二烯丙基二硫对HL-60细胞的生长抑制和诱导分化作用

目前,研究诱导白血病细胞终末分化的药物很多,但真正能够应用于临床并产生良好疗效的只有维生素A酸类。然而,维生素A酸类也有其局限性和维甲酸综合征等不良反应,因此,寻找新的分化诱导剂仍有十分重要的意义。近年来,大蒜及其烯丙基硫化物抗肿瘤活性的研究是抗癌药物研究的一个新领域。为探讨二烯丙基二硫(DADS)抗肿瘤作用及其机制,我们观察了DADS对人急性髓系白血病HL 6 0细胞的抑制及诱导分化的影响。材料和方法1　材料和主要试剂　HL 6 0细胞引自湖南医科大学肿瘤研究所,培养于含1 0 %的热灭活小牛血清(杭州四季青公司)、1 0 0U/ml…     

二烯丙基二硫对HL-60细胞血管内皮生长因子表达及分泌的影响

目的探讨二烯丙基二硫(DADS)对白血病细胞株 HL-60的生长抑制作用和对 HL-60细胞血管内皮生长因子(VFGF)mRNA 的表达及 VEGF 蛋白分泌的影响。方法采用 MTT 法观察DADS 对体外培养的 HL-60细胞的生长抑制;应用 ELISA 法检测药物作用前后 HL-60细胞培养上清液中 VEGF 蛋白的含量;半定量 RT-PCR 法检测药物作用前后 HL-60细胞 VEGF mRNA 表达水平。结果DADS 对 HL-60细胞具有明显的生长抑制效应,0.625,1.250和2.500μg/ml DADS 作用 HL-60细胞24 h 的细胞生长抑制率分别为(8.19±3.34)%,(16.79±2.07)%,(21.30±2.72)%;作用48 h 的细胞生长抑制率分别为(11.93±3.93)%.(22.81±2.31)%,(30.74±2.03)%;作用72 h 的细胞生长抑制率分别为(16.68±2.37)%,(28.54±3.26)%,(36.59±2.37)%,其对 HL-60细胞的生长抑制率与药物浓度有明显依赖关系(r>0.9,P<0.01),各实验组随作用时间增加抑制率明显增加(r>0.7,P<0.01);0.625,1.250,2.500 μg/ml DADS 作用 HL-60细胞48 h 和72 h 与空白对照相比均能下调HL-60细胞 VEGF mRNA 的表达及 VEGF 蛋白的分泌(P<0.01),三个不同浓度 DADS 组间差异均有统计学意义(P<0.01),其下调 HL-60细胞 VEGF mRNA 的表达及 VEGF 蛋白的分泌效果与药物浓度呈相关性(r>0.9,P<0.01)。结论 DADS 能明显抑制 HL-60细胞的增殖;DADS 可能通过抑制 HL-60细胞 VEGF mRNA 的表达及 VEGF 蛋白分泌发挥抗白血病的效应。     

