HBVpreS2-S基因诱发的体液免疫引起乙肝转基因小鼠肝组织损伤

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）preS2-S基因诱发的体液免疫在乙型肝炎发病机制中的作用。方法：用含HBVpreS2-S基因的质粒pcDNA3-S2-S经胫骨前肌肌肉注射免疫正常BALB/c小鼠获得抗血清，将抗血清经尾静脉注射到转基因小鼠BALB／c-TgN(preS2-S/ayw）体内，不同时间点静脉采血检测小鼠血清HBsAg、抗HBs抗体、前S2抗原、前S2抗体、转氨酶、尿素氮和肌酐的变化，并处死动物检查肝、脾、肾、肠、肺和肌肉组织的病理学改变。结果：DNA免疫正常小鼠后8－14周，抗HBs抗体的浓度维持在130－140mIU/ml；免疫后小鼠抗血清转移到转基因小鼠BALB/c-TgN(preS2-S/ayw）后2、4、7和14d，小鼠血清中未检测到HBsAg和前S2抗原，抗HBs抗体持续阳性，前S2抗体14d时转阴；ALT2、4d升高，7d恢复到正常；AST14d内始终高于正常值，4d时达高峰；尿素氮异常，γ-GT与肌酐正常。转基因小鼠肝脏出现急性乙型肝炎的改变，初期（2d、4d）血窦内和汇管区有淋巴细胞浸润，4d肝细胞开始肿胀；中期（7d）全小叶出现肝细胞气球样变，肝小叶内出现肝细胞点灶性坏死伴单个核细胞浸润，汇管区轻度单个核细胞的浸润；后期（14d）时肝细胞肿胀明显减轻，小叶内和汇管区的淋巴细胞浸润加重；脾脏（14d）淋巴细胞增生，肾脏有淋巴细胞的浸润，肺、肠和肌肉组织无明显的病理改变。结论：preS2-S基因免疫后抗血清转移到乙肝转基因小鼠体内，能使转基因鼠出现类似人急性乙型肝炎的表现，表现HBV preS2-S基因的表达产物所诱发的体液免疫在乙型肝炎的发病过程中起一定作用。     

乙型肝炎病毒preS2蛋白在转基因小鼠肝脏中的表达

目的：分析乙型肝炎病毒preS2蛋白在3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠肝脏中的分布及其病理学作用。方法：采用原核显微注射法将质粒pcDNA3.1-preS/S^t注射入小鼠受精卵雄原核，制备转基因小鼠。PCR法在基因组小平筛选3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠首建者（founder）及后代；免疫组织化学法在蛋白水平检测preS2蛋白在这些小鼠中的表达；H－E染色分析转基因小鼠肝组织的病理学变化。结果：以原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，共出生15只新生小鼠，其中存活7只，经PCR检测后获得2只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(preS/S^t）SMMU。免疫组织化学检测发现转基因小鼠肝细胞质中有preS2蛋白表达，H－E染色发现转基因小鼠肝组织中央静脉周围有淋巴细胞聚集。将这2只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F2代。结论：本研究成功建立了稳定遗传3’末端缺失的preS/S基因并表达preS2蛋白的转基因小鼠C57－TgN(preS/S^t)SMMU，它将是体内研究3’末端缺失的preS/S基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间关系的理想动物模型。     

乙型肝炎病毒（adr亚型）转基因小鼠的研究

目的：制备含有2.0拷贝乙型肝炎病毒（HBV,adr亚型）基因组的转基因小鼠,为HBV相关医学问题的研究准备实验动物模型。方法：应用受精卵原核显微注射的方法,产生HBV转基因小鼠。用PCR, Southern-blotting杂交、放射免疫、免疫组织化学以及亚显微结构分析等方法,研究外源基因在转基因小鼠体内的整合、表达以及复制。应用常规病理切片及血清生物化学方法分析转基因小鼠的病理学改变。结果：得到了4只整合有HBV基因组的建立者小鼠,并证明HBV基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,在肝、肾组织内可特异性表达、复制,并在肝细胞内发现了Dane颗粒。转基因小鼠的肝、肾组织未见明显的病理学改变。结论：获得了HBV的转基因小鼠,其病毒基因可以表达,并有病毒颗粒形成。该小鼠对于HBV的各个基因产物是免疫耐受的,其基本生物学特性与人类的HBV携带者特征相似。     

乙型肝炎病毒纯合子转基因小鼠(adr 1.2)的培育

目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。     

乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法：构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3-HBc;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核巾,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产10d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论：表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致;PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为25％(6／24)。可表达核心蛋白基因的转基因小鼠成功建立。     

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心抗原（ayw亚型）转基因小鼠模型。方法：采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠，以PCR、免疫组化和H－E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合，肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果：得到6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者（founder）小鼠，其中1只在肝细胞核和胞浆均有HBcAg的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代，F1代10只小鼠中的4只小鼠肝细胞有HBcAg的表达。结论：建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠，核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达，并且可以遗传。     

乙型肝炎病毒（ayw型）转基因小鼠的建立

目的：建立遗传上稳定的、带有乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ亚型的转基因小鼠品系。方法：通过对受精卵显微注射进行基因转移的途径制备转基因小鼠，以ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂产、ＥＬＩＳＡ、组织切片免疫组化和透射电镜等方法，分析所导入ＤＮＡ在转基因小鼠体内的功能情况。结果：得到２１只建立者小鼠，在它们的血清中检测到了ＨＢｓＡＧ和ＨＢｅＡｇ的存在，还在肝细胞中观察到了ＨＢＶ样病毒颗粒。结论：ＨＢＶ基因组ＤＮ     

