结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段;通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c,经序列测定证实正确,双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT,转化入大肠杆菌DH5α中,再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c,转化入大肠杆菌DH5α中,经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析,在80 kD处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23.7%。该融合蛋白以包涵体的形式存在,用Ni²⁺-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1446c、Rv2145c、Rv2971、Rv0491基因的克隆表达研究

目的在大肠杆菌中高效表达结核分枝杆菌Rv1446c、Rv2145c、Rv2971、Rv0491的蛋白。方法通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增Rv1446c、Rv2145c、Rv2971、Rv0491基因,以质粒pET28a为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)。以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定rRv1446c、rRv2145c、rRv2971、rRv0491在大肠杆菌中的表达。经质谱仪测定重组蛋白的分子量。结果与结论4个重组蛋白成功在大肠杆菌中表达,分子量实测值与理论相近。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的 克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达.方法 采用热启动聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白.结果 经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0.6,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22.8%.结论 构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性和克隆表达

目的鉴定结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性,克隆表达该基因并获得其重组蛋白。方法设计Rv1512基因的特异性引物,并鉴定其特异性。构建pET30a（＋）：Rv1512重组质粒,阳性克隆转化入大肠杆菌BL21。经Ni＋-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定该蛋白及其纯度。结果结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性被证实;经测序分析证实Rv1512原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE结果显示在40 kD处呈现单一蛋白条带。结论结核分枝杆菌Rv1512基因具有较好的特异性;成功构建表达载体pET30a（＋）：Rv1512并获得重组蛋白,为辅助诊断结核分枝杆菌的感染奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv0824c基因编码蛋白的生物信息学分析

目的 采用生物信息学方法分析结核分枝杆菌的Rv0824c基因及其编码的DesA1蛋白结构和功能。方法 自NCBI网站获取Rv0824c基因及DesA1蛋白的基本信息;使用Protparam、ProtScale和ProtCompB预测DesA1蛋白的理化性质、亲疏水性和亚细胞定位;使用SignalP Server v.4.0、TMHMM Server v.2.0、NetNGlyc 1.0 server和NetPhos Server v.3.1预测DesA1蛋白的信号肽、跨膜结构、糖基化及磷酸化位点;使用SOPMA和SWISS MODEL预测DesA1蛋白的二级结构并构建该蛋白的三级结构模型;使用ABCpred和SYFPEITHI预测DesA1蛋白的抗原表位;使用MEGA软件构建系统发育树;使用STRING数据库预测DesA1的相互作用蛋白及相关功能。结果 Rv0824c基因全长1 017 bp,编码的DesA1蛋白氨基酸数为338,分子式为C₁₇₂₃H₂₆₉₄N₄₉₀O₅₀₃S₁₄     

结核分枝杆菌Rv2660c蛋白原核重组表达及其免疫活性研究

目的利用原核表达系统表达、纯化结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2660c,评价其在血清学方面用于结核病诊断的价值。方法合成Rv2660c全基因核酸序列,构建pET28a-Rv2660c融合表达载体,在原核系统内进行重组表达,亲和层析纯化重组Rv2660c蛋白,采用Western-Blot、ELISA实验分析重组蛋白的免疫反应。结果pET28a-Rv2660c在大肠杆菌内成功表达重组Rv2660c蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白分子量为10.2 KD,与预期一致,Western-Blot结果表明重组蛋白Rv2660c只能与活动性结核患者血清反应,出现一条杂交条带;ELISA结果发现重组Rv2660c蛋白与结核患者血清能产生较强的反应,结核病菌阳患者组、菌阴患者组、潜伏感染组以及健康对照组A450平均值分别为0.52、0.48、0.28和0.25。结论重组结核分枝杆菌Rv2660c蛋白具有一定的免疫原性,对活动性结核病的诊断具有一定的价值,但对结核分枝杆菌潜伏感染的诊断没有价值。     

