组织型纤溶酶原激活剂cDNA在大肠杆菌中的表达研究

将去除信号肽编码序列的组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）结构基因片段插入载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲＩ位点。目的基因受λＰ＿ＬＰ＿Ｒ启动子调控，通过温度调节诱导，ｔ－ＰＡ基因获得表达。电镜观察可见表达产物以包含体形式存在；表达量占非溶性菌体总蛋白的５％－８％。包含体产物经溶解及复性处理，可恢复活性；用溶纤维琼脂糖平板法、中和试验等方法证明了复性产物具有特异的ｔ－ＰＡ溶纤活性．     

登革3型病毒NS1基因重组质粒DNA的构建及其免疫原性观察

目的：构建登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒，观察其免疫原性，为登革新型疫苗的研究提供依据。方法：从感染鼠脑中提取登革3型病毒RNA，经RT－PCR获得NS1基因片段，然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒NDA转入COS7细胞，通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达，将重组质粒DNA免疫BALB／c小鼠，观察其免疫原性。结果：通过酶切鉴定和序列测定证实了NS1基因片段已经插入真核表达载体，用免疫荧光法证明转染了重组质粒的COS7细胞的胞浆中有特异荧光。重组质粒DNA免疫小鼠后可观察到诱发产生的细胞免疫应答。结论：含有登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒可以在COS7细胞中进行表达，而且能够诱导小鼠产生细胞免疫应答。     

纤维蛋白诱导活化系膜细胞表达明胶酶A、B的机制研究

为观察纤维蛋白对系膜细胞（HMC）表达明胶酶A（MMP-2）、明胶酶B（MMP-9）的作用并探讨其活化机制,应用RT-PCR、明胶酶谱分析法分别在基因转录水平与蛋白质活性水平上检测纤维蛋白对HMC表达MMP-2、MMP-9的作用,采用纤维蛋白酶谱法与平板法检测纤维蛋白对HMC表达纤溶酶原激活物（PA）活性的影响。结果发现,纤维蛋白呈剂量与时间依赖性促进HMC MMP-2与MMP-9表达的上调,并同时促进HMCtPA与uPA的表达;应用抑肽酶阻断纤溶酶活性后能够完全阻断pro-MMP-2与pro-MMP-9的活化。提示肾脏局部沉积的纤维蛋白可以促进HMC表达与活化MMP-2、MMP-9、而MMP-2与MMP-9的活化依赖于PA/纤溶酶系统的调控。     

人β-防御素3基因在COS-7细胞中的表达

目的：构建人β—防御素3(hBD3)的真核表达载体，建立稳定表达hBD3的细胞株。方法：用EcoR Ⅰ酶切合有hBD3全长基因的pGEM-hBD3重组质粒，获得其编码区全长序列，将其连接入EcoR Ⅰ预处理过的pcDNA3中。转化大肠杆菌，酶切鉴定筛选出插入方向正确的转化子。采用脂质体转染法将重组pcDNA3-hBD3真核表达载体导入COS-7细胞，用G418进行抗性筛选，用RT-PCR和Western印迹检测目的基因hBD3的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论：构建的pcDNA3-hBD3真核表达载体转染COS-7细胞后可稳定表达hBD3的mRNA和蛋白，且蛋白主要以分泌形式存在于培养上清中。     

小鼠FABP3基因全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆小鼠FABP3基因的全长cDNA,构建其真核表达载体,并于COS-7细胞内表达。方法利用PCR技术扩增小鼠FABP3基因的开放阅读框序列,并在3′末端连接24bp的Flag标签,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建表达质粒pcD-NA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建的重组质粒通过脂质体转染COS-7细胞,分别采用RT-PCR和免疫荧光法检测其FABP3mRNA及蛋白的表达情况。结果所构建的pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag重组载体可酶切出418bp的FABP3 cDNA片段和442bp的FABP3-FlagcDNA片段,经测序证实正确。转染后的COS-7细胞经RT-PCR可扩增出278bp的目的片段,且免疫荧光分析可见特异性的FABP3及Flag蛋白表达。结论构建了FABP3基因真核表达载体pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并于COS-7细胞中成功转录表达,为后续研究奠定了基础。     

