应用人类全基因组芯片检测多药耐药白血病细胞株HL-60/VCR与敏感细胞株HL-60基因的表达差异

本研究利用基因芯片技术检测白血病多药耐药细胞株HL-60/VCR及其亲本细胞株差异基因表达谱,探讨急性白血病多药耐药机制.本试验提取白血病细胞株HL-60及其多药耐药细胞株HL-60/VCR的mRNA,在反转录及体外转录过程中分别用生物素进行标记,与Affymetrix公司人类全基因组芯片U133A杂交,用Affymetrix专用芯片扫描仪G2500A GeneArray Scanner及Microarray Suite、Micro DB^TM GeneChip LIMS、GeneChip DMT分析软件系统处理杂交信号获取结果.结果表明：白血病细胞株HL-60及其耐药株HL-60/VCR差异显示基因5 507条,其中耐药细胞株中上调表达基因3 100条,下调表达基因2 407条;差异极显著性基因1 040条,表达上调435条,下调605条,涉及与细胞生长活动及信号转导相关的基因.结论：多基因参与白血病细胞株的多药耐药机制,基因芯片技术是并行分析多个基因、探讨白血病多药耐药机制的有效方法.     

葡萄糖神经酰胺合酶与白血病细胞耐药的关系

本研究旨在观察葡萄糖神经酰胺合酶（glucosylceramide synthase，GCS）基因及其蛋白在人白血病细胞的表达及其与肿瘤多药耐药的关系。首先以β—actin基因为内参照物，采用RT—PCR方法分析了53例耐药／非耐药白血病患者外周血标本，并对药物敏感的HL-60细胞株和对阿霉素耐药的HL-60／ADR细胞株中GCS基因的表达水平进行检测，同时与多药耐药基因（mdr1）的表达进行比较。继而采用Western blot法分析HL-60细胞株及HL-60／ADR细胞株中GCS蛋白及P-gP蛋白的表达情况。结果表明：白血病患者耐药组临床标本中的GCS基因扩增条带光密度相对比值明显高于非耐药组（P〈0．05），且GCS基因扩增条带光密度值显著增强时往往伴有mdr1基因的高表达，两者呈正相关（P〈0．01、r=0．6）。HL-60／ADR细胞株GCSmRNA及蛋白均过度表达，且明显高于HL-60细胞株，与此同时，HL-60／ADR细胞株的mdr1mRNA和P-gP的表达亦显著增高。结论：GCS可能在白血病多药耐药中起着重要作用。     

儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因文库的构建和筛选

目的克隆和分离儿童急性淋巴细胞白血病（ ALL）差异表达基因，探讨小儿白血病的发病机制。方法 Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，抽取mRNA，逆转录成cDNA；经RsaⅠ酶切，实验组cD-NA被分成两组，分别与两种不同的接头连接后，与对照组cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链反应（ PCR），提取、纯化PCR产物，与PT-Adv载体连接构建cDNA消减文库，利用PCR扩增、测序和同源性分析差异表达的序列。结果选取文库中60个克隆进行菌落PCR分析，可以检出大小为200～600 bp的插入片段。从中随机挑选20个克隆进行测序、生物信息学分析，其中18个克隆与已知基因有高度序列同源性，符合率为98％～100％，共编码17种基因。这些基因大多涉及基因表达调控、DNA损伤修复、细胞周期、物质代谢等，均与细胞增殖、分化有关。此外发现2个新基因。结论本实验表明我们已成功构建小儿ALL相关消减cDNA文库，为小儿ALL发病机制的研究奠定了基础。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的：构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法：采用新近建立的抑制消减杂交方法，哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料，分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T／A连接构建文库，将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选。随机挑取100个白色克隆用茵落PCR进行鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色阳性克隆，随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增，90％的克隆中均有200～600bp的插入片段，这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论：用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库，该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

bcl-2小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

为了探讨以bcl-2基因作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性,构建bcl-2基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL-60/VCR细胞,在G418筛选后应用Western blot进行鉴定;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;Western blot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bax和耐药相关蛋白ZNRD1的表达变化.结果表明：成功构建了bcl-2的小干扰RNA载体并转染HL-60/VCR;经蛋白质水平检测证实成功建立了bcl-2低表达的白血病细胞模型;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达耐药相关蛋白ZNRD1.结论：bcl-2小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性.     