结核分枝杆菌潜伏相关蛋白Rv2204c的生物信息学分析

目的 应用生物信息学方法分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)潜伏相关蛋白Rv2204c的结构及功能。方法 从NCBI数据库中搜索Rv2204c蛋白的氨基酸序列,运用ProtParam, Signal 6.0 Server, ProtScale, TMHMM Server v.2.0,ProtCompB,NetNGlyc-1.0及NetPhos-3.1预测蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜螺旋区、亚细胞定位及糖基化和磷酸化位点;运用SOPMA、SWISS-MODEL预测蛋白的二、三级结构;运用IEDB预测蛋白的B细胞抗原表位;采用SYFPEITHI,RANKPEP,NetMHC和NetCTL预测其细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位;采用SYFPEITHI、RANKPEP预测其辅助性T(Th)淋巴细胞表位;利用MEGA构建Rv2204c蛋白进化树;运用STRING蛋白相互作用数据库预测Rv2204c相互作用蛋白。结果 Rv2204c蛋白氨基酸总数为118,为亲水性稳定蛋白;该蛋白无信号肽,无跨膜螺旋区;亚细胞定位主要为细胞质;无糖基化位点,含...     

结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c蛋白融合表达与血清学评价

目的 原核表达结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c融合蛋白并进行纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法评价重组蛋白在结核病血清学诊断中的价值。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,通过重叠PCR扩增得到Rv3425-Rv1168c全核酸序列克隆至表达载体pET-24b中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,通过ELISA检测100份确诊结核病人、20例非结核呼吸疾病患者、100份健康人血清,评价融合蛋白进行临床血清学诊断的可行性。结果 Rv3425-Rv1168c融合蛋白在原核系统内获得高表达,纯化的融合蛋白经ELISA方法测定,在血清学实验中敏感性为54%,特异性为95%。结论 Rv3425-Rv1168c融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病血清学诊断方面具有很大的应用价值。     

结核分枝杆菌Rv3621c原核表达及免疫功能研究

目的 以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)H37Rv基因组为模板,构建、纯化及鉴定原核表达质粒pPROEX-Rv3621c,通过人群、小鼠试验进行免疫原性评价。方法 构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并以全血干扰素释放分析技术(Whole-blood IFN-γ release assay,WBIA)检测其能否被安徽省淮南市M.tb感染者T细胞特异性识别。rRv3621c混合佐剂MTM[母牛分枝杆菌(M.vaccae),人工合成海藻糖-6'6,二分枝菌酸(TDB),单磷酰脂质A(MPLA)]免疫小鼠后,检测血清中特异性抗体分泌水平、脾细胞中抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平及肺脏细胞因子mRNA表达水平。结果 成功构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并使之诱导表达、纯化和鉴定。在rRv3621c蛋白诱导下,活动性结核(Active tuberculosis, ATB)患者外周血淋巴细胞释放的IFN-γ水平明显较高(t=4.813, P<0.01),且ATB患者产生的IFN-γ水平高于潜伏性结核(Latent tuberculosis infection, LTBI)人群(t=4.442, P<0.01)。BCG+Rv3621c/MTM组小鼠产生的特异性抗体滴度水平明显高于Rv3621c/MTM组(P<0.01)和BCG组(P<0.01),Rv3621c/MTM组和BCG+Rv3621c/MTM组小鼠的IgG2a/IgG1比值大于1,明显高于MTM组和BCG组。BCG+Rv3621c/MTM组小鼠均分泌高水平IFN-γ、TNF-α和IL-2。Rv3621c/MTM组小鼠肺脏组织中IFN-γ、TNF-α及iNOS表达水平较高。结论 M.tb感染者外周血T细胞可特异性识别rRv3621c蛋白,rRv3621c混合佐剂MTM可以诱导较强烈的抗原特异性Th1型免疫应答。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986的原核表达及检测牛结核病抗体之应用

目的 在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD2区域的NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白,并评价诊断牛结核病中的应用潜能。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR 扩增nrdF1,pe_pgrs35,rv1985c 和 rv1986基因,并将其克隆到表达载体中,重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,镍柱亲和纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting试验鉴定目的蛋白的表达及其反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法测定牛血清中特异性抗体,以之评价这些蛋白用于牛结核病抗体检测的价值。结果 成功表达了NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白,相对分子质量为42 ku、63 ku、46 ku和41 ku,对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白均能与抗HIS单抗发生特异反应,表现出良好的反应原性。通过间接ELISA方法检测牛血清中特异性抗体,阳性检出率分别为7.35%、22.06%、16.18% 和16.18%。结论 结核分枝杆菌原核表达的NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白具有用作牛结核病血清学诊断试剂的潜能。     

