G0/G1期异时相Cyclin B1的表达对细胞凋亡的影响

目的 研究G0/G1期异时相细胞周期素B1(Cyclin B1)的大量表达对细胞凋亡的影响.方法 首先构建了四环素可诱导表达Cyclin B1的单克隆细胞株,其次,筛选出能最大程度阻滞细胞于G0/G1期的胸腺嘧啶核苷(Thymidine)浓度,最后,在阻滞的时间内加入四环素诱导Cyclin B1表达,并用免疫印迹和流式细胞仪检测证实后,用膜联蛋白/碘化丙啶(Annexin Ⅴ/PI)双染法和API法检测细胞凋亡.结果 终浓度为5 mmol/L的胸腺嘧啶核苷能阻滞单克隆细胞株在G0/G1期,并至少维持48 h;在细胞同步化期间加四环素诱导后,Cyclin B1表达增加,并且G0/G1期特异性细胞凋亡增加.结论 G0/G1期异时相Cyclin B1的表达能诱导细胞凋亡.     

大鼠脑缺血后神经元凋亡的细胞周期特异性和相关基因表达

目的:探讨大鼠局灶性脑缺血后神经元凋亡的细胞周期特异性分布以及相关基因表达之间的内在关系。方法:建立大鼠大脑中动脉阻塞模型,利用流式细胞分选和原位末端标记及RT-PCR技术,检测正常组和缺血后大鼠脑组织中的神经元凋亡的细胞周期特征,及其Cyclin D1和Cyclin B1基因的表达规律。结果:神经元凋亡可以发生在细胞周期的各个时相,细胞凋亡多发生在G0/G1期,而且神经元也可在S期甚至到达G2期发生凋亡。正常脑组织中神经元表达Cyclin D1,缺血后表达增加;Cyclin B1在正常脑组织的神经元中不表达,缺血后呈现弱表达。结论:脑缺血后神经元可以重新进入细胞周期,其细胞凋亡是多点启动的,可发生在细胞周期的各个时相。Cyclin D1和Cyclin B1的异常激活可能参与了缺血后神经元凋亡的细胞周期调控过程。     

利用可控表达Cyclin B1的单克隆细胞株寻找与Cyclin B1结合的蛋白

目的 利用已经构建好的四环素诱导细胞周期素B1 (Cyclin B1)表达的单克隆细胞株,探索可能与Cyclin B1相互作用的蛋白.方法 加入四环素的单克隆细胞株能表达带有Myc和His标签的Cyclin B1.将未诱导和用四环素诱导48 h的细胞裂解后,分别加入10μg Myc的单克隆抗体,用免疫沉淀法(immune precipitation,IP)沉淀可能和Cyclin B1相作用的蛋白,将蛋白混合物行聚丙烯酰胺凝胶电泳,用考马斯亮蓝染色法和银染法明确差异蛋白,再用质谱(mass spectrometry,MASS)行蛋白鉴定.结果 用质谱鉴定出的蛋白有细胞周期素依赖蛋白激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1),细胞周期素依赖蛋白激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,CDK2),有丝分裂阻滞缺失样蛋白1(Mitotic arrest deficient-like protein 1,MAD1-like 1,MAD1L1)和热休克蛋白8(heat shock 70kD protein 8 isoform 1).结论 除Cyclin B1和CDK1直接相互作用外,Cyclin B1与CDK2、MAD1L1和热休克蛋白8都可能有直接或间接的相互作用.     