tPA突变体乳腺表达载体的构建及其在乳腺中的瞬？…

目的：探讨建立乳腺时性表达系统，用于快速检测所构建的乳腺表达载体的有效性。为进行转基因动物实验奠定基础。方法：ＤＮＡ常规操作；孕小鼠乳腺注射；纤维蛋白琼脂糖平板法检测Ｍｕｔ－ＰＡ。结果构建了含有Ｍｕｔ－ＰＡ基因的乳腺表达载体ｐＢ３ｍｔ－ＰＡ，将此载体直接注射到孕小鼠乳腺中进行暂时性表达，产仔后第４天采乳汁，用纤维蛋白琼脂糖平板法检测ｔ－ＰＡ的活性，表达活性可达２０－４０Ｕ／ｍｌ，其活性能被天然的ｔ     

蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达

构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR,以200μg、500μg、1000μg、2000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA317包装细胞,通过G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/ml。再用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织,产后奶样经FAPA法检测蚓激酶活性,结果表明牛奶具有明显的纤溶活性,也就是说蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

水蛭素12肽与低分子量尿激酶融合基因的构建和表达

目的：旨在获得既能抗栓又能溶栓的双功能蛋白，并在大肠杆菌中表达。方法：化学合成水蛭素１２肽基因编码序列，通过ＤＮＡ重组技术将水蛭素１２肽基因片段连接到低分子量尿激酶ｃＤＮＡ片段５′端，构建成融合基因，结果：构建了水蛭素１２肽与低分子量尿激酶的融合基因，在大肠杆菌中获得表达，重组融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。结论：运用ＤＮＡ重组技术可将两种不同功能的蛋白合理地融合在一起，使其具有溶纤活性和抗凝活性。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的高效表达

目的：构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合基因,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ 技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ 片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３ 中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－ ）中,转染细胞经选择培养基筛选,并采用ＭＴＸ加压扩增培养。结果：得到了高效表达融合蛋白的细胞株,表达水平为３００ Ｕ／（１０６ 细胞·ｄ）。通过ＥＬＩＳＡ 和溶解圈方法鉴定,该融合蛋白可与Ｄ－二聚体结合,并具有激活纤溶酶原溶解纤维蛋白的活性。结论：成功构建并获得高效表达双功能融合蛋白的细胞株,为进一步研究这一双功能融合蛋白的体内外特异溶栓活性以及评价其作为新型导向溶栓制剂奠定了基础。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

乙酰肝素酶信号肽对其活性功能的影响研究

目的:乙酰肝素酶在肿瘤转移过程中起关键作用,其信号肽在该酶翻译后处理过程中起重要作用.本研究旨在探索乙酰肝素酶在哺乳动物细胞中的表达特性及其信号肽对此酶功能活性的影响.方法:从人胎盘cDNA文库中扩增乙酰肝素酶全长编码基因,克隆入pGEM-T载体中,测序鉴定序列完全正确后,将此基因的全长和不含信号肽基因序列分别克隆入真核表达载体pcDNA4.1/Myc-His中构建pcDNA4.1/Myc-His full HPA和pcDNA4.1/Myc-His part HPA,转化COS-7细胞进行瞬时表达,分析这两种乙酰肝素酶蛋白的表达特性及功能活性.结果:在转染了乙酰肝素酶全基因的COS-7细胞裂解液中检测到该酶的功能活性及大小约53×103(Mr)的目的蛋白免疫印迹表达带,为切割激活后乙酰肝素酶羧基端大亚基与标签蛋白的融合体.在转染了敲除信号肽的乙酰肝素酶基因的COS-7细胞裂解液中测到未被切割激活的大小约65×103(Mr)的目的蛋白免疫印迹表达带,未能检测到该酶的功能活性.结论:在COS-7细胞中表达的完整的乙酰肝素酶蛋白和不含信号肽的乙酰肝素酶蛋白均位于细胞内,没有或很少被分泌到细胞外,提示该酶在正常状态下主要分布在细胞内.含信号肽的酶蛋白在翻译后处理过程中被细胞内的蛋白酶切割成2个亚基而被激活,具有功能活性.而不含信号肽的酶蛋白没有被切割而成为有活性的酶,提示乙酰肝素酶的信号肽对其翻译后加工、激活过程有重要的影响.     

