骨髓基质干细胞分化来源肝细胞移植的细胞准备及组织学观察

目的 探讨大鼠骨髓基质干细胞向肝细胞分化后体外标记方法及移植肝细胞的肝内组织学表现。方法 分离大鼠骨髓基质细胞，在体外诱导分化为成熟肝细胞。将5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入后的肝细胞移植入已行部分肝切除大鼠体内，分别应用免疫组织化学和免疫荧光方法观察受体肝脏内移植细胞的形态和功能。结果分化成熟肝细胞在BrdU掺入培养后细胞核染色可见特异性棕褐色标记；肝细胞移植后肝组织切片BrdU染色可定位移植细胞；白蛋白抗体染色显示移植细胞具有功能活性。结论 骨髓基质干细胞分化来源的肝细胞移植后形态功能稳定，是进行肝细胞移植的理想细胞来源。     

肝细胞生长因子诱导人骨髓来源的多能成体祖细胞向肝样细胞分化的实验研究

作为骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的亚群细胞多能成体祖细胞（MAPCs）,由于其取材方便,可以来自病人自身,无排斥反应,具有重要的临床应用价值.本实验即在成功分离并培养人骨髓源MAPCs（hMAPCs）的基础上,用肝细胞生长因子（HGF）诱导其向肝细胞方向分化,并采用不同方法鉴定细胞分化能力,试图为生物人工肝及肝细胞移植等找到新的种子细胞来源.     

分离大白鼠肝细胞的低温储存研究

采用Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ离体肝门静脉循环灌注的方法制备分离的大白鼠肝细胞，游离的肝细胞储存于４℃低温的Ｌ－１５和ＵＷ液中２４小时和４８小时，通过ＴＢ染色排除试验，细胞形态学观察，乳酸脱氢酶漏出率的测定和肝细胞膜电位的测定来分析比较低温储存后的肝细胞与新分离的肝细胞活力的变化。结果表明：肝细胞在ＵＷ液中低温储存４８小时，其存活率为８０．８％±５．６％，说明ＵＷ储存液对肝细胞有着显著的保护作用。     

成人骨髓干细胞向肾实质细胞分化的研究进展

干细胞是指具有高度增殖和自我更新能力,并可以分化成为两种以上不同类型组织细胞的细胞。近期的研究表明,成人干细胞可以诱导产生超越自己胚层界限的其他胚层来源细胞。如：骨、软骨、肺实质、肌肉、肝脏细胞等。本文就其向肾实质细胞分化的相关研究进展综述如下。     

一种肝细胞移植的新来源--骨髓干细胞可塑性的应用研究(文献综述)

逐步替代或重建受损的肝组织结构是肝细胞移植治疗肝病的最终目的.骨髓干细胞可以演变成为与其组织发育或再生来源无关的细胞类型,即骨髓干细胞的可塑性(plasricity).骨髓干细胞分化为肝实质细胞的发现提示它可能参与了体内肝组织细胞的再生、及损伤的修复与替代,而这一进程与肝细胞移植的作用机制类似,本文就近年来的有关研究进行综述.     

脂肪来源与骨髓来源的基质干细胞的比较

目的 比较脂肪基质干细胞（ASC）与骨髓基质干细胞（MSC），为ASC的细胞移植治疗提供实验依据。方法 分离培养脂肪组织来源的ASC、分离培养骨髓组织来源的MSC，培养至14d时，对贴壁细胞再次计数，当细胞融合达到80％时，胰蛋白酶消化传代培养，取第3～4代细胞进行分析。观察培养前后两种细胞的形态并计数，流式细胞仪分析两种细胞的表面抗原表达，混合淋巴细胞反应及淋巴细胞转化实验比较两种细胞的免疫原性。结果 ASC与MSC细胞表面抗原表达基本相似，但也存在差别，ASC为CD49d^＋CD106^-，而MSC为CD49d^-CD106^＋。ASC与MSC都能抑制淋巴细胞增殖，且这种抑制作用与其数量呈正相关。但相同数量的ASC和MSC对淋巴细胞的抑制作用无明显差别。结论 ASC和MSC在细胞表面抗原、免疫原性等方面相似，这为进一步利用ASC移植治疗疾病的研究提供了依据。     

