为体外研究肺泡Ⅱ型细胞及胎儿肺发育提供实验手段。【方法】采用低浓度胰酶消化20d胎鼠肺组织，经差速离心和特异性免疫吸附后，分离、纯化胎鼠肺泡Ⅱ型细胞，进行原代培养；根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和肺表面活性特异蛋白A的分泌，用免疫细胞化学染色、透射电镜及酶联免疫吸附法对分离的细胞进行形态学和功能鉴定。【结果】原代培养的肺Ⅱ型细胞12h开始贴壁，外观呈多边形，岛状生长。培养的24～48h，细胞连接成单层，胞浆内颗粒明显，培养的6～7d细胞内颗粒大量减少；免疫细胞化学鉴定细胞肺表面活性特异蛋白A（surfactant pmtein A，SP-A）染色阳性，透射电镜可见观察到细胞内板层小体，培养液中SP-A含量随培养时间延长逐渐增多，于培养36h达峰值，为80ng／mL；细胞纯度达（92±2）％，产量为（18．6±7）×10^6。【结论】差速离心和免疫黏附法是一种高效的分离和纯化胎肺Ⅱ型细胞的方法，所得细胞产量大、纯度高，可以用于体外研究肺泡Ⅱ型细胞和晚期胎肺发育的研究.     

妊娠期糖尿病对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响

目的 明确孕鼠妊娠期糖尿病(GDM)对胎鼠原代培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)形态、功能的影响及意义.方法 SD孕鼠分为对照组和GDM组,GDM组孕鼠建立GDM模型.分离、纯化两组胎鼠的AECⅡ细胞.台盼蓝染色判断胎鼠AECⅡ活力;透射电镜观察胎鼠AECⅡ超微结构改变.苏木素-伊红(HE)染色胎肺组织计算AECⅡ和AECⅠ数量及比例;油红O染色检测胎鼠AECⅡ脂质的变化;免疫荧光检测胎鼠AECⅡ中肺泡表面活性物质相关蛋白C(SP-C,AECⅡ标记物)的表达变化;免疫细胞化学检查胎鼠AECⅡ肺泡表面活性物质相关蛋白A(SP-A)的表达变化.结果 原代培养可得到高产量、高纯度的AECⅡ.透射电镜下可见GDM组胎鼠AECⅡ中板层小体数较对照组胎鼠明显减少,细胞表面的微绒毛明显减少.GDM组胎鼠AECⅡ和AECⅠ细胞数量较对照组胎鼠均降低.GDM组胎鼠AECⅡ中脂滴数较对照组胎鼠明显减少.GDM组胎鼠原代培养的AECⅡ中SP-A表达低于对照组胎鼠(P＜0.001).结论 GDM时,AECⅡ细胞形态的改变,功能的抑制是新生儿容易出现呼吸窘迫综合征的重要原因.     

内毒素对鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞钠泵的影响及机制

目的观察内毒素对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)钠泵的影响。方法 ATⅡ细胞成功分离纯化后随机分为两组:①对照组(PBS);②LPS组(1μg/mL)药物干预4 h后用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测ATⅡ细胞上钠泵α1、β1亚基mRNA的表达;免疫组化法检测钠泵α1、β1亚基蛋白的表达;用高效液相法测定细胞ATP、ADP、AMP和腺嘌呤核苷酸总量(TAN),间接测得钠泵的活性。结果 RT-PCR结果显示:LPS组α1、β1亚基的mRNA表达较对照组明显降低(P<0.05);酶活性检测结果显示:LPS组钠泵活性较对照组明显增高(P<0.05);免疫组化结果显示:ATⅡ细胞上钠泵α1、β1亚基蛋白均有表达,各组亚基蛋白的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论内毒素能下调ATⅡ细胞钠泵α1、β1亚基的mRNA表达,应激调节钠泵活性,但对蛋白表达无明显影响,提示钠泵的变化可能与内毒素性肺损伤有关。     