Cyclin B1的启动子在HeLa细胞cyclin B1蛋白调控中的作用

目的 通过检测细胞周期素B1(cyelin B1)的启动子在HeLa细胞的不同细胞周期的活性变化,探讨其对cyclin B1蛋白的调味控作用.方法 采用PCR法获得HeLa细胞cyclin B1的启动子,通过基因重组插人pGL3 promoter vector 从而获得质粒pGL3/cyelin B1 promoter.采用羟基脲(hydroxyurea,HU)对HeLa细胞进行细胞周期G_1、S、G_2/M期的同步化,通过流式细胞术法确认.用短暂转染的方法,将重组的质粒转染至HeLa细胞.通过双萤光素酶活性检测分析cyelin B1的启动子在HeLa细胞周期G_1、S、G_2/M期的活性的变化.结果 双荧光素酶活性检测cyelin B1的启动子活性在G_1期最高,S期最低,G_2期中等.结论 在HeLa细胞巾cyclin B1的启动子活性和cyclin B1蛋的的表达并不同步.     

Fas诱导MML-1凋亡时活化caspase-3 表达与细胞周期的关系

目的 研究Fas诱导的B淋巴细胞瘤细胞株MML-1凋亡过程中,细胞内活化caspase-3表达与细胞周期的关系.方法 抗Fas抗体孵育MML-1不同时间以诱导细胞凋亡,流式细胞仪检测凋亡率并验证MML-1对Fas诱导凋亡的敏感性.采用PI-Triton X和FITC-active caspase-3双染色分析经Fas诱导凋亡的MML-1内活化caspase-3的表达.以细胞周期蛋白cyclin A、B_1、E 标记Fas诱导凋亡的处于不同增殖周期MML-1(S、G_2/M和G_1期细胞),流式细胞术检测细胞内活化caspase-3的表达.结果 Fas诱导6 h后,MML-1凋亡率达到56%.Fas诱导4 h后,活化caspase-3在G_1期细胞内表达显著升高,仅有少量S期和G_2/M期细胞表达活化caspase-3.Cyclin A、B_1阴性而cyclin E阳性MML-1表达活化caspase-3.结论 Fas诱导MML-1凋亡过程中,细胞内活化caspase-3的表达与细胞周期有关.G_1后期和S早期的MML-1最先表达活化caspase-3,且对Fas诱导凋亡的敏感性最高.     

曲古抑菌素A对人乳腺癌MCF-7细胞抑制作用的实验研究

目的 探讨曲古抑菌素A(TSA)对乳腺癌细胞系MCF-7细胞生长增殖、细胞周期相关基因CDK4、Cyclin D1、Rb表达的影响.方法 分别以不同浓度的TSA处理MCF-7细胞,采用流式细胞仪检测细胞周期;用RT-PCR方法检测CDK4、Cyclin D1、Rb mRNA的表达水平;用Western blotting法检测MCF-7细胞的CDK4、Cyclin D1、Rb蛋白表达.结果 各组细胞均随着药物浓度的升高,S期细胞在细胞周期中所占比例逐渐减少,G1期细胞则明显增加(P＜0.01),细胞滞留在G1期;经不同浓度TSA处理的细胞CDK4和Rb mRNA表达水平没有明显变化;Cyclin D1的mRNA表达水平显著下降.CDK4蛋白表达水平也没有明显变化,Cy-clin D1和pRb磷酸化蛋白的水平明显下降.结论 TSA抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖可能是通过下调Cyclin D1和Rb蛋白的磷酸化水平来实现的.     

中药金克通过G1期阻滞和诱导凋亡抑制HL-60细胞增殖

目的 研究中药金克对体外HL-60细胞系细胞周期调控方面的影响.方法 使用MTT比色法检测HL-60细胞活力,使用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,使用Western blot检测细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达. 结果金克能通过G1期阻滞和诱导凋亡使HL-60细胞活性降低.金克作用于HL-60细胞引起剂量和时间依赖性凋亡.金克阻滞HL-60细胞在G1期的原因是CDKI蛋白(p19INK4,p21Cip/waf1 和 p27Kip1)表达增高,同时CDK2,CDK4,CDK6,Cyclin D1和Cyclin E表达降低.金克也引起凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2和Caspase-3的表达.结论 首次证明了金克通过G1期阻滞和诱导凋亡抑制HL-60细胞的增殖,这表明金克是一个细胞周期特异性的抗癌药物.     

