细菌内重组法快速构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体

背景：腺病毒载体具有在哺乳动物及其多种细胞基因转移和蛋白表达的高效性,目前以细菌内重组法构建病毒载体成为常用方法。 目的：观察以细菌内重组法构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体的可行性。 设计、时间及地点：基因转染病毒载体的单一样本实验,于2007-10/2008-02在中山大学分子生物实验室完成。 材料：合成血管内皮生长因子165基因的引物合成和序列测定由上海生工公司提供。pDNR-1r质粒(已含有绿色荧光蛋白基因)、pInt.AV.spaT质粒、pInt.B.B质粒均购自广州拓普基因技术公司。 方法：通过动态模板PCR 基因合成法合成的血管内皮生长因子165基因克隆入pMD18-T载体获得pMD18-T-VEGF165。将pMD18-T-VEGF165和pDNR经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,构建pDNR-VEGF165载体,酶切鉴定后,pDNR-VEGF165与pInt.AV1.spat共转化BNN菌株的感受态细胞,构建pInt.AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体,将线性化的pInt.AV1.SpaT-VEGF165和pInt.B.B转染293细胞。 主要观察指标：以DNA 测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的感染效率。 结果：重组质粒用EcoR Ⅰ酶切后,切成2条片段,大小约为1 kb和6.9 kb,实际的酶切分析结果与理论分析相符,证明转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有血管内皮生长因子165基因的重组质粒。荧光显微镜下,8 h后即可见部分细胞发出荧光,24 h发荧光的细胞数及强度达到高峰,转染率超过80%。线性化的pInt.AV1.SpaT-VEGF165和pInt.B.B共转染293细胞,12~14 d后会出现细胞病变效应。分别提取病变293细胞、正常293细胞的DNA,PCR后,1%琼脂糖凝胶电泳,病变的293细胞在约500 bp处出现条带。 结论：以细菌内重组法获得了含有成熟血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒。     

再生丝素膜对Ad-VEGF165转基因成纤维细胞基因表达的影响

背景：前期实验已证实再生丝素膜可促进pcDNA3.0-VEGF165转染的L929细胞表达血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)。 目的：进一步观察再生丝素膜对经腺病毒介导的人VEGF (Ad-VEGF165)转基因成纤维细胞基因转录表达的影响。 设计、时间及地点：对比观察细胞基因工程实验，于2007-11/2008-04在苏州大学细胞与分子生物实验室完成。 材料：再生丝素膜由苏州大学材料工程学院李明忠教授提供。 方法：将Ad-VEGF165腺病毒感染培养在再生丝素膜、聚氯乙烯膜及聚乙烯膜上的QBI-293A人胚肾和WI-38人胚肺成纤维细胞，以空载体Ad-GFP腺病毒和未接种病毒的PBS组为对照。 主要观察指标：通过实时定量RT-PCR法检测不同材料对成纤维细胞VEGF mRNA转录的影响；ELISA法检测其对VEGF、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子表达的影响。 结果：再生丝素膜组成纤维细胞VEGF mRNA呈高水平表达，但聚氯乙烯膜组转录水平明显下降(P < 0.05)。再生丝素膜组Ad-VEGF165转基因293A细胞及WI-38细胞不仅目的基因VEGF细胞因子的分泌呈高水平表达，并可促使血管生成素1基因表达水平明显提高(P < 0.05)，而且再生丝素膜还可使成纤维细胞自身分泌的碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子呈现正常表达水平。 结论：再生丝素膜不仅利于VEGF目的基因在成纤维细胞中呈现高效表达，并促进血管生成素1基因的表达，而且能维持成纤维细胞自身分泌的与组织损伤修复相关基因碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子的正常表达。     

血管内皮细胞生长因子介导的免疫毒素抗胶质瘤的体外实验研究

目的 构建血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38)基因的真核融合表达载体,并研究其表达产物对U251细胞的影响.方法 通过PCR获得本实验需要的VEGF165基因片段,通过酶切pRB391质粒获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建VEGF165与PE38融合基因的真核表达载体pIREs2-VEGF165-PE38-EGFP,经酶切及DNA测序证实构建成功后,用Lipofectamine2000脂质体转染293细胞,然后用RT-PCR及Elisa法检测VEGF165-PE38融合蛋白在293细胞的表达,并利用转染细胞后的培养上清体外测定VEGF165-PE38融合蛋白对U251的选择性细胞毒作用.结果 酶切分析及DNA测序证实,VEGF165-PE38融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pIRES2-EGFP,RT-PCR及Elisa法检测证实重组基因可在293细胞表达.细胞转染上清对U251具有较强的细胞抑制效应.结论 VEGF165-PE38融合基因构建,表达及其功能的初步研究,为进一步研究其对胶质瘤的靶向毒性及临床应用奠定基础.     

