融合蛋白TAP-SSL5对血小板与粒细胞结合的影响

目的探讨融合蛋白TAP-SSL5对血小板与粒细胞结合作用的影响。方法采用CCK-8试剂盒检测TAP-SSL5对细胞活力的影响;流式细胞仪检测THP-1细胞表面CD162(PSGL-1)的表达,及TAP-SSL5对小鼠抗人CD162单抗KPL-1与THP-1细胞结合的抑制作用。以20μmol/L ADP激活人血小板,采用流式细胞仪、瑞氏-姬姆萨染色检测血小板与THP-1细胞或人中性粒细胞的结合情况,并研究TAP-SSL5的干预作用。结果 TAP-SSL5浓度在30 mg/L或以下时对THP-1细胞或中性粒细胞的活力无明显影响。流式细胞仪检测显示,TAP-SSL5(终浓度10 mg/L)能显著抑制KPL-1与THP-1细胞的结合;20μmol/L ADP激活的血小板与THP-1细胞或中性粒细胞的结合率分别为(31.3±8.4)%和(35.6±5.9)%;细胞经10 mg/L TAP-SSL5预先处理后,其结合率分别降至(13.4±6.7)%和(10.4±6.4)%(P<0.01)。瑞氏-姬姆萨染色的结果表明,TAP-SSL5和SSL5均可抑制激活的血小板与中性粒细胞的结合(P<0.05)。结论 TAP-SSL5可通过与PSGL-1的结合,而直接抑制激活的血小板与粒细胞的结合。     

Effect of TAP-SSL5 fusion protein on human platelet functions in vitro and in vivo

目的 探讨抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响.方法 采用健康人富含血小板血浆以凝胶过滤法分离得到人血小板.流式细胞仪检测融合蛋白TAP-SSL5或小鼠抗人CD42b( glycoprotein Ibα,GPIbα)单克隆抗体( HIP1)与血小板的结合情况；以人血小板表面P-选择素的表达及PAC-1的结合反映血小板的激活程度；以全血电阻法定量分析TAP-SSL5对人血小板聚集功能的影响；为评价TAP-SSL5的出血风险,进一步观察了TAP-SSL5对小鼠尾部出血时间的影响.结果 融合蛋白TAP-SSL5可与血小板结合,并竞争性抑制HIP1与血小板的结合,提示TAP-SSL5可与血小板表面的GPIbα结合,进而抑制GPIbα与vWF的相互作用.但高浓度的TAP-SSL5(终浓度30m g/L)也能激活血小板,使人血小板表面P-选择素的表达增加(表达阳性率为90.4％)和PAC-1的结合量上升(阳性率为66.3％)；终浓度为10、30 mg/L的TAP-SSL5可引起血小板的显著聚集.给小鼠单次尾静脉注射10mg/kg的TAP-SSL5,可显著延长尾部出血时间,由对照组的(647.1±33.7)s延长至(753.6±127.3)s(P ＜0.01)；而常规剂量组(3 mg/kg TAP-SSL5)尾部出血时间为(612.8±79.1)s,与对照组相比无显著差异(P＞0.05).结论 融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5与血小板GPIbα结合的功能,有助于进一步提高TAP-SSL5的抗血栓作用,但同时也导致融合蛋白TAP-SSL5在高浓度情况下可延长出血时间和激活血小板.     

融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响

目的探讨抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响。方法采用健康人富含血小板血浆以凝胶过滤法分离得到人血小板。流式细胞仪检测融合蛋白TAP-SSL5或小鼠抗人CD42b(glycoprotein Ibα,GPIbα)单克隆抗体(HIP1)与血小板的结合情况;以人血小板表面P-选择素的表达及PAC-1的结合反映血小板的激活程度;以全血电阻法定量分析TAP-SSL5对人血小板聚集功能的影响;为评价TAP-SSL5的出血风险,进一步观察了TAP-SSL5对小鼠尾部出血时间的影响。结果融合蛋白TAP-SSL5可与血小板结合,并竞争性抑制HIP1与血小板的结合,提示TAP-SSL5可与血小板表面的GPIbα结合,进而抑制GPIbα与vWF的相互作用。但高浓度的TAP-SSL5(终浓度30 mg/L)也能激活血小板,使人血小板表面P-选择素的表达增加(表达阳性率为90.4%)和PAC-1的结合量上升(阳性率为66.3%);终浓度为10、30 mg/L的TAP-SSL5可引起血小板的显著聚集。给小鼠单次尾静脉注射10 mg/kg的TAP-SSL5,可显著延长尾部出血时间,由对照组的(647.1±33.7)s延长至(753.6±127.3)s(P<0.01);而常规剂量组(3 mg/kg TAP-SSL5)尾部出血时间为(612.8±79.1)s,与对照组相比无显著差异(P>0.05)。结论融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5与血小板GPIbα结合的功能,有助于进一步提高TAP-SSL5的抗血栓作用,但同时也导致融合蛋白TAP-SSL5在高浓度情况下可延长出血时间和激活血小板。     