PTEN基因影响K562细胞周期的分子机制探讨

【目的】探讨抑癌基因PTEN对人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞周期的影响。【方法】将携带有野生型PTEN和绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-PTEN-GFP）及对照载体腺病毒（Ad-GFP）转染人慢性粒细胞白血病细胞系K562。MTT检测细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测转染效率、细胞凋亡率和细胞周期的变化;荧光定量PCR（FQ-PCR）检测PTEN、CyclinD1、CyclinD2、CDK4、P27Kip1 mRNA水平变化,Western blot检测上述蛋白表达水平的变化。【结果】与Ad-GFP组比较,Ad-PTEN-GFP转染K562细胞后,细胞凋亡率最高为30%,细胞周期显示：G0/G1期细胞比例由54.9%增加至78.5%,G2/M期比例由30.2%降至13.6%,Cyclin D1、Cyclin D2、CDK4 mRNA及Cyclin D1蛋白表达降低,P27Kip1 mRNA及蛋白表达增加。【结论】PTEN基因高表达可以促进K562细胞凋亡,并通过抑制Cyclin D1、Cyclin D2、CDK4及增加P27Kip1表达使细胞周期阻滞在G0/G1期。     

系统性红斑狼疮外周血单个核细胞周期相改变及药物影响

【目的】研究系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus SLE)外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells PBMCs)的细胞周期相改变和药物的影响,探讨其在SLE发病中的作用。【方法】用流式细胞分析技术,检测SLE患者(活动期和静止期)PBMCs的细胞时相构成比例,观察药物对其的影响,并和正常人进行比较;分析SLE患者细胞周期时相构成比例和血清抗dsDNA抗体的相关性.【结果】①基础状况下,SLE患者PBM-Cs的细胞周期时相构成比例(％)和正常人之间无明显差别(均P>0.05)。②植物凝集素(phytohemagglutinin,PHA)使活动期SLE患者PBMCs的G_0/G_1期比例减低(P<0.01)和S期比例增高(P<0.01)、缓解期SLE患者PBMCs S期比例增高(P<0.01)、正常人PBMCs各时相均无明显改变。③用地塞米松(dexamethasone,Dex)后,活动期SLE患者PBMCs各期时相比例无改变,缓解期SLE患者PBMCs G_0/G_1期比例增高(P<0.001)和S期比例减低(P<0.001),正常人PBMCs的G_0/G_1期比例增高(P<0.05)。④活动期SLE患者血清抗dsDNA抗体和G_0/G_1期比例呈负相关(r=-0.787,P=0.001)、和S期比例呈正相关(r=0.855,P=0.0001)。【结论】SLE患者PBMCs具有较强的潜在增殖活性,其时相构成比例和血清抗dsDNA抗体相关,可能和其发病及病程有关。     

分选后晚G1期凋亡细胞CyclinE表达分析

目的 以G1期细胞凋亡为模型,检测细胞周期察Cyelin E是否与凋亡相关.方法 收获紫外线照射后的人类急性淋巴细胞性白血病细胞,一部分采用流式细胞术将凋亡诱导后的细胞进行Cyclin E/DNA双参数分析和细胞周期特异性细胞凋亡API双参数分析;一部分利用流式细胞分选术将凋亡诱导后的细胞分为凋亡组和未凋亡组,Westernblot法检测并比较两组细胞Cyclin E蛋白表达情况.结果 Cyclin E/DNA双参数分析观察到凋亡诱导后细胞周期阻滞过程中细胞Cyclin E表达水平明显升高.分选后Western blot检测观察到凋亡组Cyclin E表达明显低于未凋亡组.结论 Cyclin E表达水平的升高可能对晚G1期细胞的凋亡起到保护作用.     

