胎儿毛乳头细胞分化为类成骨细胞的实验研究

目的 研究胎儿毛乳头细胞的体外成骨能力，为骨组织工程提供一种新的种子细胞。方法 Ⅰ型胶原酶消化法分离毛乳头，常规成纤维细胞培养液培养毛乳头细胞。第3代和第7代细胞经成骨诱导液诱导培养7d，以免疫荧光、Von Kossa等方法鉴定毛乳头细胞及检测细胞的成骨特性。结果 培养的毛乳头细胞呈聚集性生长，表达平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原。经成骨诱导后表达骨桥蛋白，有钙结节形成。结论 毛乳头细胞具有成骨活性，可作为骨组织工程的种子细胞。     

皮肤源祖细胞的培养、鉴定和体外诱导分化

目的探讨皮肤源祖细胞的体外培养、鉴定及定向诱导成脂、成骨的方法，为组织工程提供较理想的种子细胞。方法出生1～3d的sD大鼠幼鼠皮肤，以含表皮生长因子和成纤维细胞生长因子的培养基进行培养。观察细胞生长情况，描绘生长曲线；免疫荧光鉴定细胞表达Nestin和Fibronectin情况；将第3代细胞，分别用成脂和成骨诱导液培养14d，以油红O染色、茜素红染色和免疫荧光检测皮肤源祖细胞诱导成脂、成骨情况。结果细胞呈悬浮生长，迅速增殖形成克隆球团；细胞免疫荧光表达Nestin和Fibronectin；成脂诱导14d后，细胞内大量致密颗粒形成，油红O染色可见红色脂滴；成骨诱导14d后，茜素红染色可见暗红色钙盐沉积，骨桥蛋白表达阳性显示成骨细胞形成。结论皮肤源祖细胞具有干细胞的特性，能分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究

目的体外分离培养兔脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）,在成骨诱导条件下鉴定其成骨活性。方法取4月龄新西兰大白兔腹股沟区脂肪,Ⅰ型胶原酶消化,分离、培养及传代原细胞,将第3代ADSCs消化后,加入成骨培养液中诱导分化,分别行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、VonKoss（a钙结节）染色,以鉴定分化结果。结果体外分离培养的细胞增殖活跃,成骨诱导后碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Von Kossa染色均呈阳性表达。结论脂肪干细胞具有成骨分化能力,是一种理想的骨组织工程种子细胞。     

大鼠脂肪干细胞体外诱导成平滑肌样细胞的研究

目的:研究大鼠脂肪干细胞(ADSCs)体外单层培养条件下诱导分化为平滑肌样细胞的可行性。方法:从SD大鼠的腹股沟脂肪垫分离获取脂肪干细胞,测定其生长曲线。取第4代细胞用成脂诱导液诱导分化,并用油红O染色鉴定。取第4代细胞用成骨诱导液诱导分化,并用Von Kossa染色鉴定。取第4代细胞用含有β-巯基乙醇的成平滑肌诱导液诱导,并用免疫组化的方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果:脂肪干细胞成梭形和多角形,体外生长迅速,生长曲线表明传代2 d后细胞进入对数生长期。第4代细胞成脂诱导后,油红O染色证实细胞内存在脂滴;成骨诱导后,Von Kossa染色证实有矿化结节。脂肪干细胞诱导平滑肌样细胞免疫组化结果,β-巯基乙醇诱导组和未诱导组细胞α-SMA的表达阳性率分别为(29.80±6.89)%、(2.89±1.24)%。诱导组细胞α-SMA的表达阳性率高于未诱导组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:脂肪干细胞经诱导后出现明显的平滑肌细胞特征,可成为平滑肌相关疾病在组织工程研究上新的种子细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定

目的探讨将成人骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的方法,并对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定. 方法分离人骨髓,梯度离心并结合全骨髓法进行培养,培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠及抗坏血酸.贴壁细胞传代,取第3代细胞鉴定其成骨特性;在倒置相差显微镜下观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原表达,原位杂交检测骨连接素(ON)、骨桥素(OP)表达,Von Kossa 染色检测钙结节形成. 结果第3代人MSCs呈典型的成骨细胞形态,可连续传代10次;ALP染色阳性率达85%;Ⅰ型胶原、ON和OP表达阳性;Von Kossa 染色可见钙结节形成. 结论成功地将人MSCs诱导分化为成骨细胞,所诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性.     