p38对放线菌酮经线粒体途径诱导HL-60细胞死亡的影响

目的研究 p38对放线菌酮(CHX)经线粒体途径诱导 HL-60细胞死亡的影响。方法利用 p38持异性阻断剂 SB203580(SB)阻断 HL-60细胞 p38途径,分别设对照组、单纯 SB 组、CHX组和 CHX 联合 SB 组;于处理6,9,12,18,24 h 利用碘化丙锭(PI)染色流式细胞术检测亚二倍体峰细胞比率;于处理6和18 h 进行膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)/PI 双标流式细胞术测定凋亡和坏死细胞比率;于处理18 h 利用 JC-1染色流式细胞术分析,通过对 FL2的划分比较不同处理时间高 JC-1集合体量细胞比率;测定细胞 JC-1集合体(FL2)和 JC-1单体(FL1)平均荧光强度,并计算线粒体膜电势(△Ψ_m,FL2/FL1)。结果在 CHX 处理6 h HL-60细胞亚二倍体峰细胞比率显著高于对照组,在此过程中阻断 p38途径则在处理9 h 开始亚二倍体峰细胞比率显著高于 CHX 组。处理18 h 凋亡细胞比率:CHX组[(27.9±0.52)%]和 CHX 联合 SB 组[(28.54±1.38)%]均显著高于对照组[(2.45±0.65)%](P<0.01);CHX 联合 SB 组与 CHX 组比较差异无统计学意义(P>0.05)。处理18 h 坏死细胞比率:CHX 组和 CHX 联合 SB 组均显著高于对照组(P<0.01);CHX 联合 SB 组显著高于 CHX 组(P<0.01)。此外,CHX 组和 CHX 联合 SB 组高 JC-1集合体细胞比率均显著低于对照组(P<0.01),CHX联合 SB 组高 JC-1集合体细胞比率显著低于 CHX 组(P<0.01)。处理18 h 时各实验组△Ψ_m CHX 组(0.17+0.01)和 CHX 联合 SB 组(0.05±0.003)均显著低于对照组(0.38±0.02)(P<0.01),CHX 联合 SB 组△Ψ_m 显著低于 CHX 组(P<0.01)。结论 CHX 可诱导 HL-60细胞凋亡和线粒体去极化,在该过程中阻断 p38途径可使线粒体的去极化作用增强,本模型中 p38途径可能与 HL-60细胞的坏死密切相关。     

六亚甲基二乙酰胺诱导HL-60细胞分化及其分子机制的研究

本研究探讨六亚甲基二乙酰胺（HMBA）对髓系白血病HL-60细胞分化的作用及其分子机制。应用MTT比色法观察不同浓度HMBA在不同时间点对细胞增殖的抑制作用，采用Wright—Giemsa染色观察细胞形态学变化，运用流式细胞仪测定细胞分化抗原CD11b的表达，并进行细胞周期分析，半定量RT—PCR分析c-myc、mad1、p21、p27、hTERT、HDAC1基因mRNA的表达。结果表明：HL-60细胞经不同浓度（0．5、1、2mmol/L）HMBA处理后细胞增殖受到较明显的抑制，并随时间延长、剂量增大抑制作用明显增强。HL-60细胞经2mmol／L HMBA处理后，细胞形态学上趋于分化成熟，细胞停滞于G0／G1期；CD11b表达显著增高；c-myc、hTERT mRNA表达显著下调，mad1、p21、p27mRNA表达显著上调，而HDAC1 mRNA表达无明显变化。结论：HMBA能诱导HL-60细胞分化，其分子机制可能是通过调节c-myc／mad1开关引起p21、p27上调，并且下调hTERT mRNA表达，与HDAC1活性抑制无关。     

黄芩苷诱导HL-60细胞凋亡的分子机制研究

本研究旨在探讨黄芩苷对急性髓系白血病HL-60细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制。CCK-8法检测黄芩苷对HL-60细胞增殖抑制情况;普通光学显微镜和Hoechst 33342染色后荧光显微镜下观察细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR方法检测凋亡相关基因caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax mRNA表达;Westernblot检测Bcl-2、Bax、caspase-8及caspase-3剪切片段的蛋白表达。结果表明,黄芩苷对HL-60细胞具有明显的增殖抑制作用,呈浓度和时间依赖性;在光学显微镜和荧光显微镜下细胞均呈凋亡的形态学改变;AnnexinⅤ/PI法检测到细胞早期凋亡;caspase-3、caspase-9、Bax基因mRNA表达水平呈上升趋势,Bcl-2 mRNA表达水平呈下降趋势,Bax、caspase-8及capsase-3剪切片段蛋白表达上调,同时Bcl-2蛋白表达下调,Bcl-2/Bax比值降低。结论:黄芩苷显著抑制HL-60细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与降低Bcl-2/Bax比值,激活线粒体凋亡途径及死亡受体途径有关。     