Fas诱导MML-1凋亡时活化caspase-3表达与细胞周期的关系

目的研究Fas诱导的B淋巴细胞瘤细胞株MML-1凋亡过程中,细胞内活化caspase-3表达与细胞周期的关系。方法抗Fas抗体孵育MML-1不同时间以诱导细胞凋亡,流式细胞仪检测凋亡率并验证MML-1对Fas诱导凋亡的敏感性。采用PI—Triton X和FITC—active caspase-3双染色分析经Fas诱导凋亡的MML—1内活化caspase-3的表达。以细胞周期蛋白cyclin A、B1、E标记Fas诱导凋亡的处于不同增殖周期MML-1（S、G2／M和G1期细胞）,流式细胞术检测细胞内活化caspase-3的表达。结果Fas诱导6h后,MML-1凋亡率达到56％。Fas诱导4h后,活化caspase-3在G1期细胞内表达显著升高,仅有少量S期和G,／M期细胞表达活化caspase-3。Cyclin A、B1阴性而cyclinE阳性MML-1表达活化caspase-3。结论Fas诱导MML-1凋亡过程中,细胞内活化caspase-3的表达与细胞周期有关。G1后期和S早期的MML-1最先表达活化caspase-3,且对Fas诱导凋亡的敏感性最高。     

特发性血小板减少性紫癜的B淋巴细胞的细胞周期分布

目的:探讨特发性血小板减少性紫癜(ITP)的B淋巴细胞的细胞周期分布和ITP的关系。方法:用碘化丙啶DNA染色法染色后用流式细胞仪检测40例初发的ITP患者治疗前、治疗恢复正常后及20例正常人的B淋巴细胞的细胞周期的分布比例,比较初发ITP患者治疗前、治疗恢复正常后与正常人的细胞周期分布的差异。结果:初发ITP组G0/G1期B淋巴细胞比例是(81.70±5.53)%,较治疗后恢复正常(90.38±0.92)%和对照组(91.53±2.09)少,差异有显著性(P<0.05);初发ITP组S期B淋巴细胞比例是(10.23±4.11)%,较治疗后恢复正常(5.60±0.91)%和对照组(5.18±1.21)%高,差异有显著性(P<0.05);初发ITP组G2/M期B淋巴细胞比例是(8.33±3.43)%,较治疗后恢复正常(4.03±1.76)%和对照组(3.30±1.84)%高,差异有显著性(P<0.05)。治疗后恢复正常和正常组比较G0/G1期、S期、G2/M期B淋巴细胞无差异(P>0.05)。结论:初发ITP患者治疗前S期和G2/M期B淋巴细胞比例增加,提示ITP患者的B淋巴细胞有过度增殖的现象,抑制ITP患者B淋巴细胞的细胞周期的转换可能是治疗ITP的新的治疗途径。     

Aβ25-35诱导PC12细胞周期紊乱及对P53和Cyclin D1基因表达的影响

目的:探讨Aβ25-35诱导体外去血清培养的PC12细胞周期变化及对P53和Cyclin D1基因表达的影响。方法:PC12细胞同步于G0期,采用终浓度为0-45μmol/L或浓度为25μmol/L Aβ25-35处理PC12细胞,用MTT比色法分析细胞存活率;流式细胞仪检测分析细胞周期的改变;RT-PCR和Western blot从mRNA及蛋白水平检测P53和Cyclin D1基因的变化。结果:随着Aβ25-35剂量的增加,PC12细胞存活率降低(P<0.01);流式细胞仪分析表明去血清培养24 h可使约90%PC12细胞停滞于G0/G1期,25μmol/L Aβ25-35诱导组8,16,24 h与对照组比较,S期百分率明显增加(P<0.01),16 h后细胞凋亡率明显增加(P<0.01),可见明显的亚二倍体峰(Ap峰);P53 mR-NA表达和P53蛋白表达降低、Cyclin D1 mRNA表达和Cyclin D1蛋白表达增高。结论:Aβ25-35降低去血清培养的PC12细胞存活率,诱导同步化于G0/G1的PC12细胞重新进入细胞周期,并阻滞于S期,同时出现凋亡,可能与下调P53的表达,上调Cyclin D1的表达有关。     