肝细胞生长因子对骨髓基质干细胞与纤维连接蛋白涂层黏附行为的影响

目的 观察肝细胞生长因子（HGF）对骨髓基质干细胞与纤维连接蛋白涂层黏附行为的影响。方法 将不同浓度的肝细胞生长因子加入预涂纤维连接蛋白的96孔板，观察细胞的黏附特性、增殖活性及形态学改变。结果 在肝细胞生长因子的诱导下，骨髓基质干细胞在纤维连接蛋白预包被的96孔板底分布均匀，多呈纤维母细胞样外观；肝细胞生长因子诱导的骨髓基质干细胞对纤维连接蛋白的黏附性是一种剂量-依赖性方式，50％的有效剂量（ED50）大约是20μg／L，当达到最大黏附力时剂量为100μg／L；与空白对照组相比，50～200μg／L的肝细胞生长因子能促进骨髓基质干细胞的增殖，其中以50μg／L组细胞增殖活性最强（P〈0．05）。结论 在最适浓度下，肝细胞生长因子能显著提高骨髓基质干细胞与纤维连接蛋白涂层的黏附行为。     

小鼠骨髓干细胞向肝细胞转化的体外实验研究

目的建立以30 ng/ml FGF-4和30 ng/ml OSM为主的诱导培养体系,研究体外骨髓干细胞向肝细胞的转化过程中细胞形态、结构、功能的变化.方法建立以30ng/ml FGF,30ng/mlOSM为主的小鼠骨髓干细胞诱导培养体系.观察细胞形态和数量的变化;RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色检测肝细胞特异性标记物的表达;通过PAS糖原染色、白蛋白ELISA、尿素合成试验,检测细胞的合成和代谢功能.结果诱导12 d,观察到多极性的肝细胞样细胞,且逐渐增多、集落不断增大.在诱导过程中,不同的时间点可以分别检测到HNF-3βmRNA、ALBmRNA、CK18mRNA、TTRmRNA、G6-PasemRNA和TATmRNA的表达.诱导21 d,细胞表达HNF-3β、ALB、CK18蛋白;免疫荧光定位示ALB表达于胞浆和胞膜,而CK18表达于胞浆.诱导21 d,细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒;在诱导过程中,不同的时间点检测到细胞分泌ALB、合成尿素的量的变化.结论我们建立的以30ng/ml FGF、30 ng/ml OSM为主的诱导培养体系,可以有效地促进骨髓干细胞体外定向转化为肝细胞.     

人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中白蛋白的表达研究

目的观察在体外诱导人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中自蛋白的表达特征。方法从手术切除弃置的人肋骨骨髓中分离基质细胞,在含有肝细胞生长因子(HGF)、淋巴细胞抑制因子(UF)、纤维母细胞生长因子(FGF)等条件培养基中培养细胞。应用免疫荧光方法在共聚焦显微镜下观察肝细胞特异性白蛋白染色;同时,于诱导培养后多时间点测定培养细胞产生的白蛋白水平。结果人骨髓来源的基质干细胞在条件培养基中经诱导后,分化为成熟附壁细胞;细胞胞浆内肝细胞特异性标志物白蛋白呈阳性染色;已分化细胞合成并分泌白蛋白,其表达水平随细胞分化显示时间依赖性变化特征。结论人骨髓基质干细胞经诱导培养后可向成熟肝细胞分化并具有合成和分泌白蛋白功能,可以作为临床肝细胞移植及生物人工肝等治疗终末期肝病的重要肝细胞来源。     

基于肝切除手术来源的成人肝细胞移植的临床应用

目的探讨成人肝细胞移植治疗肝衰竭的临床效果。方法从良性病变的外科肝切除组织中获取有活性的成人肝细胞,对2例肝衰竭患者采用股动脉插管介入法行脾脏内移植。结果2例患者在治疗后病情均得到一定程度的缓解,临床症状和生化指标明显改善,其肝功能有一定程度的恢复,但例1术后第3 d胆红素上升,术后第4 d出现肝昏迷而自动出院;例2于术后1周黄疸指数再次升高,术后40 d死亡。结论成人肝细胞脾脏内移植治疗肝衰竭,技术上安全可行,且具有一定临床疗效;如何增强移植后肝细胞的数量和功能将是维持受体肝功能持续改善的关键。     