结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及酶学性质研究

目的获得具有生物学活性的结核分枝杆菌重组异柠檬酸裂解酶蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因ic l,克隆入原核表达载体pET-28 a(+)中,通过在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,获得以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白,并对其酶学性质进行测定分析。结果纯化出具有生物学活性的重组结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶。酶学性质测定分析表明,重组异柠檬酸裂解酶ICL的比活力为7.657×102μmol.mg-1.m in-1,反应最适pH值约为7.4。重组蛋白经高效液相色谱及质谱鉴定,测得相对分子质量为50 603.347。在5 mmol/L Tris-C l缓冲液、pH值7.8、25℃条件下,重组ICL的二级结构中相对有43.8%的α螺旋、31.9%的β折叠、3.4%β转角、20.9%无规则卷曲。结论本研究成功克隆表达结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因,酶学性质鉴定获得了具有生物学活性的重组蛋白,为该酶免疫学研究及新型抗结核药物的筛选奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表达、纯化与鉴定

目的 克隆结核分枝杆菌Rv3803c和Rv3846基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中进行表达和纯化。 方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增出Rv3803c和Rv3846基因片段,克隆至pGEX-6P-1表达载体中,测序正确后,在E.coli Rosetta中诱导表达,GST标签亲和层析法纯化蛋白,考马斯亮蓝染色及Western-blot分析鉴定。 结果 重组质粒pGEX-Rv3803c、pGEX-Rv3846测序表明核苷酸序列与设计完全一致。其在E.coli Rosetta中的存在形式均为可溶部分约50%、包涵体约50%,相对分子质量约为56 000和45 000, 纯化的GST-Rv3803c、GST-Rv3846样品纯度90%以上。完整的GST-Rv3803c的浓度大约为0.1 mg/ml,完整的GST-Rv3846的浓度大约为0.5 mg/ml。即相当于每升E.coli Rosetta培养物中,GST-Rv3803c产量为：0.25 mg/L、GST-Rv3846产量为1.25 mg/L。 结论 成功获得了纯化蛋白Rv3803c（MPT51）和Rv3846（SodA）,为进一步研究MPT 51和SodA蛋白的辅助诊断价值、构建保护性疫苗提供了实验依据。     

结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c基因的重组质粒构建及蛋白表达

目的应用生物信息学方法分析结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c所编码蛋白的结构特征,并对其进行克隆和表达。方法利用Bioedit、Dnaman及Pfam等对Rv1246c和Rv1247c所表达蛋白结构进行分析;以结核分枝杆菌H37Rv的基因组为模板,用PCR分别扩增Rv1246c和Rv1247c基因片段,并重组到原核表达载体pET32a( )中,转化E.coliBL21(DH3)菌株,用IPTG诱导蛋白表达。通过SDS-PAGE及Western-blot免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价。结果生物信息学分析表明它们与大肠杆菌的relBE家族有相似的蛋白模块,Rv1246c蛋白与大肠杆菌RelE同源性是21.55%,Rv1247c同源性是23.85%;两个重组质粒构建成功;通过SDS-PAGE检测分别在31kD和29kD处有特异性条带;Western-blot免疫印迹出现特异性阳性信号;间接ELISA检测多克隆抗体效价均大于1:40 000。结论本研究首次成功构建了结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了Rv1246c和Rv1247c蛋白,为进一步研究该组基因的分子功能奠定了良好基础。     

结核分枝杆菌Rv3134c蛋白抗原表位的预测

目的 预测结核分枝杆菌Rv3134c的抗原表位,了解其免疫学特性。方法 利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv3134c氨基酸序列进行分析,采用包括二级结构、亲水性、抗原性、表面可能性、柔韧性等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位,最后BLAST分析其与人类抗原表位的同源性。结果 Rv3134c蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,含有较多潜在的B细胞抗原表位,可能位于1-7、30-37、65-81、89-100、111-120、138-148、184-195、209-216、233-238位氨基酸残基或其附近,这些区域基本上含有β转角结构,亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高。该蛋白潜在的T细胞抗原表位较少,可能位于62-76、89-97、185-195、203-213、219-231、248-255位氨基酸残基或其附近。BLAST分析结果显示,其与人类抗原表位的同源性很低。结论 结核分枝杆菌Rv3134c是一个即含有较多B细胞抗原表位又含有较多T细胞抗原表位的蛋白抗原,实验结果为该蛋白抗原表位的进一步研究与合成肽疫苗奠定了基础。