二烯丙基二硫化物对HL-60白血病细胞株VEGF表达及分泌的影响

为了研究二烯丙基二硫化物（diallyl disulfide，DADS）对白血病HL-60细胞株VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白分泌的作用，并从影响VEGF生成的角度探讨DADS的抗白血病机制，应用ELISA法检测药物作用前后白血病HL-60细胞培养上清液中VEGF蛋白的含量；RT-PCR法检测药物作用前后白血病HL-60细胞VEGF mRNA的相对含量。结果表明：HL-60细胞中均有VEGF mRNA的表达和VEGF蛋白的分泌；与空白对照相比，DADS3个浓度组（0，625，1，25，2，5μg／ml）作用HL-60细胞48小时和72小时均能下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌（P〈0.01）。3个浓度组间差异显著（P〈0．01），其下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌效果与浓度相关（r〉0.9，P〈0．01）。结论：DADS可能通过抑制VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌发挥抗白血病效应。     

二烯丙基二硫对人结肠癌HT-29细胞的生长抑制和细胞周期阻滞作用

二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)是大蒜中一种有效的脂溶性成分,对多种肿瘤细胞有直接抑制作用[1]。我们以人结肠癌HT-29细胞为研究对象来观察不同浓度的DADS对癌细胞生长抑制和细胞周期的调控作用,现报道如下。     

细胞周期素G1反义硫代脱氧寡核苷酸抑制HL-60细胞在裸鼠体内生长的实验研究

目的：探讨细胞周期素G1(cyclin G1)反义硫代脱氧寡核苷酸对HL-60细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。方法：将裸鼠随机分成对照组、正义寡核苷酸(SON)组、反义寡核苷酸(ASON)组，其中SON组和ASON组接种转染的HL-60细胞(HL-60／S和HL-60／AS)前接受3Gy的^60Co照射；将各组HL-60细胞接种于裸鼠皮下连续观察裸鼠的出瘤时间、瘤体大小，计算抑瘤率；病理切片用苏木精．伊红染色，电镜观察移植瘤组织的结构和细胞形态变化；用流式细胞仪(FCM)和RT-PCR分别检测cyclin G1蛋白和mRNA水平的表达；电镜和FCM检测细胞凋亡。结果:①cyclin G1 ASON组与SON组和对照组比较，对HL-60细胞在裸鼠体内生长有明显抑制作用，抑瘤率为69．4％。成瘤率、瘤重、瘤体积明显小于SON组和对照组。②镜下见cyclin G1 ASON组的HL-60细胞部分细胞形态发生改变，核分裂象少见，细胞的异型性较小，并且有凋亡细胞出现。结论:cychn G1 ASON能明显抑制HL-60细胞在裸鼠体内的生长，并且促使部分细胞发生凋亡。     

阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡及其机制研究

为了研究阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡及其机制，采用Giemsa染色、光学显微镜下观察HL60细胞的形态学变化，琼脂糖凝胶电泳检测DNA凋亡带，细胞免疫组织化学方法检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax的蛋白表达。结果显示：实验组自培养8小时起，细胞开始变形，Giemsa染色可见核膜裂解，染色质呈紫红色或蓝紫色，出现典型的凋亡小体；DNA凝胶电泳见典型的梯形条带；在细胞凋亡的同时伴有Bcl-2蛋白表达明显下降，而Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2／Bax比值下降。结论：阿糖胞苷可明显地诱导HL60细胞凋亡，同时伴有Bcl乏蛋白表达降低、Bax蛋白升高。Bcl-2／Bax比值下降可能是阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡的主要机制之一。     