狗骨髓基质细胞的体外诱导成骨潜能研究

目的：观察狗骨髓基质细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法：采用成年狗双侧髂骨取材进行骨髓基质细胞培养，应用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法观察细胞增殖；以对硝基苯磷酸盐法及骨钙素含量放免测定法测定碱性磷酸酶活性及骨钙素含量；用Von Kossa染色法观察矿化结节；用间接免疫荧光染色法测定Ⅰ型胶原。观察在培养液中添加地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠条件下骨髓基质细胞生长及成骨分化情况。结果：骨髓基质细胞呈成纤维样表现，增殖力强。诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素含量明显增高，Ⅰ型胶原表达增多，10～12d达到高峰，并出现矿化结节。结论：狗骨髓基质细胞在本实验条件下，成骨能力肯定，增殖能力强，可作为骨组织工程的种子细胞。     

人骨膜细胞生物学特性的实验研究

目的 探讨人骨膜细胞体外培养的生物学特性. 方法 以胫骨骨膜组织为材料,采用组织块法分离细胞,完全培养基培养,通过倒置显微镜观察细胞形态学,锥虫蓝染色计数法检侧细胞增殖能力;流式细胞学分析细胞表面抗原.随机分为3组,成骨实验组和成软骨实验组分别加入不同的定向培养剂,对照组加入完全培养基,采用碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色检测各组细胞的成骨和成软骨分化指标. 结果 骨膜细胞在体外培养条件下呈贴壁生长,细胞生长曲线证实骨膜细胞传至第9代仍保持良好的增殖能力,流式细胞仪检测证实细胞表面抗原CD90及CD105呈阳性;组织化学染色检测证实成骨实验组分化后细胞碱性磷酸酶及钙结节呈阳性,成软骨实验组分化后细胞蛋白聚糖及Ⅱ型胶原呈阳性,对照组各项指标均生阴性.结论 骨膜细胞体外培养细胞增殖能力强,具有间充质干细胞的特性和良好的成骨和成软骨分化潜能,其定向诱导分化的成骨细胞和软骨细胞均具有各自明显的细胞功能表达.     

自体富血小板血浆诱导兔脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]体外分离、培养、鉴定兔脂肪干细胞,探讨富血小板血浆体外诱导脂肪干细胞成软骨分化潜能。[方法]取Ⅰ型胶原酶消化兔脂肪后,贴壁法分离培养脂肪干细胞,取第3代细胞分别予以成脂、成骨诱导,证实其多向分化潜能;同时取第3代细胞予以富血小板血浆诱导,2周后倒置显微镜观察细胞形态,行Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。[结果]可以从兔脂肪中培养出脂肪干细胞,成脂、成骨诱导证实其多向分化潜能。经自体富血小板血浆诱导的脂肪干细胞,其Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。实时荧光定量PCR检测发现经自体富血小板血浆诱导的兔脂肪干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于对照组未经诱导的兔脂肪干细胞(P<0.01)。[结论]自体富血小板血浆可以有效诱导兔脂肪干细胞表达II型胶原和蛋白聚糖,可以诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞方向分化。     

