人β-NGF基因的体外扩增、克隆及其序列的分析

目的　对人β－ ＮＧＦ基因进行体外扩增和克隆及其序列分析,为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。方法　本实验设计并合成一对特异性引物,采用聚合酶链反应分别从人脑ｃＤＮＡ 和人睾丸ｃＤＮＡ 以及人脑基因组ＤＮＡ中扩增出β－ 神经生长因子（β－ ＮＧＦ）基因,并和Ｔ４ 载体相连接,经筛选得到人β－ ＮＧＦ克隆,并用Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧末端终止法进行序列分析。结果　凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带。结论　阳性克隆经序列分析证明克隆基因序列正确     

人β—NGF基因的体外扩增,克隆及其序列的分析

目的 对人β－ＮＧＦ基因进行体外扩增和克隆及其序列分析，为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。方法 本实验设计并合成一对特异性引物，采用聚合酶链反应分别从人脑cＤＮＡ和人睾丸cＤＮＡ以及人脑基因组ＤＮＡ中扩增出β－神经生长因子（β－ＮＧＦ）基因，并和Ｔ４载体相连接，经筛选得到人β－ＮＧＦ克隆，并用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法进行序列分析。结果 凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带。结论 阳性克     

抗人膀胱癌单克隆抗体重、轻链可变区基因体外扩增、克隆及序列分析

抗人膀胱癌单克隆抗体重、轻链可变区基因体外扩增、克隆及序列分析北京医科大学泌尿外科研究所俞莉章，萧飒，黄华梁，顾征，郭应禄，顾方六单克隆抗体的应用为膀胱癌的导向诊断和导向治疗提供了新的手段。然而目前应用的单克隆抗体绝大多数为鼠源性抗体，在人体内将产生...     

中国人神经生长因子基因（β－NGF）的扩增、克隆及序列分析

从正常人血白细胞中提取基因组ＤＮＡ，以此基因组ＤＮＡ为模板，应用ＰＣＲ方法扩增神经生长因子基因，把得到的基因片段重组到质粒ｐＵＣ１２上，经转化、筛选和鉴定得到含有中国人神经生长因子基因（β－ＮＧＦ）的克隆。用双链末端终止法测定其全部３５４ｂｐ核苷酸顺序。测出的核苷酸顺序与文献报道的顺序有６处不同，据此推导出的氨基酸顺序有３处变化。推测中国人神经生长因子基因具有特殊性。     

人降钙素基因的克隆及其序列分析

目的：克隆人降钙素基因（ｈＣＴ）并经序列分析予以确证。方法：首先自新鲜全血中用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的缓冲液提取基因组ＤＮＡ，经酒精沉淀和洗涤后，作为模板，加入上下游引物，应用聚合酶链反应直接扩增出ｈＣＴ的编码序列。并将此段ＤＮＡ插入克隆载体ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳｍａＩ位点之间。最后用ＰＣＲ－双脱氧末端终止法进行序列分析。结果：成功地克隆了ｈＣＴ，证实所得ｈＣＴ基因克隆含编码人降钙素３２个氨基酸的全长ＤＮＡ序列９６ｂｐ。结论：已获得人降钙素基因克隆，为后续研究打下基础     

人IL-32β基因的克隆和序列分析

目的克隆人IL-32β基因编码区并对其序列进行分析。方法人外周血单个核细胞经PHA-P刺激12小时后,提取总RNA,用RT-PCR扩增IL-32β基因并将目的基因克隆至pGEM-Teasy载体,转化E.coliJM109后,用菌落PCR筛选阳性克隆并进行双酶切鉴定和序列测定。结果构建的重组载体中含有人IL-32β基因的全长序列,与NCBI公布的序列一致。结论获得IL-32β基因的cDNA,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

中国人神经生长因子基因（β—NGF）的扩增,克隆及序列分析

从正常人血白细胞中提取基因组ＤＮＡ，以此基因组ＤＮＡ为模板，应用ＰＣＲ方法扩增神经生长因子基因，把得到的基因片段重组到质粒ｐＵＣ１２上，经转化、筛选和鉴定得到含有中国人神经生长因子基因（β－ＮＧＦ）的克隆。用双链末端终止法测定其全部３５４ｂｐ核苷酸顺序。测出的核苷酸与文献报道的顺序有６处不同，据此推导出的氨基酸顺序有３处变化。推测中国人神经生长因子基因具有特殊性。     

