人CD137分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人CD17分子的编码序列，将其重组人真核表达载体，并表达于COS－7细胞，方法：从活化的T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人CD137的编码序列，对其序列进行测定。将测定正确的CD137编码序列克隆入真核表达载体PCI－neo，构建重组表达载体。采用质体法转染COS－7细胞，用流式细胞仪检测CD137分子的表达。结果：PCR方法扩增出一800bp左右的基因片段，插入PCI－neo构建重组表达载体后，经序列测定证实扩增的片段为人CD137编码序列，将重组子转染COS－7细胞，流式细胞仪检测显示有27．11％的细胞表达人CD137分子。结论：成功地克隆并在COS－7细胞中表达了CD137分子。     

人低氧诱导因子-1α重组腺病毒的构建和鉴定

目的 利用AdMax腺病毒载体系统构建人重组低氧诱导因子-1α(rhHIF-1α)基因腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒. 方法 自先期构建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表达载体中用RT-PCR法扩增出rhHIF-1α基因片段,将其克隆入线性化的pEGFP1-C1质粒中,用PCR法扩增EGFP-rhHIF-1α基因片段,将其克隆入PUC18质粒中.酶切构建好的pUC18-rhHIF-1α载体并克隆进入穿梭质粒PDC316中,将构建好的穿梭质粒PDC316-rhHIF-1α载体和骨架病毒pBHGlox△1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒.重组的病毒转染SG-7901细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达. 结果 经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带重组人HIF-1α基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒. 结论 成功地构建了携带rhHIF-1α基因片段的重组腺病毒载体.     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

死亡素在大肠杆菌中的融合表达

目的:构建死亡素基因重组表达载体,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中诱导表达。方法:人工合成死亡素基因片段,克隆于质粒pUC18,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性菌落,提取重组质粒双酶切,电泳回收目的基因,与经相同酶切的pGEx-4T-l连接构建重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定,测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。结果:重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明目的基因正确插入。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示出现目的条带,与预期结果一致。结论:成功构建了死亡素基因的原核表达载体,并诱导表达出目的融合蛋白。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆和表达

目的　构建pMal N重组表达载体 ,转化E .coliDH5α ,诱导表达犬瘟热病毒 (CDV)重组核衣壳 (N)蛋白。方法　采用RT PCR技术 ,从CDVRNA中扩增编码N蛋白的基因片段 ,通过连接反应 ,构建重组克隆载体和重组表达载体 ,转化感受态。E .coliDH5α细胞。通过IPTG诱导表达CDV重组N蛋白。结果　扩增出约 1 7kbCDV全长的主要结构蛋白N蛋白基因 ,通过PCR获得 5 36bpN蛋白基因片段。将N蛋白基因片段克隆入原核表达载体pMal C2 ,表达产物麦芽糖结合蛋白 (MAP)与N蛋白的融合蛋白的相对分子质量约 6 0× 10 3,与预期大小一致。结论　构建的pMal N重组载体所表达的CDVN蛋白为进一步研究CDV的特异、敏感的抗体检测方法打下基础     

Hsv—tk、重组人TNF—α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的：构建pEGFP-TK-TNF-α表达载体，观察其在喉癌细胞Hep-2中的瞬时表达，方法：应用PCR方法对各自的进行扩增并经测序载体pGEM-T-Easy测序，利用逆转录病毒载体PLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK－rhTNF-α并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间成功构建表达载体pEGFP-TK-rhTNF-α，并在该载体转染人喉细胞Hep-2后观察融合蛋白表达情况，结果：酶切鉴定证实TK－rhTNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，并在转染人喉癌细胞Hep-2中观察到TK－rhTNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamH1位点间，并在转染人喉癌细胞Hep-2中观察到TK－rhTNF-α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-TK-rhTNF-α表达载体便于观察转染细胞中TK－rhTNF-α融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为自杀基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

多聚组氨酸标签的Attacin抗菌肽基因克隆及其在CHO细胞中稳定表达

目的 克隆家蝇幼虫抗菌肽Attacin-His_6融合基因,构建真核表达载体并转染CHO细胞表达,为深入研究其生物学活性创造条件.方法 以pUCm-T/Attacin载体为模板,用含6×His标签序列的下游引物克隆Attacin-His_6融合基因,并将其构建于pcDNA3.1( )中,pcDNA3.1/Attacin-His_6重组质粒转染CHO细胞,Zeocin G418筛选阳性细胞株,RT-PCR检测重组质粒在CHO细胞的转录情况.结果 成功扩增出Attacin-His_6融合基因,构建了pcDNA3.1/Attacin-His_6重组质粒并转染入CHO细胞中,RT-PCR从阳性克隆的CHO细胞中扩增出预期大小的目的 片段,从转录水平证实CHO-Attacin-His_6重组细胞株表达了Attacin-His_6基因.结论 抗菌肽Attacin基因哺乳动物型工程细胞表达系统的建立,为进一步制备其肽类抗生素奠定了基础.     

IN-1重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

目的：设计并人工合成IN-1重组单链抗体（recombinant IN-1 single-chain antibody）的cDNA克隆，构建其表达载体，在原核系统中实现初步表达。方法：根据gene bank中发表的IN-1抗体的轻链重链序列，重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段，该基因双链分35个小片段合成，经退火、复性连接成目的片段后，克隆到克隆载体pUC-18中，经全自动序列分析仪测序证实后，再亚克隆至表达载体pET-28a（ ），转化大肠杆菌BL21，诱导表达。结果：测序结果合成的基因序列与设计的仅差一个碱基；SDS-PAGE检测显示，表达出相对分子量31kd的融合蛋白。结论：IN-1重组单链抗体基因表达载体的构建和表达，为深入研究其生物活性奠定了基础。     

Abl-PTK酪氨酸激酶区基因的克隆与表达

目的 克隆、表达出PTK重组蛋白，以鉴定酪氨酸激酶（PTK）的活性，筛选酪氨酸激酶的抑制剂，方法 从PTK重组克隆载体上切下目的基因片段Abl-PTK使其连接到表达载体pGEX4T-2上，转化大肠杆菌DH5a，筛选鉴定出正确的转化子。转化菌株经IPTG诱导后进行表达并进行SDS－PAGE分析。结果 经酶切和诱导表达鉴定，重组质粒pGEX4T-2-PTK构建成功，并高效表达了58KD的GST－PTK融合蛋白。结论 PTK基因被成功地重组至融合蛋白表达载体中，并在大肠杆菌中获得高效表达。该研究为进一步纯化、鉴定PTK的活性，筛选PTK的抑制剂奠定了基础。     

人截断型LBP基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

目的 构建人N端截断型脂多糖结合蛋白（tLBP)基因的杆状病毒表达载体,为后续的蛋白表达及其抗内毒素保护作用研究奠定基础。方法 采用PCR技术从人全长LBP基因cDNA中扩增长度为695bp的基因片段,经pGEM-T载体亚克隆筛选和序列分析后,应用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统,基因重组和外源基因转座分别构建转移质粒pFASTBACtLBP和穿梭质粒pBac-midtLBP。结果 经PCR、琼脂糖凝胶电泳、酶切分析及序列测定,所克隆的基因片段为700bp左右的tLBP,并证实其目的基因重组载体发生了特异转座和病毒重组。结论 本实验成功克隆了tLBP目的基因片段并构建其杆状病毒表达载体。