肝细胞生长因子对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖与凋亡的影响

目的:观察肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对高氧暴露体外培养的早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Type Ⅱ alveolar epithelial cells,AEC Ⅱ)增殖、凋亡及功能的影响,探讨HGF对高氧肺损伤保护作用的机制.方法:原代培养早产鼠AEC Ⅱ,纯化后随机分为4组:空气组(Air)、高氧组(HO)、空气 HGF组(Air HGF)、高氧 HGF组(HO HGF).采用流式细胞术及免疫印迹(Western blot)法观察AEC Ⅱ的增殖和凋亡情况,RT-PCR分析各组肺泡表面活性物质蛋白(surfactant associated protein,SP)SPA,SPB,SPC mRNA表达.结果:(1)各组细胞周期比例及细胞凋亡显示,与Air组比,HO组Sub G1(代表凋亡细胞比例),G0期/G1期细胞比例明显增高(P＜0.01),G2期/M期细胞比例明显降低(P＜0.01);Air HGF组S期细胞比例明显增高(P＜0.01).与HO组比,HO HGF组G0期/G1期细胞比例显著降低(P＜0.01),S期和G2期/M期细胞比例明显增高(P＜0.01).(2)各组增殖细胞核抗原表达显示,HO组显著低于Air组(P＜0.01),Air HGF组明显高于Air组(P＜0.05);HO HGF明显高于HO组(P＜0.05).(3)各组SPA,SPB,SPC mRNA表达显示,HO组强度较Air组弱(P＜0.01),而HO HGF组较HO组明显增加(P＜0.05).结论:高氧导致早产鼠AEC Ⅱ增殖抑制,凋亡增加,SPA,SPB,SPC mRNA表达降低,HGF可部分抑制这种变化,提示HGF对高氧肺损伤起一定的保护作用.     

高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞NADH脱氢酶亚单位4、5表达的影响

目的 探讨高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC Ⅱ）还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶亚单位4、5表达的影响.方法 原代培养Sprague-Dawley（SD）胎鼠AEC Ⅱ,待其生长至接近汇合状态时随机分为高氧组和正常对照组,高氧组持续暴露于常压高浓度氧中（氧浓度〉90%.CO2浓度5%）,正常对照组仍置于5%CO2培养箱中,两组均继续分别培养6、12、24h;采用免疫细胞化学染色SP法检测NADH脱氢酶亚单位4（DN4）蛋白的表达.采取半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定ND4、NADH脱氢酶亚单位5（ND5）mRNA的表达.结果 （1）SP法结果显示,与正常对照组比较,高氧组6h AEC Ⅱ ND4蛋白的表达增强,12h AEC Ⅱ ND4蛋白的表达减弱,但差异均无统计学意义（均P〉0.05）,24hAEC Ⅱ ND4蛋白的表达显著减弱（P〈0.05）;（2）RT-PCR检测结果显示,与正常对照组比较,高氧组6h AEC Ⅱ ND4、ND5 mRNA表达增强,差异均无统计学意义（均P〉0.05）.12、24h AECⅡ ND4、ND5 mRNA表达显著减弱（P〈0.05）.结论 持续高氧下调胎鼠AEC Ⅱ ND4、ND5 mRNA和AEC Ⅱ ND4蛋白的表达,这种改变可能参与高氧肺损伤的发病过程.     

表皮生长因子对体外胃粘膜上皮细胞生长的影响

取胃体大弯的胃粘膜上皮细胞在RPMI164培养液中,加成年雄性猪颌下腺提取液(PEGF)及成年雄性小鼠颌下腺提取液(M60EGF),用I~(125)UdR掺入方法测定细胞DNA合成。结果:盐水对照组为4168±171.5cpm,PEGF组为21.980±997.8cpm(P<0.0001),M60 EGF组为6132±262.7cpm(P<0.01)。鼠EGF加热80℃对胃粘膜DNA合成无效应,提示鼠EGF不耐热。实验结果表明:ECF是胃十二指肠粘膜的营养因子,对胃粘膜上皮细胞的生长有促进作用。     