人β-NGF基因在大肠杆菌中的表达

目的:为β-NGF的基因制药选择一种新方法。方法：直接从人血细胞基因组DNA中PCR扩增出β-NGF基因片段，将构建的重组体pBV220-β-NGF转化大肠杆菌DH5α，并将筛选的阳性克隆通过4212诱导表达。结果经限制酶酶切电泳和DNA测序证实，确为β-NGF全长序列(约380bp)；全菌经SDS-PAGE电泳显示表达了β-NGF蛋白。结论：成功克隆了β-NGF基因全长序列并在大肠杆菌中获稳定表达。     

抗人卵巢癌单克隆抗体COC183-B_2轻链可变区基因的体外扩增、克隆及序列分析

目的分离抗人卵巢癌单克隆抗体ＣＯＣ１８３－Ｂ２轻链可变区（ＶＬ）基因并测定其核苷酸序列。方法用ＰＣＲ方法体外扩增单抗ＣＯＣ１８３－Ｂ２ＶＬ基因，将其克隆入ＰＵＣ１９载体，重组子用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧链终止法测定其核苷酸序列，将其序列通过Ｉｎｔｅｒｎｅｔ与ＧｅｎｅＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ和ＰＤＢ已发表的抗体序列进行比较分析。结果ＶＬ基因全长３３６ｂｐ，属小鼠免疫球蛋白轻链第Ⅱ亚类（ＳｕｂｇｒｏｕｐⅡ），由种系基因的ＶＫ及Ｊ基因的ＭＵＳＪＫ２重排而成。该ＶＬ基因序列已被ＧｅｎｅＢａｎｋ收录（ａｃｅｓｉｏｎＮｏ．ｇｂＡＦ０４４０７７）。结论该ＶＬ基因为抗人卵巢癌单抗ＣＯＣ１８３－Ｂ２功能性轻链可变区基因。     

人地中海贫血基因β654的克隆与序列分析

【目的】克隆人地中海贫血基因β654,并进行序列分析,为下游转基因小鼠模型的建立奠定工作基础。【方法】以PCR法扩增获得人β654基因,将其克隆入卸除了人β基因的质粒pBGT51中,酶切、反向点杂交及测序法鉴定重组质粒。【结果】所构建的重组质粒中含人β654基因,其引入方向正确,序列分析结果正确。【结论】构建所得的重组质粒可用于下游的转基因工作。     

犬复孔绦虫ITS及5.8S rDNA的PCR扩增、克隆及序列分析

目的以从我国广东广州和湛江犬小肠中采集的2条犬复孔绦虫作为研究对象。以保守引物NC5及NC2扩增犬复孔绦虫的ITS-1，5．8S及ITS-2rDNA片段并进行序列分析。方法将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-TEasy载体，重组质粒通过菌落PCR和酶切鉴定后，对阳性菌落进行序列测定。结果来自广州和湛江的2条犬复孔绦虫ITS及5．8 S rDNA序列总长分别为1536bp、1385bp，2条犬复孔绦虫的ITS-1、ITS-2序列相差较大，分别为20．80％、27．17％，而5．8S序列相差较小（1．49％）。结论由于犬复孔绦虫ITS序列复杂，种内存在的差异大，故不适于作为犬复孔绦虫种的遗传标记。     

人神经生长因子cDNA的体外扩增和序列测定

目的：以人胎盘组织中的mRNA为模板,扩增人βNGFcDNA,并测定核苷酸序列,为进一步研究奠定基础。方法：采用异硫氢酸胍法提取RNA;采用RT－PCR技术扩增人βNGFcDNA;Sanger双脱氧末端终止法测定核苷酸序列。结果：从人胎盘组织中提取RNA,以其中的mRNA为模板,扩增出人βNGFcDNA,经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小与目的的片段相同,进一步测定序列证实为目的的片段。结论：运用RT－PCR技术扩增出人βNGFcDNA,扩增时在5′端以限制性内切酶酶切位点加以修饰,此片段经核苷酸序列测定证实为目的片段,为下一步研究奠定了基础。     

