编码磷酸转运受体的结核DNA疫苗的免应原性和保护效力

作者用分枝杆菌感染的Ｈ－２～ｂ单倍型小鼠生产的培养滤液抗原（Ａｇ）特异性单克隆抗体（ＭｃＡｂ）确定了结核杆菌基因组中编码３种推定的磷酸结合蛋白的３个基因。为了确定这些磷酸结合蛋白的潜在疫苗特性,作者将编码结核杆菌ＰｓｔＳ－１、ＰｓｔＳ－２或ＰｓｔＳ－３蛋白的ＤＮＡ转化到大肠杆菌制成质粒ＤＮＡ疫苗,同时还构建了一个编码结核杆菌Ａｇ８５Ａ的质粒ＤＮＡ作为阳性对照,用空载体作阴性对照。分别用上述质粒ＤＮＡ肌肉接种６～８周龄的Ｃ５７ＢＬ／６雌性小鼠３次,每次间隔３周。分别测定抗体及Ｔｈ１型细胞因子白细胞…     

疫苗及其转染能力

病毒疫苗及重组ＤＮＡ疫苗可能含有残余的细胞ＤＮＡ,外源ＤＮＡ可被哺乳动物细胞吸收和表达。疫苗中残余细胞ＤＮＡ的转染能力决定了疫苗的安全性,因此,这种转染能否引起宿主基因损伤或缺失,能否激活致癌基因是人们普遍关心的问题。 作者用含编码氯霉毒乙酸转移酶（ＣＡＴ）的表达载体 ＰＣＡＴ３（ＰＤＮＡ） ３０μｇ／０．５ｍｌ,以磷酸钙和ＤＥＡＥ－葡聚糖法转染到人纤维肉瘤细胞ＳＷ６８４,ＣＡＴ表达量分别是３３３６．６和６４６．１ｐｇ／ｍｌ。同时选用９批疫苗,各加入 ３０μｇ ｐＣＡＴ３ ＤＮＡ,接种到ＳＷ６８４细胞…     

鼠肺组织直接用于汉坦病毒S基因序列分析

目的：应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、核苷酸序列分析等技术，尝试建立一种可直接从鼠肺标本中进行汉坦病毒基因分析的方法。方法：提取经免疫荧光法检测汉坦病毒抗原阳性的鼠肺细胞总RNA，经逆转录获取病毒cDNA．纯化，克隆于pMD-18T载体，测定S基因片段核苷酸序列。结果：采用RT—PCRT／A克隆技术成功地从鼠肺组织中扩增出汉坦病毒S基因全序列，序列长为1701nt。只有一个编码N蛋白的开放读码框架（ORF），起始密码子为第37nt，终止于1326nt，推导其编码的蛋白长为429个氨基酸。与该标本分离株（简称TJJ16毒株）S基因的全序列相一致。结论：该方法可对汉坦病毒抗原检测阳性而病毒分离阴性的鼠肺标本进行分子生物学特征性分析，从而建立一种对汉坦病毒在宿主间的流行情况分析的方法。     

编码线粒体特长脂酰辅酶A脱氢酶牛心同功酶cDNA的分子克隆(英文)

目的：分子克隆编码牛心线粒体特长脂酰辅酶Ａ脱氢酶的ｃＤＮＡ基因．方法：基因的分离是采用抗体筛选技术并采用已知的氨基末端和肽链内部的氨基酸序列等多种方法核对其可靠性．结果：所获ｃＤＮＡ片段对应于ＲＮＡ印迹法所示的约２４ｋｂ的ｍＲＮＡ片段，可翻译为６５５个氨基酸分子序列（７０５ｋＤａ）．比较脂酰辅酶Ａ脱氢酶家族的肽链序列显示主要不同在于它们的信号肽与其它脂酰辅酶Ａ脱氢酶比较，其催化部位高度保守．在羧基末端，存在一个和“亮氨基拉锁”特征序列类似的结构（亮５６８到亮５８９），为该蛋白四级结构的形成提供了一个潜在机制．结论：我们分离的ｃＤＮＡ克隆编码牛心线粒体内膜特长脂酰辅酶Ａ脱氢酶的同功酶．     