乙型肝炎病毒转基因小鼠病理学观察

目的 观察乙型肝炎病毒（HBV）ayw亚型转基因小鼠的肝、肾等组织的病理改变。方法 选取15只5-48周龄的清洁级C57BL/6J-HBV转基因小鼠及15只C57BL/6J小鼠为对照进行病理大体观察，并取心、肝、脾、肺、肾、肠等组织，切片HE染色和免疫组化特殊染色后进行光镜观察。结果 C57BL/6J-HBV转基因小鼠肝脏产生局部明显的炎症反应；肝细胞肿胀，毛玻璃样变性，灶性坏死伴淋巴样细胞浸润，可见肝细胞质内嗜酸性小体，局部可见巨核肝细胞，偶见多核肝细胞，心，脾、肺、肾、肠等脏器未见明显的病理改变，免疫组化分析说明，血清HBsAg(乙型肝炎病毒表面抗原）为阳性的15只小鼠肝组织有HBsAg的存在，且HBsAg的分布呈胞质型，但不存在于脾、肺、心等组织中，血清HBsAg为阴性的15只小鼠其心、肺，肝，脾，肾，肠等组织中均未见HBsAg的存在；发现两只48周龄C57B羁J-HBV转基因小鼠患肝细胞癌。     

乙型肝炎病毒转基因小鼠中外源基因整合的检测

目的：了解乙型肝炎病毒ＤＮＡ序列在乙型肝炎病毒转基因小鼠中的整合情况。方法：用头尾相接的乙型肝炎病毒全序列基因，通过原核显微注射法产生转基因小鼠，用Ｃ区特异性引物扩增鼠尾ＤＮＡ检测整合，对其中１０只阳性鼠的扩增产物测序。结果：１２８只仔鼠中，１４只整合阳性。对１０只阳性鼠测序，９只与所转基因序列完全相同，１只在１７３９、１７４０位缺失两个碱基。结论：外源乙型肝炎病毒基因确实整合至小鼠基因组，多数为     

乙型肝炎病毒转基因小鼠中外源基因整合的检测

目的 :了解乙型肝炎病毒DNA序列在乙型肝炎病毒转基因小鼠中的整合情况。方法 :用头尾相接的乙型肝炎病毒全序列基因 ,通过原核显微注射法产生转基因小鼠 ,用C区特异性引物扩增鼠尾DNA检测整合 ,对其中 10只阳性鼠的扩增产物测序。结果 :12 8只仔鼠中 ,14只整合阳性。对 10只阳性鼠测序 ,9只与所转基因序列完全相同 ,1只在173 9、1740位缺失两个碱基。结论 :外源乙型肝炎病毒基因确实整合至小鼠基因组 ,多数为正常整合 ,但也存在缺失整合。     

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠的表型分析

目的：研究乙型肝炎病毒X蛋白致转基因小鼠的表型效应。方法：采用免疫组织化学和组织病理学方法分析转基因小鼠中X蛋白的表达部位及其病理学改变。结果：免疫组织化学检测发现X蛋白在转基因小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤组织中均有表达，从F0代到F3代小鼠，X蛋白在肝细胞中的分布逐渐从细胞质向细胞核转移。病理学分析显示，表达X蛋白的转基因小鼠出现了皮肤组织结构异常、肝组织和肺组织轻度变性等病理学变化。结论：乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤等组织中表达X蛋白，部分转基因小鼠出现的皮肤组织、肝组织和肺组织病理性损伤可能与X蛋白有关；各代转基因小鼠肝细胞中X蛋白的分布具有规律性的变化，可用于研究X蛋白在不同部位发挥功能的途径。     

乙型肝炎病毒preS 2蛋白在Hela细胞中的表达

[目的]构建乙型肝炎病毒含3’末端缺失的preS／S基因表达载体并转染细胞，观察所构建载体在体外培养的真核细胞中的表达．[方法]采用基因重组技术构建含有CMV启动子及preS／S基因（adr亚型）开放阅读框的preS／S基因表达载体pcDNA3．1-preS／St，并将其转染至Hela细胞，利用免疫细胞化学方法检测其表达情况．[结果]免疫细胞化学检测发现preS2蛋白可在Hela细胞中表达．     

乙型肝炎转基因小鼠品系C57-TgN(HBV adr2.0)SMMU的生物学特征

目的：评价乙肝转基因小鼠品系C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU生物学特征的稳定性。方法：以F6代乙肝转基因小鼠C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU为研究对象，采用基因组DNA PCR，血清ELISA检测，Western印迹分析，免疫组织化学，血清DNA PCR，透射电镜和H－E染色的方法分析HBV基因在转基因小鼠中的整合，表达，复制和组织这变化。结果：F6代乙肝转基因小鼠基因组中稳定整合有HBV基因，肝组织中可检测用HBsAg,HBcAg和X蛋白3种病毒蛋白，血清中HBsAg和HBeAg的表达率分别为19．54％和3．39％，且在血清和肝组织中存在病毒NA和病毒样颗粒；长期的病毒DNA整合，表达和复制可以引起转基因小鼠肝，肺等组织的病理性损伤。结论：乙肝转基因小鼠品系C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU具有基因组中稳定整合病毒DNA，血清和肝组织中有病毒蛋白表达和病毒复制的特征，并具有一定的组织这变化，作为生物医药研究的实验动物模型具有推广应用价值。     

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

目的：建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因（adr亚型）转基因小鼠模型，以研究x基因的功能。方法：采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因（adr亚型）开放阅读框（ORF）的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后，琼脂糖电泳回收目的的片段，用原核显微注射法将其注射入雄原核，制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder；免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果：成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，出生并存活了11只新生鼠，经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，复合PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F4代。结论：本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57－TgN（HBx)SMMU，它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。