七叶皂苷诱导HL-60细胞凋亡的研究

本研究观察七叶皂苷对髓系白血病HL-60细胞的抑制和诱导凋亡作用。取对数期生长的HL-60细胞经饥饿处理后，加入不同浓度的七叶皂苷观察七叶皂苷抑制细胞生长的指数、形态学变化，用DNA片段凝胶电泳（DNALadder）和Annexin V／PI—FITC双标法分析诱导细胞凋亡的作用。结果表明：七叶皂苷抑制HL-60细胞生长．15—120mg／L的七叶皂苷处理细胞48小时后，存活率为（92．2±0．69）％-（8．2±0．96）％，均明显低于不加药的对照组（99．4±0．31）％（P均〈0．05）；七叶皂苷15—60mg／L处理细胞24小时后细胞发生凋亡。Annexin V／PI分析显示，给药组Annexin V阳性细胞为（12．7±0．58）％-（65．4±1．30）％，明显高于对照组的（0．57±0．03）％（P均〈0．01）。七叶皂苷处理的细胞DNA琼脂糖凝胶电泳显示典形的凋亡DNA梯形条带。结论：七叶皂苷能特异性地诱导HL-60细胞凋亡，此研究结果为七叶皂苷今后作为治疗白血病的辅助药物提供实验依据。     

高三尖杉酯碱启动白血病细胞凋亡的比较蛋白质组学研究

目的：解码高三尖杉酯碱(HHT)启动白血病细胞凋亡相关蛋白。方法：在建立HHT启动HL-60细胞早期凋亡模型的基础上，分别提取未用和经HHT作用的HL-60细胞总蛋白，构建其相应的双向电泳图谱，应用图像扫描仪及图像分析软件获得差异蛋白斑点的信息，运用MALDI-TOF-MS分析呈显著性差异的蛋白斑点，将检测出的肽链质量输入蛋白质数据库获得差异蛋白质信息。结果：MHCI类抗原分子、钙结合蛋白D-28K、氯通道蛋白6、癌蛋白OP18、锌指蛋白HELIOS和凋亡抑制物样蛋白2与HHT启动白血病HL-60细胞凋亡相关。结论：运用比较蛋白质组学技术解码HHT启动白血病细胞凋亡相关蛋白，将有助于揭示HHT治疗白血病的机制，为开发HHT相关的以诱导白血病细胞凋亡为靶位的药物先导化合物提供参考。     

正常人骨髓基质细胞对HL-60和HL-60/VCR 细胞凋亡易感性的影响

为了观察正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL对白血病敏感细胞HL-60和多药耐药细胞HL-60／VCR凋亡易感性的影响，先建立HL-60或HL-60／VCR细胞与HFCL细胞共培养体系；采用瑞氏-吉姆萨染色和吖啶橙／溴化乙啶(AO／EB)染色，分别在光镜和荧光显微镜下进行形态学观察；TUNEL检测晚期凋亡细胞，流式细胞术检测细胞周期、凋亡峰和annexin V阳性的早期凋亡细胞；Western blot检测Bcl-2、活化的胱冬蛋白酶(caspase)-3蛋白和P糖蛋白(Pgp)的表达变化。结果表明，经topotecan(TPT)处理后的HL-60和HL-60／VCR细胞，在光镜和荧光显微镜下均有典型的凋亡细胞形态学改变，这些改变具有时间和剂量依赖性；annexin V染色后能检测到早期凋亡细胞；细胞周期显示：G1期细胞比例增高，S期减低，并有明显凋亡峰；TUNEL能检测到许多阳性细胞；同时出现活化的caspase-3，伴有Bcl-2的表达下调，但与HFCL细胞共培养后，经TPT处理的HL-60和HL-60／VCR细胞中早期和晚期凋亡细胞有所减少，凋亡峰减低，而且活化的Caspase-3表达减弱，Bcl-2蛋白表达上调，且以直接接触组为甚。结论：正常骨髓成纤维样基质细胞HFCL能轻度降低白血病HL-60和HL-60／VCR细胞对TPT的凋亡易感性，并有caspase-3和Bcl-2重要信号传导分子的参与。     