内皮差异表达基因消减文库的构建及在创伤修复中的应用

目的：建立人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因的消减cDNA文库。方法：提取培养人脐静脉内皮细胞内毒素刺激6h后mRNAs，反转录合成cDNA，与对照组间进行抑制消减杂交富集差异表达基因，亚克隆入T／A质粒并转化感受态大肠杆菌。结果：成功构建了人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后上调和下调差异表达基因两个消减cDNA文库，为进一步筛选新的内皮细胞活化相关基因打下基础。结论：经抑制消减杂交建立的消减cDNA文库富集并均一化了内毒素刺激后不同丰度的差异表达基因，对深入理解内皮细胞活化机制及参与组织修复的过程具有重要意义。     

内皮差异表达基因消减文库的构建及在创伤修复中的应用

目的建立人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因的消减cDNA文库.方法提取培养人脐静脉内皮细胞内毒素刺激6 h后mRNAs,反转录合成cDNA,与对照组间进行抑制消减杂交富集差异表达基因,亚克隆入T/A质粒并转化感受态大肠杆菌.结果成功构建了人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后上调和下调差异表达基因两个消减cDNA文库,为进一步筛选新的内皮细胞活化相关基因打下基础.结论经抑制消减杂交建立的消减cDNA文库富集并均一化了内毒素刺激后不同丰度的差异表达基因,对深入理解内皮细胞活化机制及参与组织修复的过程具有重要意义.     

硼替佐米对多药耐药HL-60细胞增殖的影响及耐药逆转作用

目的 观察硼替佐米对多药耐药白血病细胞增殖的影响及耐药逆转作用,初步探讨硼替佐米抑制多药耐药白血细胞增殖的分子机制.方法 以多药耐药白血病细胞系HL-60/DNR和HL-60/VCR细胞为模型,以HL-60细胞为对照,用四甲基偶氮唑盐反应比色法(MTT法)测定硼替佐米对HL-60、HL-60/DNR和HL-60/VCR细胞增殖的抑制作用,计算微毒剂量作为逆转耐药剂量.分4个实验组:HL-60/DNR+柔红霉素(DNR)、HL60/DNR+DNR+硼替佐米、HL-60/VCR+长春新碱(VCR)、HL-60/VCR +VCR+硼替佐米,计算硼替佐米逆转耐药倍数.硼替佐米按浓度递增(10、40、80nmol/L)作用于HL-60/DNR和HL-60/VCR细胞48 h,实时定量RT-PCR和Western blot方法检测XIAP、cIAP-1、cIAP-2 mRNA和蛋白表达水平及NF-κB活性.结果 硼替佐米呈浓度依赖性抑制HL-60、HL-60/DNR和HL-60/VCR细胞增殖,IC50值分别为(28.90 ±3.99)、(81.19 ±9.34)和(73.48±8.94) nmol/L.10 nmol/L硼替佐米预处理48 h后,DNR对HL-60/DNR细胞的IC50值由(12.90±1.75) μmol/L降低至(3.54±0.57) μmol/L(P ＜0.01),VCR对HL-60/VCR的IC50值由(33.25 ±7.28)μmol/L降低至(9.97±1.15) μmol/L(P ＜0.01),逆转耐药倍数分别为(3.32±0.53)和(2.64±0.28)倍.硼替佐米呈浓度依赖性下调XIAP、cIAP-1、cIAP-2 mRNA和蛋白的表达水平及抑制NF-κB活化.结论 硼替佐米可抑制多药耐药HL-60细胞增殖,并对多药耐药具有一定的逆转作用;其机制可能与下调凋亡抑制蛋白表达相关.     

瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库构建和质量分析对筛选和克隆瘢痕疙瘩相关基因的意义

目的:构建瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆瘢痕疙瘩特异表达的基因奠定基础。方法:实验于2003-09/2004-08在南方医科大学基因工程研究所完成。从同一标本的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织分离poly(A)+RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交方法,通过两轮杂交和两次抑制聚合酶链反应构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果:挑取了84个克隆进行聚合酶链反应扩增检测是否有插入片段,结果显示71个克隆有插入片段,其中45个克隆片段大小范围为200～750bp,符合预期的文库构建要求。结论:应用消减杂交的方法,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的瘢痕疙瘩cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选瘢痕疙瘩发生相关基因群和克隆瘢痕疙瘩特异表达基因奠定了基础,为创伤临床康复治疗提供理论依据。     

维甲酸诱导多种肿瘤细胞凋亡相关基因克隆的研究

目的 应用基于聚合酶链式反应(PCR)技术的改良消减杂交方法克隆肿瘤凋亡相关基因，验证维甲酸调控生物细胞增殖、分化。诱导多种肿瘤细胞凋亡的作用。方法 以全反式维甲酸(a11-trans retinolc acid)诱导前列腺癌DU-145细胞、早幼粒白血病HL-60细胞和乳腺腺癌MCF-7细胞产生凋亡，在此基础上，采用基于PCR技术的改良消减杂交方法克隆肿瘤细胞凋亡相关基因。结果 在维甲酸诱导前列腺癌DU-145细胞、早幼粒白血病HL-60细胞和乳腺腺癌MCF-7细胞产生凋亡过程中，有TNF、泛素、热休克蛋白和C—erb B-2基因参与，并成功克隆出多条可能与凋亡密切相关的未知基因，均被GenBank收录，登录号为AF174394，AF144056，AF141882。结论 这种基于PCR技术的改良消减杂交方法对于差异表达基因的克隆是十分有效的。     

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选白血病多药耐药相关基因

目的 克隆和筛选白血病多药耐药（MDR）相关基因。方法 以MDR白血病细胞株K562/DOX为检测样本。以K562细胞株为驱赶样本（对照）。应用抑制性消减杂交（SSH）技术分离和克隆K562/DOX细胞中过高表达的基因。构建cDNA消减库；通过反向Northern斑点杂交法进一步筛选消减库，对阳性克隆进行序列测定和同源性分析；并采用RT-PCR和Northern blot方法对某些阳性克隆进行进一步的验证。结果 发现了11个在K562/DOX细胞中高表达的基因。包括S3核糖体蛋白（S3ribosomal protein,S3rp)基因，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位2（NADHdehydrogenase subunit2,ND2）基因，My023基因等，其中多数基因与肿瘤MDR的关系尚未见报道。结论 筛选到几个可能与白血病MDR形成有关的基因。提示了白血病MDR发生的新机制。     

胎儿间充质干细胞cDNA扣除文库的构建

为了获得胎儿和成人间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC)的差异表达基因，尤其是在胎儿MSC中特异表达的基因，应用抑制扣除杂交技术构建了胎儿和成人MSC cDNA扣除库。首先，分别从胎儿和成人MSC中提取总RNA，按照SMART PCR方法依次合成单链和双链cDNA，经Rsa I酶切后，胎儿MSC cDNA分别与两种不同的接头连接，再与成人MSC cDNA经过两次扣除杂交及两轮抑制性PCR扩增后，将产物与T载体连接构建成cDNA扣除库，并转染大肠杆菌进行库扩增。结果：库扩增后共取得890个克隆，对所获得的克隆进行PCR扩增鉴定，获得768个阳性克隆，阳性率为86．3％。插入片段大小分布在0.2-1kb，平均为400－600bp。结论：抑制扣除杂交技术是一种简便、有效的筛选差异表达基因的方法。胎儿MSC cDNA扣除库的构建为进一步筛选、克隆胎儿MSC中特异性表达的功能相关基因奠定了基础。     