ORC1在大鼠血管平滑肌细胞G1/S和S期的表达

目的检测大鼠血管平滑肌细胞(VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS,VSMCS)G1/S、S期中起始识别复合物(ORIGINRECOGNITION COMPLEX1,ORC1)的表达。方法采用组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉原代培养VSMCS。利用胸苷双阻断法造成细胞同步,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术、流式细胞仪检测分别测定G1/S、S期VSMCS的ORC1MRNA及蛋白表达。结果经光镜、免疫组化鉴定证实分离培养的细胞为VSMCS。ORC1MRNA在GO期的VSMCS无明显表达、G1/S期达到高峰,到S、G2/M期明显减少。流式细胞仪检测的VSMCS ORC1蛋白质表达与MRNA变化相似。结论ORC1可能在VSMCS细胞周期调节过程中起重要作用。     

TLR7激活上调细胞周期蛋白表达促进Hela细胞增殖

目的 探讨Toll样受体7(TLR7)信号通路激活对人宫颈癌Hela细胞周期蛋白表达及对细胞增殖的影响.方法 使用不同浓度的Gardiquimod经过不同的时间刺激Hela细胞,采用MTS比色法分析其对Hela细胞增殖的影响;采用流式细胞仪检测同一浓度的TLR7激动剂Gardiquimod经过不同的时间刺激Hela细胞后对Hela细胞周期的影响; Western blot分析Gardiquimod经过不同的时间刺激Hela细胞后对细胞周期蛋白CyclinB1、Cyclin E表达水平的影响.结果 TLR7的激活促进Hela细胞增殖,并呈时间和浓度依赖性;Gardiquimod可时间依赖性增加细胞周期在S期的比例;Cyclin B1、Cyclin E的表达水平随着Gardiquimod作用时间的增加而增加.结论 TLR7激动剂Gardiquimod可能通过上调细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E表达水平,进而促进Hela细胞增殖.     

模拟IMRT对CNE-2细胞周期及Cyclin D1/Cyclin B1表达的影响

目的 探讨模拟调强放射治疗（IMRT）对人鼻咽低分化鳞癌细胞株(CNE-2)细胞周期及细胞周期素Cyclin D1、Cyclin B1转录水平的影响。 方法 CNE-2分为急速照射（ART）组和模拟IMRT组,两组分别给予6MV X线2、4、6和8 Gy 四个剂量点的照射;ART组的照射时间为1～3 min,模拟IMRT组的完成时间为35 min。另设空白对照组,不接受照射,其余条件相同。照射后12 h,流式细胞术分析细胞周期分布,RT-PCR检测细胞周期素Cyclin D1和Cyclin B1的转录水平。 结果 在相同剂量点,模拟IMRT组G2期细胞比例均低于ART组,两组G2期细胞比例随照射剂量的增加而逐渐增加。模拟IMRT组与ART组在相同剂量点之间比较,Cyclin D1转录水平的差异均无统计学意义（P均＞0.05）;Cyclin B1转录水平的差异均有统计学意义（P均<0.05）,且随照射剂量的增加而下降,模拟IMRT组Cyclin B1的表达高于ART组。 结论 模拟IMRT照射时间延长对G2期阻滞作用下降,细胞周期素Cyclin B1的表达相对升高。     

