外源基因在甲醇营养型酵母中的表达及优化表达策略

甲醇营养型酵母作为第二代酵母近年来在基因工程产品制备过程中得到以广泛应用，目前已成为独具特色的外源基因表达系统。外源基因在表达过程中受多种因素影响。本文外源基因在甲醇营养酵母中的表达，影响因素及优化外源蛋白表达方案等问题作一综合介绍。     

影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素

巴斯德毕赤酶母表达系统是广泛使用的真核表达系统,但有些蛋白在该系统中表达量低,甚至不表达。本文从外源基因的内部结构、宿主菌、信号肽、转化子的拷贝数和发酵条件五个方面综述影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素。     

气相色谱法检测甲醇酵母表达系统中发酵液中甲醇的含量

甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统,为基因表达系统使用得最多、最广泛。与以往的基因表达系统相比,它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。在以甲醇为诱导物的酵母表达系统中,对于甲醇含量的多少对酵母表达量有着决定性的作用。甲醇含量低表达量就小,反之,表达量过高会使酵母中毒,导致倒罐的情形。通常情况下很难以pH和DO来判断甲醇含量的是否过量或不足,如果能确切并实时地知道酵母表达系统中甲醇的含量,对于提高外源蛋白表达量起重要的作用。     

蝎毒镇痛活性肽基因BmK AngM1的密码子优化及其真核表达分析

密码子的偏爱性是影响基因异源表达的重要因素,通过对外源基因的密码子序列进行优化可提高其表达水平。为了获得蝎毒镇痛活性肽基因BmK AngM1在毕赤酵母中的高效表达,根据毕赤酵母密码子偏爱性,将BmK AngM1基因中的毕赤酵母低利用率密码子突变为其高利用率简并密码子,克隆到表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母,甲醇诱导表达;重组蛋白表达量测定结果显示,优化后的BmK AngM1基因在毕赤酵母中的表达水平是优化前的3.7倍。研究结果表明,密码子优化能显著提高BmK AngM1基因在毕赤酵母中的表达水平。     

不同甲醇流加策略对重组毕赤酵母发酵生产腺苷蛋氨酸的影响

目的考察了不同甲醇流加策略对重组毕赤酵母发酵生产腺苷蛋氨酸(SAMe)的影响.方法在发酵过程中改变甲醇浓度测定外源蛋白表达量.结果当补加甲醇的量为0.5%时,腺苷蛋氨酸表达量最高.结论通过合适的策略控制甲醇的流加可提高外源蛋白表达量.     

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统是一种新的真核基因表达系统 ,由于其有许多突出的优点 ,越来越受到分子生物学界的重视 ,已有多种重组蛋白在该系统成功表达。本文从表达菌株、表达载体、转化及整合、外源蛋白的表达及修饰等方面对其进行综述 ,并分析了影响毕赤酵母高效表达外源蛋白的因素。     

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统是一种新的真核基因表达系统，由于其有许多突出的优点，越来越受到分子生物学界的重视，已有多种重组蛋白在该系统成功表达。本文从表达菌株、表达载体、转化及整合、外源蛋白的表达及修饰等方面对其进行综述，并分析了影响毕赤酵母高效表达外源蛋白的因素。     

戊型肝炎病毒结构区OFR2基因在毕赤酵母中的分泌型表达

为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗，利用甲醇营养型酵母Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒（HEV）结构区ORF2 1．3kb基因。对构建的酵母分泌型表达载体pHIL-S1/HEV和pPIC9/HEV重组体，酶切线性化后转化入GS115酵母菌，经表型鉴定，PCR扩增筛选阳性克隆，对不同表型，不同表达载体的重组株用含甲醇的培养基诱导表达，ELISA及SDS－PAGE筛选表达活性菌株，Western-blot证实表达蛋白与HEVORF2单克隆抗体有特异性反应。得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株并初步优化表达条件。     

巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略

巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量,必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素.本文综述了应用该体系高效表达外源蛋白需考虑的策略.     

生物技术文摘

B35-10 表达于甲醇营养型巴斯德毕赤氏酵母中的重组雪花莲凝集素(GNA)的大规模生产和纯化Baumgartner P等[BiotechnolLett, 2003, 25: 1281]将雪花莲凝集素(GNA)的编码基因在甲醇营养型巴斯德毕赤氏酵母中进行表达并分泌出产物。筛选出巴斯德毕赤氏酵母的转化子并开发了一个在克级水平上生产和纯化重组GNA的工艺。在200L规模上,GNA的分泌浓度接近80mg/L,采用疏水色谱将GNA纯化至95%同质性。重组蛋白在结构和生物学活性方面与在植物中合成的蛋白相近。[袁 宁摘 朱春宝校]B35-11 从Citrobacter braakii分离和鉴定有改良特性…     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

温敏工程菌的表达与调控

基因工程的兴起使人们可以按照自己的意愿将特定的外源基因导入宿主(如大肠杆菌、酵母等系统),用以生产目的产物,是当今生物制品发展的方向.温敏工程菌就是将外源基因克隆入温敏质粒中,然后导入细菌内所建立起来的.通过温度的变化进行诱导,而将这一工程菌的生长和表达阶段分开,以利于工程菌的生长和外源基因的表达。本文介绍了温敏工程菌的来源、温控机制、培养和诱导等方法.并对在发酵过程中遇到的问题(诸如质粒丢失、比生长速率下降、醋酸生成后过多抑制生长、阻抑蛋白的灭活过程及诱导后降温处理等)进行了讨论,并探讨提高温敏工程菌表达量的途径.     