液体通气对胎粪吸入综合征大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响

目的:观察液体通气对胎粪吸入综合征(MAS)大鼠肺的影响。方法:建立大鼠MAS模型,分离并培养肺泡Ⅱ型上皮细胞,通过对比实验组与对照组不同时间段的电镜和细胞凋亡率的变化,探讨液体通气在MAS中的应用。结果:电镜显示,实验组的形态学损伤轻于对照组,且细胞凋亡率低于对照组,两者存在统计学差异(P<0.05)。结论:液体通气可抑制MAS中大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡,减少肺组织损伤。     

鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、鉴定和培养

目的：探讨肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离，鉴定和培养。方法：采用改良法（酶消化与碳铁颗粒相结合）、分离、鉴定和培养了肺泡Ⅱ型上皮细胞。结果：使用上述方法分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞，经流式细胞仪、鞣酸染色和电子显微镜鉴定，其纯度达７０％以上。结论：经改良法分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞，可满足一般试验需求。     

吸入石英粉尘对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响

对大鼠吸入石英粉尘后肺泡Ⅱ型上皮细胞（Ｔ＿Ⅱ）的变化进行了形态学观察和定量分析。９个月的实验结果表明，石英粉尘导致Ｔ＿Ⅱ增生，且呈双相反应，染尘结束后０～４周、和９个月为两个增生高峰期。Ｔ＿Ⅱ胞浆内板层体（ＬＢ）数量增多，肺泡腔内含大士游离ＬＢ，管样髓磷脂。提示增生Ｔ＿Ⅱ合成和分泌表面活性物质的功能增强。     

人表皮生长因子对兔用角膜上皮细胞生长的影响

人表皮生长因子是细胞生长因子之一。应用本室自制的人表皮生长因子加入培养的兔角膜上皮细胞中，观察对角膜上皮细胞生长的影响，结果表明：加入人表皮生长因子的实验组比未加人表皮生长因子的对照组的上皮细胞数目明显增加。本文提出了快速、简单，大量培养上皮细胞的新方法。     

神经酰胺对胎鼠肺泡域型上皮细胞增殖的影响

取1只妊娠17.5 d的ICR小鼠,将其体内的胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞( AECⅡ)经分离、纯化、培养、鉴定后,分别加入不同浓度的神经酰胺,培养12、24和48 h后进行MTT试验。在Transwell上构建AECⅡ单层,以10μmol/L的神经酰胺与AECⅡ培养12和24 h,并设置相应对照组,应用伏欧计测定跨上皮电阻值。结果显示,随着神经酰胺染毒浓度的升高和染毒时间的延长, AECⅡ细胞增殖抑制率呈上升趋势。10μmol/L的神经酰胺分别刺激融合的AECⅡ单层12和24 h后,与未处理对照组比较,神经酰胺刺激组的跨上皮电阻值显著下降。     

肝细胞生长因子在内毒素诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中的作用

目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)对经内毒素(LPS)诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)磷脂分泌功能及细胞增殖和凋亡的影响.方法 建立体外培养的AT-Ⅱ细胞内毒素损伤模型,加入不同剂量的HGF,采用流式细胞仪(FCM)检测AT-Ⅱ细胞凋亡率,MTT法绘制细胞生长曲线,化学测定法测定培养介质中总磷脂含量.结果 内毒素可导致AT-Ⅱ细胞损伤,表现为细胞凋亡发生率增高;HGF能促进AT-Ⅱ细胞增殖并降低其凋亡率,在5～20ng/ml范围内其抗凋亡作用呈剂量依赖性增强,在10～20ng/ml时,肺泡Ⅱ型上皮细胞有最佳增殖速率,但对培养介质中磷脂含量无明显影响(P＞0.05).结论 肝细胞生长因子对内毒素诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤具有保护作用,但对其分泌磷脂没有促进作用.     