正常人骨髓基质细胞对HL-60和HL-60/VCR 细胞凋亡易感性的影响

为了观察正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL对白血病敏感细胞HL-60和多药耐药细胞HL-60／VCR凋亡易感性的影响，先建立HL-60或HL-60／VCR细胞与HFCL细胞共培养体系；采用瑞氏-吉姆萨染色和吖啶橙／溴化乙啶(AO／EB)染色，分别在光镜和荧光显微镜下进行形态学观察；TUNEL检测晚期凋亡细胞，流式细胞术检测细胞周期、凋亡峰和annexin V阳性的早期凋亡细胞；Western blot检测Bcl-2、活化的胱冬蛋白酶(caspase)-3蛋白和P糖蛋白(Pgp)的表达变化。结果表明，经topotecan(TPT)处理后的HL-60和HL-60／VCR细胞，在光镜和荧光显微镜下均有典型的凋亡细胞形态学改变，这些改变具有时间和剂量依赖性；annexin V染色后能检测到早期凋亡细胞；细胞周期显示：G1期细胞比例增高，S期减低，并有明显凋亡峰；TUNEL能检测到许多阳性细胞；同时出现活化的caspase-3，伴有Bcl-2的表达下调，但与HFCL细胞共培养后，经TPT处理的HL-60和HL-60／VCR细胞中早期和晚期凋亡细胞有所减少，凋亡峰减低，而且活化的Caspase-3表达减弱，Bcl-2蛋白表达上调，且以直接接触组为甚。结论：正常骨髓成纤维样基质细胞HFCL能轻度降低白血病HL-60和HL-60／VCR细胞对TPT的凋亡易感性，并有caspase-3和Bcl-2重要信号传导分子的参与。     

NPM1基因沉默的HL-60及其耐药细胞株的建立

本研究旨在构建针对HL-60细胞及其耐药细胞株(HL-60/ADR)的NPM1-RNAi的细胞模型,为研究NPM1基因在白血病耐药过程中的作用奠定实验基础。通过针对NPM1基因的shRNA与线性化的pGCSIL-GFP载体进行连接转化,对获得的重组子(pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA)进行PCR和测序鉴定。采用慢病毒载体系统将pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体与pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA共转染293T细胞,包装成NPM1-RNAi-LV,将慢病毒载体感染HL-60及HL-60/ADR细胞。采用实时定量RT-PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白水平验证建立的细胞株的转染效率。结果表明,成功构建了重组真核表达载体pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA,并通过慢病毒载体系统包装成NPM-1-RNAi-LV;将NPM1-RNAi-LV转染至HL-60及HL-60/ADR细胞后,从mRNA水平上看,对细胞的NPM1 mRNA表达有显著抑制,达到90%以上(p<0.05);从蛋白水平上看,对细胞的NPM蛋白表达具有显著的抑制效果,表明转染后的HL-60及HL-60/ADR细胞的NPM1基因特异性沉默。NPM1基因沉默后,HL-60/ADR对阿霉素的耐药性有一定程度的下降。结论:成功构建了NPM1-RNAi的HL-60及HL-60/ADR细胞模型,为进一步研究NPM1基因在白血病耐药过程中的作用建立了良好的实验基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆EB病毒致人B淋巴细胞永生化的差异性表达基因

INTRODUCTIONEpstein－BarrVirus（EBvirus）wasfirstisolatedfromculturedBruitt＇lymphomabyEpstein，BarrandAchongin１９６４．EBvirusbelongstohumanherpesvirus．MostpeopleexperiencedEBvirusinfectionwithoutobvioussymptoms．EBvirusisinvolvedinalotofconditionssuchasinfectiousmononucleosissyndrom（IM），Burkitt＇lymphoma（BL），nasopharyngealcarcinoma（NPC），chronicactiveEBvirusin－fection（CAEBV），Hodgkin＇sdisease（HD），peripheralTcelllym－phoma，gastriccancerandimmunodefficientlym…     