CB-GFP融合基因在COS-7细胞中的表达与定位

目的：构建以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1-CB，转染体外培养的COS-7细胞，以观察CB重组蛋白在真核细胞中的表达及定位。方法：PCR方法扩增得到去除终止密码的cB融合基因序列，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组表达载体pEGFP-N1-CB。脂质体法转染体外培养的COST细胞后，以RT-PCR和Western印迹方法验证其mRNA及蛋白的表达，并在活细胞状态下用荧光显微镜、激光共聚焦显微成像技术直接观察CB-GFP融合蛋白在细胞中的分布和定位。结果：RT．PCR及Western印迹结果均证明CB—GFP融合基因表达载体pEGFP-N1-CB在COS．7细胞中获得了表达。荧光显微镜观察显示，在空载体pEGFP-N1转染组中，COST细胞内荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP-N1-CB转染组中，绿色荧光主要聚集在细胞浆中。结论：CB融合基因能在真核细胞COST中得到高效表达，且蛋白表达主要定位于细胞浆中，本试验为CB重组蛋白的提取及进一步功能研究奠定了基础。     

MTT比色法检测兔膜上皮细胞活性

目的：建立一种定量检测角膜上皮细胞活性的方法,方法：造成兔角膜碱烧伤和激光烧伤模型,分别于伤后1,2,3周钻取板层角膜,37℃孵育1h,加MTT孵育4h,加DMSO充分溶解,于酶联免疫仪上490nm御测定D值,结果：经MTT比色法测定,碱烧伤和激光烧伤后不同时间点的兔角膜上皮细胞活性均明显低于正常对照组（P＜0．010,结论：MTT比色法可用于定量检测角膜上皮细胞活性,此方法可作为眼药效学定量评价指标之一。     

Sema3A-Fc真核表达载体构建及诱导少突胶质细胞祖细胞迁移作用观察

目的 构建真核表达载体pIGSema3A-Fc,并观察Sema3A-Fc融合蛋白对少突胶质细胞祖细胞(OPCs)迁移的作用.方法 运用DNA重组技术自原核表达载体上将鸡来源的Sema3A基因克隆到真核表达载体pIGIsG1Fc上,并用双酶切、测序法进行鉴定.采用脂质体法转染非洲绿猴肾细胞株(COS-7)细胞进行融合蛋白表达,培养3天后提取上清液,经蛋白A亲和纯化,Western blotting进行鉴定.利用插入式细胞迁移小室(millicell-PCF)细胞迁移仓观察其对OPCs细胞迁移的诱导作用.结果 重组质粒双酶切产生了2.24kb目的 片段及5.7kb载体片段.测序证实构建的Sema3A膜外区与Sema3A-Fc cDNA阅读框完整,连接部位序列正确;Western blotting证实有Sema3A-Fc融合蛋白表达.迁移试验证明其对少突胶质细胞祖细胞迁移具有推斥作用.结论 成功构建了Sema3A-Fc真核表达载体,并使有生物学活性的Sema3A-Fc融合蛋白在COS-7细胞上获得了稳定表达,为进一步研究OPCs细胞定向迁移奠定了基础.     