血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2在激素性股骨头坏死骨缺损中均具有成血管成骨作用,目前国内在以人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2基因联合治疗激素性股骨头坏死方面少有报道。 目的：构建人血管内皮生长因子121与人骨形态发生蛋白2双基因腺病毒穿梭质粒。 方法：将质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经Kpn Ⅰ/Xba Ⅰ酶切后,将BMP2片段定向连入pShuttle-CMV- VEGF121-IRES,构建可同时表达2个目的基因重组质粒pShuttle-CMV-V EGF121-IRES-BMP2,注入H5a细胞扩增,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析及序列测定。将已构建确认正确的腺病毒质粒,经BJ5183-AD-1电转感受态细胞进行电穿孔后,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析,PCR检测和序列分析。 结果与结论：酶切分析及核酸序列测定证实重组质粒构建正确,提示实验成功构建了血管内皮生长121及骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体。     

血管内皮生长因子表达载体的构建及在内皮祖细胞中的表达

背景：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)具有很强的促进血管生成作用，但构建其真核表达质粒是否可转染血管内皮祖细胞并完整表达还不清楚。 目的：构建VEGF表达载体,并观察其在内皮祖细胞中的表达情况。 设计、时间及地点：观察性试验，于2007-12/2008-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心实验室完成。 材料：质粒PDC315-VEGF165自备，质粒pIRES2-EGFP由美国国立卫生研究院Stanko Stojilkovic教授惠赠。 方法：运用DNA重组技术构建VEGF表达载体pIRES2-EGFP-VEGF，应用脂质体包裹的方法将载体转染猪外周血血管内皮祖细胞。 主要观察指标：采用荧光显微镜观察VEGF在内皮祖细胞内的表达，反转录-聚合酶链反应法检测VEGFmRNA表达水平， ELISA检测VEGF165蛋白表达情况。 结果：成功构建VEGF真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF。转染重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF后,在内皮祖细胞内有VEGF的表达，VEGFmRNA和VEGF165 蛋白表达水平均明显增加。 结论：VEGF 表达载体转染猪外周血血管内皮祖细胞后能有效增加VEGF基因的表达，能够获得较高水平的VEGF蛋白。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景：已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达。尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究。 目的：创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒。 设计、时间及地点：基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成。 材料：人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所。 方法：设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段, 构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1~4)并行酶切鉴定分析。然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率。 主要观察指标：重组质粒酶切鉴定结果。转染效率。采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达。 结果：成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体, 其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA 质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒。重组质粒经酶切鉴定证实构建成功。质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%。短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%。 结论：成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用。短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显。     

携带人内皮抑素基因的重组腺病毒构建及表达*☆

目的：内皮抑素是目前发现的作用最强的内皮细胞抑制因子，但内皮抑素蛋白极不稳定，难以制备及应用，故需要借助基因治疗发挥其抑制血管生成的作用。实验利用AdEasy-1系统构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒，并在人血脐静脉内皮细胞中表达出内皮抑素蛋白。 方法：实验于2006-03/10在中山大学生命科学院完成。以Pshuttle-Endostatin质粒为模板，应用特异引物，通过聚合酶链反应扩增纯化得到Endostatin基因片断，经测序鉴定后，酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中，再与骨架质粒AdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，重组质粒经筛选、提取、纯化后，经酶切及测序鉴定正确，再大量扩增为腺病毒载体，线性化后利用脂质体2000转染AAV293细胞包装并扩增，得到的病毒液纯化扩增后，感染人脐静脉内皮细胞，反转录-聚合酶链反应检测感染细胞中目的基因的表达，蛋白免疫印迹检测感染细胞中蛋白的表达。 结果：获得的Endostatin基因片段经酶切及测序鉴定正确，重组腺病毒质粒经酶切及测序鉴定正确，成功转染AAV293细胞，包装并扩增出病毒液，纯化后测滴度为2.06×1010 pfu/mL，进一步感染人脐静脉内皮细胞，在其中检测到目的基因及蛋白表达。 结论：人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功，且可在人脐静脉内皮细胞中表达出相应的目的基因及蛋白。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。 目的：观察hVEGF165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。 方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1∶3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P < 0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P > 0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P < 0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