冠心病病人骨髓间充质干细胞的生物学特征评价

目的　确立胸骨骨髓间充质干细胞分离和培养的方法 ,评价其生物学特征。方法　骨髓取自行冠状动脉旁路移植术的冠心病病人胸骨切口 ,用Percoll液分离骨髓MSCs,体外培养扩增 ,观察细胞生长特性 ,流式细胞仪检测骨髓MSCs表型特征、细胞周期。结果　贴壁的骨髓MSCs多数呈梭形。骨髓MSCs能连续传 15代以上 ,但是第 5代以后或老年病人的细胞增殖速度减慢。骨髓MSCs的表型特征为CD2 9、CD4 4阳性 ,CD34、CD4 5阴性。多数骨髓MSCs在细胞周期的G0 /G1期。结论　冠心病病人手术时从胸骨切口取骨髓并分离培养骨髓MSCs的方法可行 ,骨髓MSCs具有较好的增殖更新潜能 ,是细胞心肌成形术中理想的细胞来源。     

不同移植途径对大鼠骨髓干细胞迁移至肝脏及分化的影响

目的 探讨门静脉、尾静脉和肝动脉3种移植途径下大鼠骨髓干细胞迁移至肝脏及向肝细胞分化的情况.方法 取30只正常SD大鼠,采用2-乙酰氨基芴和四氯化碳溶液灌胃,制成急性肝损伤模型,取其骨髓,以淋巴细胞分离液分离出干细胞,再用荧光染料(PKH26)进行标记.将此30只急性肝损伤大鼠分为3组,每组10只,门静脉输注组大鼠麻醉后,取腹部正中切口,经门静脉注入自体骨髓干细胞悬液0.4 ml(4×106个,下同);尾静脉输注组大鼠经尾静脉注人自体骨髓干细胞悬液0.4 ml;肝动脉输注组大鼠麻醉后,取腹部正中切口,将胃十二指肠动脉远端结扎,用动脉夹阻断肝总动脉血流,迅速在胃十二指肠动脉结扎点前方进针,注入自体骨髓干细胞悬液0.4 ml.骨髓干细胞移植后2周,取各组肝脏组织,制成冰冻切片,再以用异硫氰基荧光素标记的抗体进行免疫组织化学染色,检测其PKH26标记阳性细胞以及自蛋白和CK18的表达情况.结果 各组大鼠肝脏切片中均可见散在的PKH26染色阳性的红色荧光,门静脉输注组、尾静脉输注组及肝动脉输注组PKH26染色阳性细胞数分别为(58.0±2.67)个、(57.8±3.04)个及(58.3±3.52)个,三组间的差异无统计学意K(P>0.05).各组肝组织切片均广泛表达白蛋白及CK18(绿色荧光),荧光显微镜下可见同时发绿色荧光和红色荧光的细胞(绿色荧光与红色荧光相叠加而成的黄色荧光).结论 经门静脉、尾静脉和肝动脉注入的骨髓干细胞均能定植于肝脏,并在损伤的肝脏中分化为肝细胞,3种途径的效果相当.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

Renal repair: role of bone marrow stem cells

Acute kidney injury carries severe consequences and has limited treatment options. Bone marrow stem cells may offer the potential for treatment of acute kidney injury. The purpose of this review is twofold. The first purpose is to provide a concise overview of the biology of bone marrow stem cells, including hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells, for clinical nephrologists and renal researchers. The second purpose is to summarize published data regarding the role of bone marrow stem cells in renal repair after acute kidney injury. Currently, much of our knowledge of renal protective effect of bone marrow stem cells is obtained through animal research. Our goal is to understand the mechanism of renal protection by bone marrow stem cells and to develop strategies utilizing these stem cells for the eventual treatment of humans with kidney disease.     