细胞质在顺铂诱导HL—60细胞凋亡中的作用

在建立Bcl-2高表达细胞及其对照细胞株基础上,用无细胞体系研究了细胞质在顺铂诱导HL-60细胞凋亡中的调控作用。实验结果显示,凋亡细胞胞质提取物可引起提取的正常细胞核的固缩及染色质边缘优,类似于完整的细胞凋亡的改变。Bcl-2高表达细胞的胞质提取物具有抗凋亡能力。上述结果说明引起凋亡的物质及对抗凋亡的物质在细胞质中都存在,说明细胞质在顺铂诱导的HL-60细胞凋亡中起着较重要的作用。     

Induction of caspase-3-dependent apoptosis in human leukemia HL-60 cells by paclitaxel

BACKGROUND: Paclitaxel, an antineoplastic drug, inhibits cell growth and cell cycle progression and induces apoptosis in human leukemia HL-60 cells. Caspase-3 plays a direct role in proteolytic cleavage of cellular proteins responsible for progression to apoptosis. METHODS: We examined the cell morphology and apoptosis in HL-60 cells after exposure to paclitaxel and measured caspase-3 activities with or without z-VAD-fmk (a broad-spectrum caspase inhibitor) pretreatment by flow cytometric analysis and Western blotting. RESULTS: Together, our results were (1) paclitaxel mainly induced G2/M cell cycle arrest in HL-60 cells (p<0.001); (2) time (p<0.001)- and dose-dependent (p<0.001) apoptosis of HL-60 cells was induced by paclitaxel; (3) in HL-60 cells, z-VAD-fmk blocked paclitaxel-induced apoptosis (12 h: p<0.001; 24 h: p<0.01; 48 h: p<0.01; 72 h: p<0.001) and caspase-3 activation (12 h: p<0.05; 24 h: p<0.01; 48 h: p<0.01; 72 h: p<0.01). CONCLUSIONS: These results suggest that paclitaxel can induce G2/M cell cycle transition and apoptosis via caspase-3 activity in HL-60 cells.     

钙离子在VP—16诱导HL—76细胞凋亡的作用

为了研究Ｃａ＾２＋在ＶＰ－１６（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）诱导ＨＬ－６０细胞凋亡中的作用,采用流式细胞术,激光共聚焦显微镜和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹方法进行观察,结果显示,ＶＰ－１６可诱导ＨＬ－６０细胞凋亡,并可引起细胞内Ｃａ＾２＋浓度的增加,细胞外钙离子螯合剂ＥＧＴＡ不抑制其诱导的细胞凋亡,而细胞内钙离子螯合剂ＢＡＰＴＡ－ＡＭ可抑制此过程,并且可抑制细胞色素Ｃ的释放,实验结果提示,Ｃａ＾２＋在细胞凋亡和细胞色素Ｃ的释放过程中起重要的作用。     

X连锁凋亡抑制蛋白在HL-60细胞耐药中的作用

目的 探讨X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）在纤维连接蛋白（Fn）黏附介导的HL-60细胞耐药中的作用。方法 用Fn包被培养板，以牛血清白蛋白（BSA）包被培养板作为对照。通过CCK-8实验检测Fn黏附对柔红霉素（DNR）敏感性的影响，流式细胞仪检测HL-60细胞内DNR浓度的变化，RT-PCR、Western blot检测XIAP、bcl-2、MRP和mdr1基因mRNA和蛋白表达变化。将XIAP反义寡核苷酸通过脂质体法转染Fn黏附培养的HL-60细胞，计算DNR对HL-60细胞的IC50值。结果 HL-60细胞与Fn黏附后，对DNR的敏感性下降，Fn组IC50值为0．526μmol／L，明显高于BSA组（0．132μmol／L）和悬浮培养组（0．123μmol／L）（P〈0．05）；Fn组XIAPmRNA和XIAP蛋白表达水平均较BSA组和悬浮培养组明显上调（P〈0．05）；Fn组细胞内的DNR浓度与BSA组和悬浮培养组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。XIAP反义寡核苷酸可使Fn黏附介导的耐药HL-60细胞XIAP表达明显下调，对DNR的敏感性增加。结论 XIAP可能参与了Fn黏附介导的HL-60细胞耐药，应用XIAP反义寡核苷酸能够逆转Fn黏附介导的HL-60细胞耐药。     