抗心磷脂抗体、蛋白C、蛋白S与缺血性脑血管病关系的研究

目的：探讨抗心磷脂抗体（ａＣＬ）、蛋白Ｃ（ＰＣ）、蛋白Ｓ（ＰＳ）与缺血性脑血管病（ＩＣＶＤ）的关系。方法：检测２６６例ＩＣＶＤ患者血清ａＣＬ,９４例的血浆蛋白Ｃ：抗原（ＰＣ：Ａｇ）、总蛋白Ｓ（ＴＰＳ）和游离蛋白Ｓ（ＦＰＳ）,同时测定１９例ＩＣＶＤ患者蛋白Ｃ：活笥（ＰＣ：ＡＣ）。结果：ＩＣＶＤ患者ａＣＬ阳性率高于对照组（Ｐ〈０．０１）,且ＩｇＧ型ａＣＬ比ＩｇＭ型ａＣＬ阳性率升高（Ｐ〈０．０１）。ａＣ     

高糖对体外培养的人脐静脉内皮细胞中c-fos的影响研究

目的观察高糖作用人脐静脉内皮细胞时c—fos基因mRNA和蛋白的表达的变化。方法提取并体外培养人脐静脉内皮细胞,分别加入不同浓度葡萄糖（5．5mmol/L、11mmol/L、22mmol/L、44mmol/L）并分别作用不同时间,应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测c—fos基因mRNA的表达,免疫细胞化学检测c—fos蛋白表达。结果经高糖处理的人脐静脉内皮细胞中,c—fos基因mRNA的转录水平明显高于对照组（P〈0．05或P〈0．01）。但是脐静脉内皮细胞经22mmol/L葡萄糖作用1h,c—fos基因的mRNA水平不再升高,而呈下降趋势（P〈0．05）。经22mmol/L葡萄糖作用2h后,c—fns蛋白表达达到最高峰。结论高糖能引起脐静脉内皮细胞c—fosmRNA和蛋白表达增高。     

不同血型成年人胰腺在ICA检测中的应用研究

采用免疫酶标ＡＢＣ法检测糖尿病（ＤＭ）患者的胰岛细胞抗体（ＩＣＡ）在国内外糖尿病诊疗中已得到公认，由于其既能定性又可定量地进行检测，对糖尿病预报、分型、预后以及胰岛移植适宜时机的选择等具有重要的临床指导意义。目前ＩＣＡ检测均以Ｏ型血成人胰腺组织为抗原底物，本文采用Ｏ型、Ａ型、Ｂ型３种血型的成人胰腺组织进行ＩＣＡ以及阳性标本的定量、定性检测，现报道如下。资料与方法　５８例糖尿病患者为我院住院及门诊患者，其中男２７例，女３１例，年龄６～５６岁，以中年患者居多。正常对照组的１０例为体检健康人，无任何免…     

DNA疫苗与脂质体

ＤＮＡ疫苗（ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ）亦称是基因疫苗、核酸疫苗,是携带编码外源抗原的真核细胞重组表达质粒即质粒ＤＮＡ,用其接种动物能在宿主细胞表达外源抗原,可引起免疫反应（包括体液免疫和细胞免疫）而提供保护作用,是继灭活疫茵、减毒活疫苗、重组多肽亚单位疫苗之后的新一代疫苗。其化学结构为双链环状ＤＮＡ,与传统疫苗相比,ＤＮＡ疫苗具有生产简单、价格低廉、低毒、能以天然形式的抗原提供给免疫系统、免疫应答全面（包括细胞免疫和体液免疫）、操作性强等优点。它为疫苗的研制提供了一种新的方法,受到广泛的重视,ＨＩ…     

细胞间粘附分子-1与肝癌诊断及预后

细胞间粘附分子 -１（ＩＣＡＭ -１）是由１９号染色体基因组编码的一种单链跨膜糖蛋白 ,属粘附分子免疫球蛋白超家族（ＩｇＳＦ）成员之一 ,由５个Ｉｇ样功能区组成 ,其分子量为８０～１１０ＫＤ，可随分布细胞种类的不同而有差异 ,这种差异主要是因为该分子的糖基化程度不同所致。ＩＣＡＭ -１分布于多种细胞表面 ,即组织中细胞膜表面ＩＣＡＭ -１ ,炎性细胞因子如ＩＬ -１、ＩＦＮ -ｒ、ＴＮＦ -α等可调节其表达。近年来发现正常人血清中存在循环ＩＣＡＭ -１（ｃＩＣＡＭ -１） ,有肿瘤细胞株培养上清液中的ＩＣＡＭ -１又称为可溶性Ｉ…     