重组腺病毒携带的人GHS-R1a基因在人胚肾293细胞中的表达(英文)

目的构建携带GHS-R1a基因的重组腺病毒,为转基因做准备。方法采用PCR法扩增GHS-R1a基因片段,随后亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,形成重组质粒pAdTrack-CMV-GHS-R1a。线性化的pAdTrack-CMV-GHS-R1a和腺病毒骨架质粒pAdEasy1在感受态大肠杆菌BJ5183内同源重组。将线性化重组质粒pAdGHS-R1a转染进HEK293细胞,并用激光共聚焦显微镜、RT-PCR和Western blot技术检测绿色荧光蛋白及GHS-R1a的表达。结果重组质粒pAdGHS-R1a经Pac I酶切后得到一个大于30kb的大片段和一个4.5 kb的小片段,证明重组腺病毒质粒pAdGHS-R1a构建成功。Ad-GHS-R1a转染293细胞后24h能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR和Westernblot均证实GHS-R1a基因能在293细胞中有效表达。结论携带GHS-R1a基因的重组腺病毒构建成功,为进一步研究GHS-R1a的功能提供了基础。     

大鼠GLUT3基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带大鼠葡萄糖转运体3（GLUT3）基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，为研究GLUT3的生物学功能提供工具。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法获取大鼠GLUT3基因全长cDNA片段，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-GLUT3，经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α，构建重组腺病毒质粒pAd-GLUT3，酶切线性化重组腺病毒质粒后转染293细胞包装成重组病毒颗粒，重组腺病毒在293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反应（PCR）及免疫印记法（western blot）的方法从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果经DNA测序和PCR分析显示GLUT3 cDNA序列正确。成功筛选出重组腺病毒质粒pAd-GLUT3后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包装后冻融细胞行PCR及western blot检测表明重组腺病毒包装成功。结论本研究成功构建了携带大鼠GLUT3基因的复制缺陷型重组腺病毒载体。     

重组腺病毒载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF的构建和鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)标记的小鼠β-NGF重组腺病毒载体。 方法利用RT-PCR法从小鼠颌下腺总mRNA中扩增β-NGF全长cDNA片断,定向克隆于腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV(已标记绿色荧光蛋白)中;在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,构建Adeasy- 1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF载体,并进行酶切鉴定。 结果成功获得小鼠-NGF全长扩增片段;pAdTrack-CMV-β-NGF测序验证含有目的基因;双酶切鉴定成功构建重组pAdTrack-CMV-β-NGF质粒;限制性内切酶的酶切分析结果证明成功构建同源重组的Adeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF载体。 结论本实验所用方法可高效、安全构建腺病毒载体pAdeasy- 1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF。     

构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因腺病毒表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

血管内皮生长因子具有促进血管生成的作用,在骨缺损的治疗研究中运用较多,但其异构体VEGF121的研究较少。 目的：构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体并观测其在骨髓基质干细胞中的表达。 方法：以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去除VEGF121基因中终止密码子,之后在基因序列前后分别加入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点,并将得到的基因亚克隆至pMD19-T质粒上,双酶切pMD19-T-VEGF121和pShuttle-CMV-IRES- hrGFP-1质粒,凝胶回收小片段和大片段,后进行连接反应,完成穿梭质粒的构建。重组病毒物理滴度测定后感染骨髓基质干细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度。 结果与结论：经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功, 荧光显微镜下观察表明, 感染重组腺病毒的骨髓基质干细胞有明显的绿色荧光表达。可见构建的携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达, 有可能用于缺血性疾患的基因治疗。     

Beclin1 基因慢病毒表达载体的构建和鉴定*☆

背景：Beclin1基因是哺乳动物的自噬调控基因。 目的：实验拟构建Beclin1 基因慢病毒过表达载体。 方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin1 基因的过表达效率。 结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin1 的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin1 基因慢病毒过表达载体。     