产肠毒素D金黄色葡萄球菌的筛选及其基因克隆和蛋白表达

目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素D基因(entD),表达和纯化其重组蛋白(rSED),以进一步制备抗rSED抗体,研制SED金标免疫快速检测试纸条.方法 利用PCR技术,从野生型金黄色葡萄球菌中筛选产肠毒素D金黄色葡萄球菌标准株,扩增entD基因,克隆至pGEM-T Easy载体,亚克隆至原核表达载体pET28a,重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,免疫印迹检测抗原活性.结果 分离获得1株产肠毒素D金黄色葡葡球菌标准株,成功克隆entD序列,测序表明该基因共684 bp,与其他entD序列(GenBank登陆号:M28521)具有99%的同源性.rSED蛋白在大肠杆菌中得到高效的可溶性表达.免疫印迹结果 表明,rSED蛋白能被抗天然SED抗体识别.结论 通过基因重组技术制备的重组SED蛋白具有良好的免疫反应性.     

含RGDS的蜱抗凝血肽表达体系的构建

目的 人工合成含RGDS(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)重组蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide,TAP)基因,进行原核表达,获得融合蛋白,用表达的融合蛋白粗提取物进行凝血实验.方法 参照天然TAP的氨基酸序列.设计了含RGDS的编码63个氨基酸的213个碱基(含酶切位点所加的碱基),进行全基因合成后转导入大肠杆菌DH5α中.挑选阳性克隆,并进行诱导表达,检测产物的抗凝血性质.结果 PCR和核苷酸序列测定表明TAP-RGDS构建正确,在IPTG诱导下的表达产物有抗凝血活性.结论 构建了重组TAP-RGDS基因,该基凶能表达出有抗凝血活性的产物.     

小鼠Rnf141多克隆抗体的制备及鉴定

目的 获得小鼠Rnf141多克隆抗体,并对其功能进行初步研究.方法 利用多聚酶链反应(PCR)扩增获得鼠Rnf141基因并且与原核表达载体pGEX-5X-3(含GST标签)进行重组,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG在25 ℃条件下诱导,用SDS-PAGE检测,获得GST-Rnf141融合蛋白高效表达后,通过Glutathione Sephorase 4B纯化.纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot和免疫组织化学的方法检测抗体的特异性.结果 成功构建了重组质粒pGEX-Rnf141,该质粒能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白GST-Rnf141,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的46%,制备的多抗效价达1∶128000,它可以与GST-Rnf141重组蛋白和小鼠不同脏器组织Rnf141蛋白发生特异的抗原抗体反应,在脾脏和脑组织中Rnf141蛋白表达量较高.结论 成功制备小鼠Rnf141多克隆抗体,该抗体为研究Rnf141的表达与功能提供了有用的工具.     

含凝血因子FXa识别位点的融合表达体系的构建

目的 :研究含凝血因子FXa识别位点的基因与表达载体pGEX KG连接后在大肠杆菌中的表达。方法 :用PCR对人工合成的抗菌肽X基因的 5′端进行改造 ,引入FXa的酶切位点 ,用限制性内切酶作用后 ,连接到含Ptac启动子的表达载体pGEX KG中 ,转化大肠杆菌DH5α,用原位杂交法筛选到阳性克隆。转化大肠杆菌BL2 1,用异丙基硫代 β D半乳糖(IPTG)诱导。结果和结论 :抗菌肽X基因在大肠杆菌中获高效表达 ,表达量约占细胞总蛋白的 2 0 %。重组蛋白以可溶形式存在。融合蛋白经FXa切割后 ,产物有抗菌活性     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.     

PTD-Cyclin D1融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:通过PCR方法扩增出Cyclin D1基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD的下游构建重组质粒pET16b-PTD-CCND1,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:构建了重组融合表达质粒pET16b-PTD-CCND1,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr 38×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的22%,纯化后得到了目的蛋白.结论:成功地克隆了小鼠的Cyclin D1基因并纯化了融合基因PTD- CCND1的原核表达产物.     

金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5抑制人脐血源性内皮祖细胞黏附功能及其机制研究

目的 研究金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5 (staphylococcal superantigen-like protein-5,SSL5)与人脐血源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)表面P-选择素糖蛋白配体-1 (P-selectin glycoprotein liga...     