软骨寡聚基质蛋白对BMP 2诱导骨髓间质干细胞分化的影响

 目的 探讨过表达软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein,COMP）对BMP-2诱导骨髓间质干细胞成骨及成软骨分化的影响。方法 用BMP-2诱导骨髓间质干细胞分化,通过脂质体转染含人COMP基因的质粒使骨髓间质干细胞过表达COMP,空载质粒作为对照。以RT-PCR检测成骨相关基因Ⅰ型胶原、RUNX2、骨桥蛋白、骨钙蛋白以及成软骨相关基因Ⅱ型胶原、SOX9、蛋白聚糖的表达变化;通过碱性磷酸酶染色观察成骨过程中的碱性磷酸酶活性,茜素红染色观察成骨终末阶段矿化结节的生成情况,阿利新蓝染色观察细胞基质蛋白多糖的合成情况。结果 COMP组目的基因COMP mRNA的表达显著升高;骨桥蛋白mRNA表达水平较对照组低,呈现出一致的下调趋势（P<0.05）;Ⅰ型胶原、RUNX2、骨钙蛋白mRNA表达水平在诱导早期均高于对照组（P<0.05）,但在诱导晚期均明显低于对照组（P<0.05）;成软骨指标（Ⅱ型胶原、SOX9、蛋白聚糖）的基因表达水平强于对照组,呈一致的上调趋势（P<0.05）;SOX9 mRNA表达水平高于对照组,仅在第7天时差异具有统计学意义（P<0.05）;细胞成骨染色（碱性磷酸酶染色、茜素红染色）均弱于对照组,而阿利新蓝染色强于对照组。结论 COMP能抑制BMP-2诱导骨髓间质干细胞成骨分化,促进BMP-2诱导骨髓间质干细胞成软骨分化。     

大鼠脂肪组织来源干细胞的分离、培养和生物学特性的研究

目的：建立一种分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法，并探讨获得的脂肪干细胞的部分生物学特性。方法：取SD大鼠腹股沟处的皮下脂肪，Ⅰ型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞，接种至含10％胎牛血清的DMEM培养液，培养并适时传代，每日在倒置显微镜下观察记录细胞形态和增殖特征，测定其生长曲线，进行冻存复苏实验。第3代细胞使用成骨诱导液诱导其向成骨细胞分化，进行Von Kossa染色；使用成脂诱导液诱导其向成脂细胞分化，进行油红O染色。结果：从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞，其在体外生长增殖迅速，呈成纤维样细胞生长。生长曲线表明第3代脂肪干细胞增殖能力最强，可以在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下，表现出成骨细胞特性，Von Kossa染色出现矿化结节；在IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）、吲哚美辛、胰岛素的诱导下，表现出脂肪细胞特性，油红O染色后发现胞浆内有脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存1个月后，其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低。结论：成功建立了一种简单有效的分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法，获得的脂肪干细胞生长增殖旺盛，具有多向分化能力，可以方便地保存，有望作为细胞治疗和组织工程的种子细胞。在分离大鼠的脂肪干细胞时，NH4Cl裂解红细胞这一步可以省略，地塞米松在成脂诱导过程中不是必需的。     

肿瘤干细胞与肝癌干细胞

肿瘤起源于干细胞的假说正在各种人类肿瘤中得到证实,肿瘤不单是一种基因病,而且是一种干细胞病,基因突变作用于干细胞,干细胞突变成为肿瘤干细胞,这是肿瘤发生、再生、转移和复发的关键。肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中是否存在“肝癌干细胞”的问题一直倍受人们关注。该文介绍肿瘤干细胞与肝癌干细胞的研究情况。     

间充质干细胞及其作用的研究新进展

间充质干细胞(MSCs)可以成功地从所有哺乳动物组织细胞内分离出来,它的多向分化潜能在再生医学中有很大应用潜力.随着对MSCs的生物学特征、MSCs与其周围内环境之间的相互作用、MSCs归巢的分子调节机制及多向分化能力的深入研究,MSCs将作为细胞修复或外源性基因转染和表达的载体在临床试验中发挥重要作用.     

Characterization of Two Monoclonal Antibodies Raised Against Human Testicular Cells/Charakterisierung von zwei monoklonalen Antikörpern gegen menschliche Hodenzellen

Summary: Human testicular cells isolated from biopsy tissue were used for generation of monoclonal antibodies. Two hybridoma supernatants C3 and D4 were selected according to their reaction with sperm-precursor cells (immature sperms) in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). C3 reacted with testicular but no other tissue. D4 did not reveal any pattern of testicular staining in spite of its similarity to C3 in binding to sperm-precursor cells in ELISA and microcytotoxicity test.
Zusammenfassung: Für die Bildung von monoklonalen Antikörpern wurden menschliche Keimzellen verwendet, die aus dem Gewebe von Hodenbiopsien stammten. Zwei Hybridom-Überstand-Lösungen, C3 und D4, wurden hinsichtlich ihrer Reaktion mit Spermatozoen-Precursorzellen (unreife Spermatozoen) in einem ELISA-Test selektiert. C3 reagierte mit Hoden-, aber nicht mit anderem Gewebe. D4 deckte keine weiteren Muster in der Hodenfärbung auf, ungeachtet der Ähnlichkeit zu C3 hinsichtlich der Bindung der Spermatozoen-Precursorzellen an ELISA und an den Mikrocytotoxizitätstest.     