人肝细胞生长因子基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞系的构建

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞系(MSCs).方法 采用脂质体法将hHGF基因慢病毒载体质粒(lenti-hHGF)转染至293FT细胞,收集病毒上清液感染大鼠MSCs细胞,经过G418筛选得到稳定分泌hHGF的MSCs细胞株(hHGF-MSCs细胞).以转染空载体细胞(eGFP-MSCs)、未转染慢病毒载体的MSCs细胞作为对照.采用免疫印迹法检测hHGF的表达.hHGF-MSCs细胞分别加入成骨诱导剂或成脂诱导剂培养,分别采用茜素红染色和油红O染色鉴定成骨细胞和脂肪细胞表型.结果 与未转染慢病毒载体的MSCs细胞和eGFP-MSCs细胞比较,hHGF-MSCs细胞hHGF表达上调(P＜0.01).hHGF-MSCs细胞体外诱导培养后具有明显的成骨和成脂表型,可向成骨细胞和脂肪细胞分化.结论 成功构建hHGF基因修饰大鼠MSCs.     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MsCs)定向分化为心肌细胞的可行性，建立一种以干细胞移植为主治疗心肌梗死的治疗策略。方法利用Percoll分离骨髓细胞培养获得MsCs；用5-氮杂胞苷(0．1、1、5、10、50和100μmol/L)定向诱导24h，分别在诱导培养的第14d和21d，检测细胞中的α-横纹肌肌动蛋白表达。将培养的MSCs，移植于急性梗死心肌组织内，4周后进行组织学和免疫组织化学染色，并用超声检测室壁运动和心功能改变。结果骨髓间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导，培养21d后，5和10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导后的MSCs有一部分细胞表达α-横纹肌肌动蛋白，并一些细胞自发性跳动；细胞移植4周后，在缺血心肌有一部分MSCs与宿主心肌细胞形成连接并分化为具有典型的肌小节和表达α-横纹肌肌动蛋白阳性的心肌细胞。结论MsCs可以分化成心肌细胞。     

正常成人和非霍奇金淋巴瘤患者的骨髓间充质干细胞生物学特性的比较

目的比较研究非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者和正常成人的骨髓间充质干细胞(MSCs)的生物学特性及分化能力,为临床细胞移植提供实验依据。方法获取并分离正常成人和NHL患者的骨髓MSCs,用低血清培养液培养、传代,观察MSCs的形态和生长特性,以流式细胞仪检测其免疫表型和细胞周期,体外诱导MSCs向脂肪和骨分化,行MSCs的染色体分析,电镜观察其超微结构。结果正常成人和NHL患者的骨髓MSCs具有相似的细胞形态、生长特性和免疫表型,而且都可以向骨和脂肪分化;NHL来源的MSCs具有正常的核型和超微结构,超过90%的细胞处于静止期,未发现肿瘤细胞的特征性结构。结论从NHL患者骨髓中获取的MSCs经培养传代,与正常成人骨髓MSCs一样,具有在体外大量扩增并保持低分化状态和多向分化的能力。     

肝细胞生长因子联合成纤维细胞生长因子-4诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究

目的探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）联合成纤维细胞生长因子4（fibroblast growth factor-4，FGF4）诱导人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，HMSCs）向肝细胞方向分化的能力。方法分别用HGF、FGF4、HGF＋FGF4诱导HMSCs分化为肝样细胞。在不同分化阶段用免疫细胞化学染色法检测甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）；免疫荧光细胞化学染色法检测AFP、白蛋白（albumin，ALB）的表达；RT—PCR检测AFP和ALB mRNA表达的情况。结果HMSCs经诱导向肝样细胞转化。免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达，图像分析表明HGF＋FGF4联合诱导分化的AFP、CK18阳性率最高，HGF次之，FGF4则较弱；免疫荧光细胞化学染色发现各诱导组AFP、ALB均为阳性表达；各诱导组RT—PCR均可检测出AFP和ALBmRNA的表达，而阴性对照组则没有表达。结论HGF、FGF4、HGF＋FGF4均能诱导HMSCs分化为肝样细胞，分化的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18等。以HGF＋FGF4诱导HMSCs分化为肝样细胞的阳性率最高。