Ru486对胎鼠肺Ⅱ型上皮细胞的影响

为研究糖皮质激素的可能作用位点，以分离培养的肺Ⅱ型上皮细胞为主要材料，通过板层小体染色的方法，观察Ｒｕ４８６对该细胞的影响，结果显示，无血清培液中Ｒｕ４８６１０＾－４ｍｏｌ／Ｌ至培养第１ｄ或１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ培养至第３ｄ时均使Ⅱ型细胞出现坏现象，但加入地塞米松（ＤＥＸ）１０＾－６ｍｏｌ／Ｌ４ｈ后再用Ｒｕ４８６则坏死现象消失，由此从形态学角度证实了肺Ⅱ型上皮细胞具有糖皮质激素受体，Ｒｕ４８６是通过     

砷暴露及雌激素受体拮抗剂对雌、雄胎鼠AECⅡ内ERβ表达的影响

目的 观察砷暴露及雌激素受体拮抗剂（ICI182,780）对雌、雄胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）内雌激素受体β（ERβ）表达的影响。方法 孕19~20 d ICR小鼠剖腹取胎鼠,分离、纯化雌性组和雄性组胎鼠AECⅡ。四甲基亚唑蓝（MTT）法确定亚砷酸钠(NaAsO₂）染毒AECⅡ细胞的剂量。将AECⅡ细胞分为以不同剂量（低、中、高）NaAsO₂染毒的砷暴露组,培养24 h;另取AECⅡ细胞为联合暴露组,分别加入二甲基亚砜（DMSO）（溶剂对照组）、NaAsO₂ 5 μmol/L（单独砷染毒组）、NaAsO₂（5 μmol/L）+ICI182,780（1×10-4 mol/L）（砷+拮抗剂组）,培养24 h;均设空白对照组（不加任何试剂）。24 h后,砷暴露组行流式细胞术测凋亡率,砷暴露组、联合暴露组行实时荧光定量PCR法和Western blot检测胎鼠AECⅡ内ERβ mRNA和蛋白的表达水平。结果 AECⅡ纯度达（87.0±2.5）%。MTT法将0.5（低）、1.25（中）、5（高） μmol/L的浓度设置为染毒剂量。砷暴露组中:雌、雄中、高剂量组细胞凋亡率均高于空白对照组（P<0.05）,而雌、雄各剂量组间比较差异无统计学意义。雌性中、高剂量组ERβ mRNA和蛋白表达水平高于空白对照组（P<0.05）和同剂量组雄性（P<0.05）;雄性各剂量组ERβ mRNA和蛋白表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义。联合暴露组中:雌性单独砷染毒组ERβ mRNA和蛋白表达水平高于砷+拮抗剂组（P<0.01）及同剂量组雄性（P<0.05）,且高于空白对照组和溶剂对照组（P<0.05）,雄性各组间比较差异无统计学意义;雌、雄其余各组间比较差异无统计学意义。结论 砷暴露可使雌性胎鼠AECⅡ内ERβ表达上调且高于雄性,此过程可被雌激素受体拮抗剂阻断。     

体外循环血清对培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的研究

目的 探讨体外循环（ＣＰＢ）血清对肺泡Ⅱ型上皮细胞（简称ＡＴ－Ⅱ）的损伤作用。方法 原代培养大鼠ＡＴ－Ⅱ,并与ＣＰＢ血清共同孵育后观察其形态及生化指标变化和还原型谷胱甘肽（Ｒ－ＧＳＨ）的保护作用。结果 培养液中ＭＤＡ、ＬＤＨ、ＡＫＰ增加,细胞凋亡率上升,Ｒ－ＧＳＨ能减轻细胞损伤。结论 ＣＰＢ血清能直接损伤ＡＴ－Ⅱ,氧自由基可能是主要原因,这可能是术中肺表面活性物质减少的重要原因。Ｒ－ＧＳＨ在体外能