热损伤与碱性成纤维细胞生长因子联合处理诱导表皮细胞去分化的实验研究

目的：体外建立表皮细胞去分化模型,为深入阐明表皮细胞去分化过程奠定基础。方法：离体条件下选择热损伤与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为联合诱导因素处理成熟表皮细胞。通过Giemsa染色和电镜观察细胞形态的改变;通过细胞培养和滋养层培养体系观察细胞的增殖能力,包括克隆形成和复层生长情况;采用器官培养体系体外构建三维皮肤,观察细胞再分化形成表皮情况;应用基因芯片技术观察细胞基因表达的改变。结果：经联合诱导后,细胞形态发生改变,表现为体积减小,细胞器数目减少,核浆比增大。增殖和再分化能力的改变体现在诱导后的表皮细胞能形成克隆,在滋养层培养条件下可以形成复层生长,并能够在体外构建出包括基底层和基底上层在内的表皮结构。基因水平的改变表现为与角质化相关基因下调和与有丝分裂相关基因上调。结论：在热损伤与bFGF联合诱导下,已分化的表皮细胞会发生形态、功能和基因表达的改变,表现为干细胞的特性。     

Cell proliferation studies in the rat prostate: II. The effects of castration and androgen-induced regeneration upon basal and secretory cell proliferation

The changes over short and prolonged periods (up to three months) after castration on the proliferative activity of basal and secretory epithelial cells in the rat prostate were studied. Although castration induced widespread apoptosis of the secretory cells, no compensatory hyperplasia of the basal cells in response to this was noted. Instead, observations of the cell kinetics and ultrastructure suggested that both the basal and secretory cells entered a quiescent state as a result of castration. The proliferative potential of secretory cells was not diminished up to three months after castration. During androgen-induced regeneration of the prostate the pattern of basal and secretory cell proliferation was found to be similar to that observed during normal growth, although it was more rapid and of shorter duration.     

微波消融联合树突状细胞瘤内注射对荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群的影响

目的 观察微波消融联合树突状细胞(DC)瘤内注射对荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群的影响.方法 建立BALB/C小鼠皮下骨髓瘤模型,分为对照组、微波消融组、微波消融联合不成熟DC组、微波消融联合成熟DC组,分别于微波消融后第1、3、5、7、9及11天采用流式细胞仪检测各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群.结果 对照组小鼠的CD3~+、CD4~+及CD4~+/CD8~+值逐渐下降(P<0.05);微波消融组小鼠的CD3~+、CD4~+及CD4~+/CD8~+无明显改变(P>0.05);微波消融联合不成熟DC组小鼠的CD3~+、CD4~+及CD4~+/CD8~+在术后第3、5、7天明显减低(P<0.05),第9、11天恢复;微波消融联合成熟DC组小鼠CD3~+、CD4~+及CD4~+/CD8~+则在术后第3、5、7天明显增高(P<0.05),第9、11天下降.结论 微波消融联合成熟DC在一定时间内(约1周)能够增强实验小鼠的抗肿瘤免疫反应.     

Germline-competent stem cell in avian species and its application

Germ cells are the only cell type in the body that can transfer genetic information to the next generation. Germline-competent stem cells can self-renew and contribute to the germ cell lineage giving rise to pluripotent stem cells under specific conditions. Hence far, studies on germline-competent stem cells have contributed to the generation of avian model systems and the conservation of avian genetic resources. In this review, we focus on previous studies on germline-competent stem cells from avian species, mainly chicken germline-competent stem cells, which have been well established and characterized. We discuss different sources of germline-competent stem cells and recent advances for the future applications in birds.