应用巴氏毕赤酵母表达基因工程药物的影响因素

巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris，Pp）表达体系是近年来刚发展起来的真核表达体系，其操作技术和酿酒酵母非常相似，相比而言Pp表达体系的应用还不够广泛，但这一体系已经显示出很好的优势和应用前景，已经成为目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一，广泛用于基因重组药物的表达。本文就采用这一表达体系表达外源蛋白所应考虑的因素进行综述。     

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体     

胞红蛋白酵母表达载体构建与表达纯化

胞红蛋白是脊椎动物珠蛋白超家族的一员,具有重要的生物学功能,已在大肠杆菌中成功表达。酵母表达系统作为常用的真核表达系统,具有外源蛋白表达蛋白量大且活性高等优点。该研究通过PCR扩增技术获得胞红蛋白编码基因并通过DNA重组技术构建并鉴定了胞红蛋白毕赤酵母分泌型表达载体CYGB-pGAPZαA。将重组载体经单酶切线性化后通过电转化法转入毕赤酵母GS115,利用梯度浓度的Zeocin抗生素和PCR技术筛选得到阳性转化子。工程菌经发酵培养后,发酵上清液经镍柱分离得到较高纯度的目的蛋白,并经电泳等方法验证鉴定。     

Exendin-4真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建Exendin-4基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得Exendin-4奠定基础。方法:采用重叠聚合酶链反应法扩增出Exendin-4的完整序列,将其亚克隆到表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-Exendin-4。重组质粒经SacI线性化后用电穿孔法导入到GS115中,经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,甲醇诱导表达后用凝胶电泳法分析Exendin-4的表达。结果:序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达载体,电泳结果证明Exendin-4在毕赤酵母中能高效表达。结论:实现了Exendin-4单体在毕赤酵母中的表达,为Exendin-4的规模化生产奠定了基础。     

戊型肝炎病毒（HEV）开读框架2（ORF2）1．3kb基因片段在甲基营养型酵母（Pi

戊型肝炎病毒（HEV）整个基因组有3个开放性阅读框架（ORFs)，ORF2是主要结构基因编码区，将戊型肝炎病毒（HEV）ORF21．3kb基因定向亚克隆到甲基营养型酵母－巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris)分泌性表达质粒pHIL-S1和pPIC9中，转化入大肠杆菌，筛选出阳性重组株，重组质粒pPIC9HEV和pHILS1HEV分别经限制性内切酶Sal I和Bg1 II线化，电转化入巴斯德毕赤酵母GS115。与宿主GS115染色体发生整合，整合方式不同，产生两种表型，分别为HIS＋MUT＋）甲醇诱导快的，HIS＋MUTS（甲醇诱导慢的），通过营养缺陷性选择性培养基筛选出阳性菌株，经PCR技术确认外源基因整合在酵母染色体中，重组菌株先在甘油培养基中充分增殖，然后转移到甲醇培养基中诱导，取上清液，用ELIAA，SDS－PAGE，Western-blot检测到特异性HEVORF2蛋白，得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株。     

人可溶性血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体Flt-1基因在甲醇酵母中的克隆表达

应用RT－PCR技术，从人脐静脉内皮细胞中扩增出编码Flt-1，胞外区前四个结构域的基因片段，将Flt-1基因片段连接到表达载体PIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-F，将重组质粒转化到甲醇酵母Pichia pastoris GS115中，得到基因工程菌株P.pastoris(pPIC9K-F)，对培养上清进行SDS－PAGE和Western blot分析。结果显示在74.2ku处有阳性条带出现，表明sFLT-1在甲醇酵母中获得了成功表达。受体配基结合实际显示表达产物与VEGF可特异性结合，表明其具有配基结合生物活性。     

改造的sTRAIL基因在重组毕赤氏酵母菌中的表达及活性分析

利用甲醇毕赤氏酵母系统对改造的TRAIL基因进行优化表达研究及产物活性分析,确定改造后的基因表达量是否提高。应用电转化技术将4种重组表达载体转化毕赤氏酵母菌GS115,经Zeocin抗生素筛选、PCR检测获得阳性酵母工程菌,采用摇瓶发酵及SDS-PAGE进行高效表达菌株的筛选,经CM-柱层析、Western blot及MTT法对重组蛋白进行初步纯化、抗原活性检测和生物学活性分析,确定了最佳摇瓶发酵条件:培养基最适pH值5.5~6.5,最佳甲醇诱导浓度为1%,最适甲醇诱导周期为96h。筛选到高效表达菌株pPICZα-A-sTRAIL/GS115、pPICZα-A-sTRAILK/GS115、pPICZα-A-sTRAILA/GS115、pPICZα-A-sTRAILAK/GS115,其表达量分别达到67,113.4,98,145mg/L,改造后的TRAIL具有抗原活性和生物学活性。对TRAIL基因的改造可以提高其在甲醇毕赤氏酵母系统中的表达。     

巴斯德毕赤酵母真核蛋白表达系统的研究进展

自 1 98 1年 hitzeman等 [1 ] 首次在酿酒酵母中表达了人重组干扰素基因后 ,相继又有多种外源基因表达成功。但是常规的酿酒酵母表达系统由于发酵密度不高 ,蛋白分泌能力较差 ,糖基化修饰过度可能会引起副反应等 ,近年来已被新的酵母宿主细胞所取代 ,如巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维亚酵母、粟酒裂殖糖酵母、烷烃利用型耶鲁酵母、西方许旺氏酵母和多形汉逊酵母等 ,合称非常规酵母表达系统。它们往往具有营养要求简单、生长旺盛、生物量大、温度适应范围广 (2 5℃～ 4 6℃ )、蛋白质分泌能力强等特点 ,正好补充了酿酒酵母的不足。其中的巴斯德…