构建人热休克蛋白70基因重组腺病毒载体及鉴定

背景：腺病毒载体作为低毒高效的基因载体已被广泛应用,但是人热休克蛋白70基因腺病毒载体较为少见。 目的：构建重组人热休克蛋白70基因的腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达。 方法：采用AdMax腺病毒系统将外源基因人热休克蛋白70基因重组入腺病毒载体中,转染人胚肾293细胞并重组包装出毒,检测外源基因的表达和病毒滴度。 结果与结论：观察转染后的人胚肾293细胞出现明显细胞病变效应后,收获并纯化重组病毒;荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况良好,Western blot检测人热休克蛋白70蛋白表达良好,收获病毒的滴度为1×1011 efu/mL,证明实验已成功构建携带人热休克蛋白70基因的重组腺病毒载体。     

靶向人NHE-1 RNAi腺病毒表达载体的构建及细胞内酸化模型的建立

目的构建靶向人钠氢交换蛋白-1（NHE-1）RNA干扰（RNAi）腺病毒表达载体,感染SH-SY5Y细胞,建立细胞内酸化模型,为进一步研究细胞内pH值变化与散发性阿尔茨海默病间的关系奠定基础。方法利用基因重组技术构建4个含NHE-1前体微小RNA（miRNA）的重组干扰质粒pcDNA^TM6.2-GW/miR和阴性对照质粒pcDNA6^TM6.2-GW/neg-miR,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测NHE-1 mRNA表达变化,筛选最佳干扰靶序列;BP和LR重组系统获得腺病毒干扰质粒pAd-miR-NHE-1,经包装、纯化后检测腺病毒滴度;感染复数（MOI）值梯度试验确定靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值,以最佳条件感染SH-SY5Y细胞,荧光探针法检测不同处理组细胞内pH值。结果聚合酶链反应（PCR）提示最佳靶向人NHE-1 RNAi病毒表达载体构建成功,且能有效抑制NHE-1 mRNA表达;靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值为160。当最佳MOI值为160时,NHE-1 miRNA腺病毒感染24、48和72 h后SH-SY5Y细胞内pH值分别为5.97±0.03、5.98±0.02和5.98±0.02;空载体对照组为6.05±0.04、6.04±0.07和6.03±0.05;空白对照组为6.03±0.06、6.05±0.04和6.03±0.04。不同测量时间点,SH-SY5Y细胞内pH值均显著低于空载体对照组和空白对照组,差异具有统计学意义（24 h:p=0.002,0.015;48 h:p=0.030,0.012;72 h:p=0.018,0.010）;但感染RNAi腺病毒后不同测量时间点（24、48和72 h）SH-SY5Y细胞内pH值差异无统计学意义（p=0.762）。结论最佳靶向人NHE-1 RNAi腺病毒表达载体及细胞内酸化模型的成功建立,可为探索细胞内酸碱平衡与β-淀粉样蛋白产生之间的关系提供一种有效工具。     

Construction of a eukaryotic expression plasmid for human retina-derived neurotrophin-3

Neurotrophin-3 (NT-3) can promote the repair of central nervous system and retinal damage. In previous reports, NT-3 has been expressed by viral vectors. However, plasmid vectors have a safer profile compared with viral vectors in clinical studies. This study recombined amplified human retinal NT-3 with a eukaryotic expression plasmid containing green fluorescent protein (GFP) to construct an NT-3 expression plasmid, pEGFP-N1-NT-3. The transfection efficiency 48 hours after pEGFP-N1-NT-3 transfection to 293T cells was 50.06 ± 2.78%. Abundant NT-3-GFP was expressed in 293T cells as observed by fluorescence microscopy, suggesting the construct pEGFP-N1-NT-3 effectively expressed and secreted NT-3-GFP. Secretory vesicles containing NT-3-GFP were observed in a constant location in cells by laser scan confocal microscopy, indicating the expression and secretion processes of NT-3 in eukaryotic cells were in accordance with the physical synthesis processes of secreted proteins. Western blot assay showed that pro-NT-3-GFP had a molecular weight of 56 kDa, further confirming NT-3-GFP expression. At 48 hours after transfection, the concentration of NT-3 in culture medium was 22.3 ng/mL, suggesting NT-3 produced by pEGFP-N1-NT-3 was efficiently secreted. This study constructed a human retinal-derived NT-3 eukaryotic expression plasmid that efficiently expressed and secreted NT-3.     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达☆

目的：构建增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced-green fluorescent protein，EGFP）标记的人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor, hIGF-1）真核表达载体，转染至兔骨髓间充质干细胞，为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。 方法：实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物，从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1，亚克隆至pMD-T18载体，测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞，通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。 结果：成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。 结论：新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法，经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。