小鼠用重组鼠疫杆菌V抗原自动免疫可预防鼠疫

作者用聚合酶链反应扩增鼠疫杆菌GB株染色体DNA中编码V抗原的基因（IcrV）,然后克隆到质粒pGEX-5X-2中编码谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因的下游,构建成重组质粒pVG100,再用电穿孔法转化至大肠杆菌JM109中。 转化的JM109/pVG100表达的V抗原与GST形成稳定的融合蛋白。从重组大肠杆菌分离GST-V融合蛋白,用Xa因子裂解,     

肿瘤抗原基因MAGE-A9的克隆及原核表达

目的扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A9cDNA,构建原核表达载体,表达并纯化MAGE-A9蛋白。方法从人肝癌组织提取总RNA,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出MAGE-A9 cDNA,插入载体pMD18-T中,测序正确后,构建重组表达载体pBAD/gⅢ-MAGE-A9,转化大肠杆菌TOP10株。以L-Arabi-nose进行诱导表达,并纯化。结果获得MAGE-A9cDNA,测序结果与GenBank一致。成功构建表达载体,表达可溶重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其相对分子质量为35 000。结论成功地构建了pBAD/gⅢ-MAGE-A9原核表达质粒,获得了MAGE-A9蛋白,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

重组hPPAR-α受体表达质粒的构建

目的构建人PPAR-α受体的重组表达质粒。方法从基因库获取人PPAR-α基因蛋白编码区全长序列,依照引物设计原则及编码序列上已有酶切位点设计引物并添加酶切位点。从正常肝组织细胞提取总RNA,逆转录得cDNA,PCR扩增目的片段,克隆到pcDNA3.1真核表达载体,测序鉴定重组质粒目的基因蛋白编码区全长序列及开放阅读框的正确性,命名为pcDNA-hPPAR-α。结果核酸测序结果表明所得pcDNA-hPPAR-α的蛋白编码全长序列与基因库一致,正向插入载体pcDNA3.1多克隆位点NheⅠ和KpnⅠ之间,开放阅读框正确。结论成功构建重组质粒pcDNA-hPPAR-α。     

SH2域、SHP2 cDNA的克隆鉴定和在大肠杆菌中的表达及其与CagA的相互作用

目的 研究SH2（Sre同源体2）域和SHP2（含2个SH2域的蛋白酪氨酸磷酸酶）蛋白的基因克隆和表达。方法 根据GeneBank中SH2和SHP2的基因序列设计引物,以PCR法扩增出SH2和SHP2基因,将其插入pQBO质粒中,转化进E．coli感受态细胞中,筛选阳性克隆并研究其表达。结果 所克隆的目的基因片断经PCR法鉴定和序列分析证明正确。结论 已成功地扩增SH2和SHP2基因并克隆到pQE30载体上,转化大肠杆菌菌株有表达,并探讨其与CagA（细胞毒性关联的基因A抗原）的相互作用及导致胃细胞癌变的原因。     

SLPI基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒。将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体pcDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达。结果核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白。结论成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒。     

人真核表达慢病毒质粒载体plenti6/V5-D-TOPO(R)-T13RⅡ Dnglytk的构建及意义

目的:构建含有T13R Ⅱ DNglytk的慢病毒质粒载体plenti6/V5-D-TOPO(R)-TβR Ⅱ DNglytk,用含有TβR ⅡDNglytk质粒的慢病毒感染T淋巴细胞使其对转化生长因子-β(TGF-β)失敏感.恢复其对肿瘤的杀伤活性.方法:以原始质粒为模板,PCR扩增TβRⅡ DN和HSV-tk基因,运用重组PCR方法将2个基因连接起来,获得TβR Ⅱ DNglytk融合基因,再以此基因为模板,PCR扩增获得其对照基因TRANSglytk.应用Invitrogen公司提供的系统,通过TOPO技术将2个融合基因分别连接到慢病毒表达质粒,并经过测序验证.结果:完成慢病毒表达质粒载体TβR Ⅱ DNglytk的构建,经测序验证序列正确,可以用于相应慢病毒的生产.结论:运用重组PCR技术和TOPO技术成功构建了plenti6/V5-D-TOPO(R)-T13RⅡDNglytI[载体,为产生对TGF-β不敏感的人肿瘤特异性淋巴细胞,并用于肿瘤的免疫治疗提供了基础.     