人PD-1分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人PD—1分子的编码序列cDNA，将其重组进真核表达载体中，并表达于COS—7细胞。方法：从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人PD—l的编码cDNA序列，将其克隆进真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组表达载体。并测序证实。用脂质体法转染COS—7细胞，流式细胞仪检测PD—1分子的膜表达。结果：PCR方法扩增出—880bp左右的基因片段，插入pcDNA3．1( )载体后构建成重组表达质粒，经测序证实扩增的片段为人PD—l编码序列。将重组质粒转染COS—7细胞，流式细胞仪检测显示有21．10％的细胞表达人PD—1分子。结论：本研究为进一步研究PD—1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

Intraarterial fibrinolysis: in vitro and prospective clinical evaluation of three thrombolytic agents

In order to investigate and compare the fibrinolytic activity of streptokinase, streptokinase-Glutamine-plasminogen, and urokinase for intraarterial fibrinolysis, as in vitro test and a prospective trial were performed. For the in vitro demonstration of lytic activity, fibrin plates with plasminogen and fibrin plates without plasminogen were incubated with streptokinase; with streptokinase-plasminogen in molar proportions of 1:1, 1:2, and 2:1, and with urokinase. In order to examine the in vivo activity of the different lytic solutions, 98 patients suffering from peripheral arterial occlusions were divided into three homogeneous groups for treatment with streptokinase, streptokinase-plasminogen, and urokinase. Although urokinase was superior to streptokinase on the fibrin plate with plasminogen, no difference was demonstrated in vivo between the two lytic agents. Streptokinase-plasminogen in a molar proportion of 1:2 showed significantly higher fibrinolytic activity than any other solution. Therefore, the fibrinolytic agent of choice for intrathrombotic injections seems to be a 1:2 solution of streptokinase with plasminogen or with the lytic enzyme plasmin itself.     

低分子量尿激酶与血纤蛋白粘附肽(12肽)融合表达及特性分析

人工合成血纤蛋白粘附肽（１２肽）ｃＤＮＡ，与低分子量单链尿激酶基因重组，获得血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶的融合基因。将此融合基因重组入ｐＢＶ２２０表达载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有与天然尿激酶相同的抗原性和溶纤活性，同时兼具血纤蛋白粘附肽（１２肽）的抗血纤蛋白单体聚合的活性     

Effect of two formulations of a beta blocker on fibrinolytic response to maximum exercise

It has been reported that catecholamine release is associated with stressful events and that adrenaline administration induces hyperfibrinolysis. To examine the possible involvement of the adrenoreceptor mechanism in the regulation of fibrinolytic activity at rest and to maximum exercise, 12 healthy volunteers (six males and six females, age range 19-21 yr) were orally medicated with two formulations of a beta blocker. The drug treatments consisted of 1) a single dose of OM756 alpha 10 mg propranolol "Inderal" tablet, 2) a single dose of a generic 10 mg propranolol tablet, and 3) a single dose of generic placebo. The drug administrations were assigned to the subjects using a complete Latin square design and double-blind procedure and were separated by 7 d. Two hours after the administration of the respective drug treatment, subjects exercised to maximal capacity using a graded exercise protocol on a bicycle ergometer. Prior to and 2 h after the drug administration and immediately after maximum exercise, heart rate, blood pressure, and oxygen consumption were measured and venous blood was removed and analyzed for fibrinolytic activity using a standard fibrin plate method. ANOVA showed that the resting and maximum heart rates were significantly reduced (P less than 0.05) following oral premedication with either of the two formulations of beta blocker, while blood pressure and oxygen consumption were unaffected. ANOVA also showed no difference in the resting fibrinolytic activity 2 h post-administration of the drug treatments but a significant decrease (P less than 0.05) in the normal fibrinolytic response to maximum exercise. It was concluded, therefore, that the resting level of fibrinolytic activity is not mediated via an adrenergic pathway but that the enhanced fibrinolytic activity to maximum exercise is partially regulated via an adrenoreceptor mechanism.