14-3-3ζ对HL-60和HL-60/VCR细胞增殖的抑制作用

本研究旨在进一步探讨14-3-3ζ在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)敏感细胞HL-60和耐药细胞HL-60/VCR中的表达和作用。用半定量RT-PCR和Western blot分别检测多药耐药基因mdr1 mRNA和Pgp的表达以验证基因芯片的结果,用Western blot检测Pgp、14-3-3ζ以及抗凋亡分子BCL-2、MCL-1蛋白的表达;免疫荧光法和激光共聚焦法检测14-3-3ζ在HL-60和HL-60/VCR亚细胞中的定位。采用将小干扰RNA(siRNA)通过脂质体LipofectamineTM2000介导,瞬时转染HL-60和HL-60/VCR细胞,以观察细胞生长的变化。细胞增殖指标采用生长曲线和细胞周期测定法测定。采用RT-PCR和Western blot方法检测Pgp、14-3-3ζ以及抗凋亡分子BCL-2、MCL-1表达的变化。结果表明,mdr1 mRNA和Pgp仅在HL-60/VCR细胞中高表达。与HL-60细胞相比,除了14-3-3σ之外,其他14-3-3亚型均在HL-60/VCR细胞中高表达,尤其是14-3-3ζ同时伴有BCL-2和MCL-1高表达。另外,研究发现14-3-3ζ主要定位于细胞浆和核。通过RNA干涉抑制14-3-3ζ的表达能抑制HL-60和HL-60/VCR细胞的生长,下调BCL-2和MCL-1蛋白。结论:14-3-3ζ可能通过BCL-2和MCL-1介导调控HL-60和HL-60/VCR细胞的增殖,是治疗难治复发AML的潜在新靶点。     

雷帕霉素对急性髓系白血病细胞系HL-60和HL-60/VCR生长的抑制作用

为了探讨mTOR抑制剂雷帕霉素对急性髓系白血病（acute myeloid leukemia;AML）细胞的增殖和药物敏感性的影响。以AML细胞株HL-60和多药耐药HL-60/VCR细胞系为研究对象,采用MTT法测定生长曲线和流式细胞术检测细胞周期;Western blot检测P糖蛋白（P-glycoprotein,Pgp）的表达。结果显示：与空白对照组细胞比较,雷帕霉素能抑制HL-60和HL-60/VCR细胞生长增殖（p〈0.05）,且随着浓度升高,增殖抑制率逐渐增高,24-72小时的细胞增殖抑制率随着时间的延长而有所增高（p〈0.05）,同时可阻滞细胞从G1期到S期的细胞周期转换。雷帕霉素抑制HL-60/VCR细胞的Pgp蛋白的表达。与柔红霉素单独应用相比,雷帕霉素50nmol/L、100nmol/L与柔红霉素联合应用使HL-60和HL-60/VCR细胞增殖抑制率明显增高（p〈0.05）,尤其是当先加雷帕霉素,而24小时后再加柔红霉素时。结论：mTOR抑制剂雷帕霉素对HL-60和多药耐药的HL-60/VCR细胞的生长均有抑制作用,除伴G0/G1期阻滞外,还增加细胞对柔红霉素的敏感性,这为临床难治性AML治疗提供新的治疗手段。     

抑制性差减杂交技术分离白血病多药耐药基因

目的分离及鉴定与白血病多药耐药性相关的差异表达基因。方法采用抑制性差减杂交(SSH)技术分离非耐药细胞株K562与耐药细胞株K562/DOX差异表达基因。提取总RNA,逆转录合成cDNA,经限制性内切酶RsaⅠ酶切后,分别与不同的接头(adopter1和adopter2R)连接;连接产物插入pMD19-T载体后转入大肠埃希菌中,构建cDNA差减文库;挑取阳性克隆提取质粒进行测序及同源序列分析,确定差异表达基因。结果筛选获得220个差异表达基因,包括血红蛋白、核糖体和线粒体等相关基因,以及热休克因子结合蛋白(HSPB1)基因等其他基因。结论采用SSH技术及分子克隆技术可构建耐药及非耐药肿瘤细胞株差异表达基因的差减cDNA文库,能够为进一步筛选、克隆肿瘤细胞多药耐药性相关差异表达基因奠定基础。