二藤合剂氯仿提取物对类风湿性关节炎T细胞的免疫调节作用

【目的】观察二藤合剂氯仿提取物对活化的类风湿性关节炎(RA)患者T细胞表达CD69以及Jurkat细胞周期的影响．推测其可能的细胞免疫调控机制。【方法】培养Jurkat细胞，加入二藤合剂各提取物培养72h，四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测增殖率，筛选有效部位；无菌抽取RA患者全血，与不同浓度二藤合剂氯仿提取物或染料木黄酮预孵30min后，再加植物血凝素(PHA)培养24h，采用流式细胞术检测T淋巴细胞CD69的表达率；培养Jurkat细胞，加不同浓度的二藤舍剂氯仿提取物或氨甲喋呤(MTX)继续培养48h，流式细胞术检测细胞周期。【结果】二藤合剂各提取物中以氯仿提取物抑制Jurkat细胞增殖作用最强；10mg／L和20mg／L的二藤合剂氯仿提取物可显著抑制PHA刺激下RA患者的T细胞，尤其是CD4T细胞表达CD69；10mg／L浓度的氯仿提取物主要将细胞增殖周期抑制在G1期，与MTX作用于S期有明显区别。【结论】二藤合剂氯仿提取物可抑制RA患者T细胞尤其是CD4T细胞的早期活化，阻止T细胞能量和原料合成，从而阻断其DNA合成过程，减少细胞向G2期的转化，为其用于RA的治疗提供了实验依据。     

Effects of Cyclin D1 Antisense Oligodeoxyneucleotides on the Growth and Expression of G_1 Phase Regulators in Gastric Carcinoma Cells

CyclinDisinvolvedintheregulationofG1phrasecellcycle ,andithasthreesubtypes (D1,D2 ,D3) .CyclinD1islocatedin 11q13,withitscDNAbeing 4 .3kb .Itisidentifiedastheproto oncogengandisfoundtobeoverexpressedinbreast,esophageal,andhepaticcarcinoma .ItwasreportedthatthepositiverateforCyclinD1ingastriccarcino mawas 2 3.7% - 47% [1,2 ] .CyclinD1mRNAoverexpressionwasfoundin 2 2 %ofgastriccancertissues,andwascorrelatedwithinvasionoftu mors[3] .WetransfectedgastriccarcinomacellswithCyclinD1antisenseo…     

PTEN体外转染对乳腺癌细胞ZR-75-1细胞周期和增殖的影响

目的探讨外源野生型PTEN基因对人乳腺癌细胞ZR-75-1细胞周期和增殖的影响,阐明PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的机制。方法利用脂质体介导法将重组质粒pBP-wt-PTEN导入人乳腺癌细胞ZR-75-1中,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株并扩增培养;采用细胞计数法检测肿瘤细胞增殖速度;流式细胞术检测细胞周期的变化。结果经嘌呤霉素筛选得到稳定表达细胞株;重组质粒pBP-wt-PTEN稳定转染可明显抑制ZR-75-1细胞的体外增殖,细胞周期明显改变,细胞从G1期到S期发生抑制,并在G1期峰前出现1个较为明显的凋亡峰。结论转染外源性野生型PTEN基因可使ZR-75-1细胞周期阻滞于G1期,并可抑制肿瘤细胞增殖。     

外源性APMCF1基因转染对人肝癌细胞系细胞生长和细胞周期的影响

目的：探讨外源性APMCF1基因对人肝癌细胞系（HHCC）细胞生长和细胞周期的影响. 方法： 将人全长APMCF1基因经脂质体包裹转染肝细胞肝癌HHCC细胞,经G418筛选获得转基因癌细胞克隆,采用半定量RT-PCR方法检测APMCF1的表达情况.通过单四唑（MTT）比色,绘制生长曲线,观察APMCF1基因对HHCC细胞生长的影响,流式细胞仪检测 HHCC细胞周期的变化. 结果：半定量RT-PCR结果显示,APMCF1基因被成功地转染至HHCC细胞.稳定表达外源性APMCF1基因的HHCC细胞生长速度明显慢于亲代细胞;细胞周期发生明显改变,G1期细胞比例明显增多,S期细胞比例明显减少. 结论： 外源性APMCF1基因对HHCC细胞生长和细胞周期有明显的抑制作用,可能是一个细胞周期调节基因.