Rap1GAP基因表达上调对HL-60细胞体内及体外侵袭能力的影响

目的 探讨上调Rap1 GAP基因表达对白血病细胞株HL-60细胞体外侵袭能力的影响,并构建白血病动物模型验证体外实验的结果.方法 采用实时定量PCR及Western blot法检测已构建的Venus/HL-60细胞(空载体对照组)及Rap1 GAP过表达单克隆细胞株Rap1 GAP/HL-60 (R1、R2)细胞的Rap1GAP表达水平,Transwell方法检测空载体对照组、R1、R2细胞的体外侵袭能力,实时定量PCR检测各组细胞MMP-9 mRNA表达,并通过明胶酶谱法检测MMP-2及MMP-9活性;将4周龄BALB/c裸鼠进行预处理后接种白血病细胞,观察各组裸鼠生存时间及白血病细胞在其脏器中的浸润情况.结果 R1、R2细胞的Rap1GAP表达水平分别为空载体对照组的16.2、17.3倍,侵袭率分别为(55±5)％、(59±4)％,显著高于空载体对照组的(14±4)％(P值均＜0.001).R1和R2细胞的MMP-9 mRNA表达水平增加,约为空载体对照组的12.0倍.动物模型实验结果显示接种R1细胞裸鼠(R1组)生存时间为(32.00±1.85)d,R2组为(33.37±2.50)d,空载体对照组为(43.62±2.32)d,R1组和R2组裸鼠生存时间较空载体对照组缩短(P＜0.05).R1组和R2组共有3只裸鼠出现脑膜组织浸润,脑膜组织扩增出Rap1GAP和MMP-9基因,空载体对照组裸鼠各脏器白血病细胞浸润不明显.结论 Rap1GAP增强HL-60细胞侵袭能力,同时伴随MMP-9 mRNA表达水平升高,裸鼠体内实验亦证实Rap1GAP提高了HL-60细胞体内侵袭力.     

联合抑制XIAP和MRP逆转HL-60/ADR细胞耐药

本研究探讨HL-60／ADR细胞的耐药机制，比较单独应用MRP、XIAP反义寡核苷酸或二者联合应用对HL-60／ADR细胞耐药的逆转作用。应用RT-PCR和Western blot分别检测并比较HL-60细胞和HL-60／ADR细胞的BCL-2、XIAP、MDR1、MRP在mRNA和蛋白水平表达的差异。将XIAP和MRP全硫代反义寡核苷酸，以脂质体-反义寡核苷酸复合物的形式单独或联合转染HL-60／ADR细胞，并应用CCK-8实验测定反义寡核苷酸对DNR敏感性影响；用RT-PCR和Western blot检测反义寡核苷酸对XIAP、MRP的mRNA和蛋白表达的影响。结果表明：HL-60／ADR细胞的MRP和XIAP的表达均明显高于HL-60细胞。XIAP和MRP反义寡核苷酸单独应用均能下调XIAP和MRP的表达，增加对柔红霉素的敏感性。二者联合应用与XIAP反义寡核苷酸单独应用比较，并不能增强对XIAP表达的抑制作用（P〉0．05），但使HL-60／ADR细胞对柔红霉素的敏感性明显增加（P〈0．05）；二者联合应用与MRP反义寡核苷酸单独应用比较，并不能提高HL-60／ADR细胞内DNR浓度及增强对MRP表达的抑制作用，却使HL-60／ADR细胞对柔红霉素的敏感性明显增加（P〈0．05）。结论XIAP和MRP都可能参与了HL-60／ADR细胞的耐药机制，MRP、XIAP反义寡核苷酸的联合应用能更大程度逆转HL-60／ADR细胞的耐药性。