人肥大细胞羧肽酶分泌型真核表达载体的构建

目的:构建人肥大细胞羧肽酶(hMC-CP)分泌型真核表达载体pcDNA3.1/CP.方法:用免疫球蛋白k链的信号肽序列置换hMC-CP自身的信号肽序列,设计并合成引物,以hMC-CP基因为模板,扩增带有分泌信号肽的hMC-CP基因,DNA测序鉴定正确后,将PCR扩增产物定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1,通过酶切和DNA测序进行鉴定.结果:琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增出一条特异条带,酶切鉴定和序列测定结果表明大小为1269bp的DNA片段插入表达载体.结论:成功构建了hMC-CP分泌型真核表达载体,为进一步制备真核表达的重组hMC-CP奠定了基础.     

Persephin基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :获取Persephin(PSP)基因并实现其高效表达。 方法 :利用PCR方法以染色体DNA为模板 ,扩增编码人PSP成熟蛋白的基因片段 ,将其克隆于 pUC19质粒 ,进行序列分析 ,将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisA并进行表达。结果 :序列分析结果与文献报道一致 ,表达的hPSP占菌体总蛋白质 15 %左右。结论 :人PSP基因在大肠杆菌Top10中获得了高效、稳定表达 ,为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础。     

波形蛋白基因的构建、表达及鉴定

文章进行波形蛋白(VIM)基因重组质粒的构建,并进行表达与鉴定,为开辟新的肝癌诊断方法奠定基础。从人宫颈癌细胞(HELA)中提取总RNA并采用PR-PCR及PCR技术克隆VIM基因,经酶切连接等构建带有GST标签的PGEX-4T-1-VIM重组表达质粒,在大肠杆菌DH5α菌中扩增重组质粒,并在BL21菌中进行诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blotting等进行鉴定。重组及表达蛋白Vimentin的融合蛋白,为建立一种新的肝癌早期诊断方法奠定基础。     

甘草鲨烯合成酶基因的分离及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术从乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)中克隆甘草鲨烯合成酶(Squalene Syn-thase,SS)基因,并通过酶切连接的方法构建相关植物表达载体。结果表明,两个SS基因编码区长分别为1242bp、1239bp,分别编码412、413个氨基酸残基的多肽,与Hayashi等报道的光果甘草两个SS基因(GgSQS1和GgSQS2)同源性高达98%,分别命名为GuSQS1和GuSQS2(GenBank登录号分别为:AM182329,AM182330);植物表达载体构建的鉴定结果表明,已将GuSQS1和GuSQS2序列分别正向插入到双T-DNA表达载体中的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,重组质粒分别命名为130/35S-GuSQS1和130/35S-GuSQS2,为今后的次生代谢基因工程研究奠定基础。     

具有自激活切割活性肠激酶轻链基因设计、表达及活性研究

目的获得Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列+牛EKL的cDNA序列,实现EKL基因在大肠杆菌中的融合表达和自切割。方法用Trizol法从牛十二指肠组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增其cDNA片段,将此片段克隆于表达载体pGEX-2T,并在其前引入肠激酶(EK)识别序列。结果所表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为61 000,经GST-Sepharose亲和色谱柱纯化后得到单一蛋白,SDS-PAGE显示单一条带,用微量EK引发自切割,切断GST标签蛋白和Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,采用对氨基苯甲脒-Sepharose亲和色谱获得了轻链EK的单体。结论成功地克隆、表达了牛EK轻链基因,采用自激活、切割获得了EK单体,每1 L培养基获得EK5 mg,为进一步进行重组牛EK活性的研究及应用奠定了基础。