膜联蛋白A5 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人膜联蛋白A5 cDNA并在大肠杆菌系统内作表达.方法:利用RT-PCR技术从人胎盘组织的总RNA扩增膜联蛋白A5的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T,在tac 启动子控制下,IPTG诱导表达GST融合蛋白.以亲合层析法纯化表达的融合蛋白,用KPTT法验证抗凝血活性.结果:凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为978 bp,重组质粒测序结果表明,插入片段与人膜联蛋白A5的序列完全一致.在IPTG诱导下,K802重组菌高效表达出相对分子质量为58 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26%.纯化蛋白具有很强的抗凝血活性.结论:成功克隆人膜联蛋白A5基因并在大肠杆菌中高效表达.     

人乳头瘤病毒11型主要衣壳蛋白L1基因的克隆及序列分析

目的 从临床尖锐湿疣标本克隆人乳头瘤病毒（HPV）11型主要衣壳蛋白L1基因,进行序列测定及序列分析比较,以为研究该临床病毒株的免疫原性及流赞美同学奠定基础。方法 以临床尖锐湿疣标本总DNA为模板,用L1基因保守区简并引物以PCR方法分段扩增衣壳蛋白L1基因在部,重组入pGEM-3zf(-)质粒载体,以双脱氧法双向测定插入片段序列,拼接出L1基因序列,通过BLAST2.0与已报道序列进行比较。结果 从西安地区一尖锐湿疣临床标本克隆到的一株HPV11型L1蛋白编码序列与一文献报道大部分相同,但有些位点有点突变,结论 构建的pGEM-3zf(-)重组质粒为进一步通过杂交、体内分段表达等手段研究研究该株病毒L1蛋白的免疫学和流行病学性质创造了条件。     

重组Trx-ApoO融合蛋白的构建与表达

目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...     

显齿蛇葡萄查耳酮合成酶基因cDNA克隆及蛋白质序列分析

目的 对显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata查耳酮合成酶（CHS）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物基因的保守序列设计一对引物,以显齿蛇葡萄总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段1 173 bp的序列,序列分析表明,该片段编码390个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在67.9%以上。结论 首次从显齿蛇葡萄中克隆了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

Cloning of Integral Mature Peptide Gene of Human GDF-5

The integral mature peptide gene of human growth differentiation factor-5 (GDF-5) was出人物cloned to provide the essential foundation for study on the biological characteristics of GDF-5 at gene and protein levels. Two primers were chemosynthesized according to the hGDF-5 sequence reported in Genbank. The hGDF-5 gene was gained by RT-PCR methods from the total RNA extracted from human fetus cartilage tissue, and was cloned into vector pMD18-T. The sequence of recombinant plasmid pMD18-T-hGDF-5 was analyzed by sequence analysis. DNA agarose gel electrophoresis showed that the product of RT-PCR was about 380bp, and double enzyme digestion of the recombinant plasmid corresponded with it. The result of sequence assay was in agreement with the reported hGDF-5 sequence in Genbank. Our results showed that the integral mature peptide gene of human GDF-5 was cloned successfully from human fetal cartilage tissue, and totally identified with the seouence of human GDF-5 in Genhank.     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法　根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR　I、Not　I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果　ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论　在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

鼻咽癌动态和静态调强方式的剂量学比较

目的：探讨鼻咽癌动态调强方式（Sliding window）和静态调强方式（Step and shoot）2种调强方式的剂量学差异.方法：采用CADPLAN 6.4.7（helios） 治疗计划系统,对15例鼻咽癌需调强治疗的患者用Sliding window和Step and shoot 2种调强方式4种强度水平（Intensity Level）进行剂量学差异的比较.按强度水平分为SW、SSL10、SSL7、SSL5组.对4组的剂量学评估参数：PTV最大剂量（PTVDmax）、PTV平均剂量（PTVDmean）、PTV最小剂量（PTVDmin）、剂量体积直方图（DVH） 、适型指数（Conformity index,CI）、剂量不均匀性指数（Heterogeneity Index ,HI）、机器跳数（MU） 、子野数目（Segment）等数据进行评价.结果：（1）SW组PTV Dmax与SSL10、SSL7、SSL5组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）,而SSL10、SSL7、SSL5组比较差异无统计学意义（P＞0.05）,随着强度水平的降低,最大剂量增高;（2）SW组MU与 SSL10、SSL7、SSL5组比较差异有统计学意义（P＜0.01）,而SSL10、SSL7、SSL5组间差异无统计学意义（P＞0.05）;（3）各组间Segment差异均有统计学意义（P＜0.01）;（4）各组间CI比较差异均无统计学意义（P＞0.05）;（5）各组间HI比较差异均无统计学意义（P＞0.05）.结论：鼻咽癌不同调强方式和强度水平的治疗计划均能为临床提供较满意的剂量学分布,Sliding window方式略优于不同强度水平的Step and shoot方式,但MU和Segment较多.