日本血吸虫精氨酸酶基因启动子序列的扩增及序列分析

目的获取日本血吸虫(Sj)精氨酸酶(ARG)新基因的DNA编码序列及其启动子序列,实验验证ARG基因编码序列的完整性。方法以日本血吸虫成虫DNA做模板,PCR扩增ARG基因编码区的DNA序列并测序;根据Sj ARG基因已扩增的DNA序列设计2条巢式引物,用BaKaRa LA Taq PCR Cloning in vitro Kit,扩增Sj ARG基因的启动子序列;对已扩增得到的序列进行TATA盒的寻找以分析启动子序列的位置,实验验证我们曾获取的SjARG新基因编码序列的完整性。结果扩增得到长约1000bp ARG基因DNA序列,SjARG基因DNA序列内没有内含子,与cDNA序列完全一致。对启动子序列扩增后,得到一略大于250bp的序列,测序后分析发现其中有36bp与ARG基因DNA序列的5’端重叠。因此,将精氨酸酶基因的DNA序列又向前延伸了221bp,与前面得到的序列拼接后得到一条1486bp的总序列,将该序列在NCBI上进行ORF的寻找发现其最长的ORF达1164bp,起始密码子在第156位,终止密码子在第1319位,该起始密码子前32位为TATA盒的位置。因此,确定该SjARG基因全长cDNA编码序列长应为1164bp。结论成功扩增获得了日本血吸虫精氨酸酶基因编码区的DNA序列,其不舍有内含子;并扩增得到了该基因的启动子序列,从而获得了SiARC基因真正的全长cDNA序列,为进一步的功能鉴定奠定了基础。     

In Vitro Amplification, Cloning and Proto-caryon-cell Expression of the Gene Encoding the Major Toxoplasma gondii Antigen-P30

ＩｎＶｉｔｒｏＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＰｒｏｔｏ－ｃａｒｙｏｎ－ｃｅｌＥｘｐｒｅｓｉｏｎｏｆｔｈｅＧｅｎｅＥｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅＭａｊｏｒＴｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉＡｎｔｉｇｅｎ－Ｐ３０ＬｉＹｏｎｇｈｕａ，ＣｈｅｎＸｉｕｃ...     

人hole基因的克隆和序列分析

目的 克隆人的hole基因,并进行生物信息学分析.方法 以胚胎心脏cDNA文库为模板,进行PCR扩增得到hole基因的ORF.并进行亚克隆入PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,用Xho1进行酶切和测序鉴定阳性克隆.利用Internet和GeneBank数据库对测序结果正确的hole基因进行生物信息学分析. 结果克隆了hole基因,测序结果正确;生物信息学分析表明, hole基因开放读码为960 bp,编码319个氨基酸;同源性分析表明,人的hole与鼠、鸡hole蛋白具有高度同源性.多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在心脏、肝脏、肺、脑、肾脏、脾脏、胰脏均有表达,其心脏表达最高. 结论成功克隆hole基因,对其功能进行了初步预测,为进一步的功能研究打下基础.     

人Hrs cDNA的克隆与序列分析

以小鼠ＨｒｓｃＤＮＡ为探针从人胎盘ｃＤＮＡ文库中克隆出人ＨｒｓｃＤＮＡ，其全长为２９１０ｂｐ，所编码的蛋白质含７７７个氨基酸。人ＨｒｓｃＤＮＡ与小鼠ＨｒｓｃＤＮＡ间高度保守。推定的氨基酸序列含有锌指样结构域、脯氨酸丰富区及脯氨酸、谷氨酰胺丰富区。     

中国农大小型猪胰淀素基因部分未知序列扩增与分析

目的扩增中国农大小型猪IAPP基因序列,分析其序列结构特点。方法提取中国农大小型猪血液基因组DNA,设计3对特异性引物进行PCR扩增,产物鉴定、测序和同源性比对分析。结果成功扩增出中国农大小型猪IAPP基因的1028bp的序列。结论经同源性比对分析显示,中国农大小型猪与人的IAPP基因的同源性为77%。     

细粒棘球绦虫烯醇酶(EgEnolase)基因的克隆和序列分析

目的 细粒棘球绦虫烯醇酶基因(EgEnolase)的克隆和所编码的蛋白质的结构、功能以及应用前景分析.方法 利用美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的在线分析工具BLASTx和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPaSy.http://ca.expasy.org/),以及CBS Prediction Servers提供的蛋白序列在线分析工具,结合Vector NTI suite生物信息学分析软件,从GenBank中细粒棘球绦虫的表达序列标签(EST)数据库中发现烯醇酶的5'端和3'端的EST序列,根据预测的编码区两端序列设计引物,从细粒棘球绦虫青海绵羊分离株中用多聚酶链式反应(PCR)方法扩增其基凶组序列,PCR产物克隆到T载体,测序并分析序列中的内含子,以内含子两侧序列的合并序列为引物.采用不对称PCR方法去除其中的内含子序列,预测编码蛋白的结构和功能特征,并分析其应用前景.结果 细粒棘球绦虫青海绵羊株烯醇酶基因的基因组序列长为1 449 bp,含有两个长度分别为78 bp和69 bp的小内含子.该基因编码433个氨基酸;预测其氨基酸序列中含有一段跨膜区(aa104-124),N端在膜外,C端在膜内,恰好分为两个不同的功能域,膜内区是执行酶催化功能的主体,Swiss-Model模建的3D结构显示,膜内区由α螺旋和β折叠相间排列形成桶样结构,底物结合位点、催化中心、Mg2+结合位点等关键位点在空间上紧密靠近,位于桶形结构的中心.该蛋白还有一个潜在的核定位序列aa190-199 .该蛋白含有多个T、B细胞表位,且膜外的aa49-57.和膜内的aa228-236兼性的T、B细胞表位,线性B细胞表位aa206-213中包含了催化位点Glu210.结论 细粒棘球绦虫烯醇酶可能是一个位于虫体皮层表膜具有较好的免疫诊断和疫苗应用前景的膜蛋白,同时还可能进入细胞核调节基因表达.     

恶性疟原虫海南株线粒体复合体Ⅱ辅基铁-硫蛋白基因克隆及序列分析

目的：构建恶性疟原虫海南株线粒体复合体Ⅱ琥珀酸-泛醌还原酶辅基铁-硫蛋白(iron-sulfur protein,Ip)基因原核表达质粒pET28α-Ip，测定Ip基因序列，为研究铁-硫蛋白基因功能奠定基础。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫海南株基因组DNA中扩增出Ip基因，扩增产物经纯化后，用BamHI XhoI双酶切，定向克隆入pET28α质粒，转化大肠杆菌DH5α，再用BamHI XhoI酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定，并进行同源性比较。结果：筛选出编码海南株Ip基因的原核表达质粒pET28α-Ip，海南株Ip基因序列与K1、3D7株高度同源。结论：pET28α-Ip重组质粒的构建，为进一步研究铁-硫蛋白基因奠定基础。     

日本血吸虫亲免素基因的扩增及序列分析

[目的]研究日本血吸虫亲免素基因编码序列的结构及进行初步的功能预测.[方法]用5'端和3'端锚定PCR从尾蚴文库中扩增,以获取日本血吸虫中国大陆株亲免素基因完整的开放阅读框(open readingframe,ORF);用生物信息学技术确认其是否为亲免素编码基因并进行结构功能的初步分析和预测.[结果]用5'端和3'端锚定PCR从尾蚴文库中获得了亲免素基因5'端和3'端所缺序列,得到的亲免素基因cDNA的总序列长为1 438 bp,其ORF长1 296 bp,编码431个氨基酸.利用生物信息学技术鉴定其为日本血吸虫亲免素基因的完整cDNA序列.并用RT-PCR从日本血吸虫尾蚴mRNA扩增出亲免素基因的ORF.[结论]成功获得了日本血吸虫亲免素编码基因的全长cDNA,为进一步的功能研究打下了基础.